張 穎,白 力,尹學(xué)紅,王永福
(包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,內(nèi)蒙古 包頭014010)
中度系統(tǒng)性紅斑狼瘡與自身抗體的相關(guān)性研究*
張 穎,白 力,尹學(xué)紅,王永福
(包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,內(nèi)蒙古 包頭014010)
目的:研究亞型干擾素-α(interferon-α,IFN-α)2b自身抗體在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者(systemic lupus erythematosus,SLE)患者血清的表達以及疾病的相關(guān)性。方法:采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測SLE患者、健康體檢者血清內(nèi)抗IFN-α 2b抗體的水平,并分析在SLE患者中上述抗體與臨床指標(biāo)和實驗室檢查的相關(guān)性。結(jié)果:中度SLE患者的血清抗IFN-α2b抗體高于健康體檢組(P<0.01)。SLE患者的血清抗IFN-α 2b抗體與患者臨床指標(biāo)和實驗室檢查具有相關(guān)性。結(jié)論:與健康對照組相比在中度SLE患者血清中抗IFN-α 2b抗體升高,提示抗IFN-α 2b抗體可能參與SLE的發(fā)生。
系統(tǒng)性紅斑狼瘡;抗IFN-α 2b抗體;自身免疫性疾病;自身抗體;免疫性炎癥
抗細胞因子抗體在自身免疫性疾病的發(fā)病機制中起到了很重要的作用,在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者(systemic lupus erythematosus,SLE)的患者中也發(fā)現(xiàn)了抗細胞因子的自身抗體的存在,而且細胞因子的自身抗體水平和臨床表現(xiàn)以及實驗室指標(biāo)都具有明確相關(guān)性。但是有趣的是在正常人個體中也存在著細胞因子的自身抗體,自身抗體的穩(wěn)態(tài)似乎調(diào)節(jié)著免疫反應(yīng)的過程。SLE是由自身免疫介導(dǎo)的,以免疫性炎癥為突出表現(xiàn)的彌漫性結(jié)締組織病。血清中出現(xiàn)以抗核抗體為代表的多種自身抗體和多系統(tǒng)受累是SLE的兩個主要臨床特征。通常用SLE疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI)積分的多少作為判斷SLE病情輕重程度的評估。SLEDAI積分小于10分為輕型SLE,SLEDAI積分在10到14分之間為中度活動型狼瘡,SLEDAI積分大于等于15分為重型SLE。本次的實驗主要著手于系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和健康對照組血清內(nèi)抗IFN-α 2b抗體的檢測,并且評估這種自身抗體是否與患者的臨床表現(xiàn)及實驗室特征是否相關(guān),從而探討抗IFN-α 2b抗體與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病進程的關(guān)系,進而更加全面的了解系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的發(fā)病機制。
1.1 材料
1.1.1 SLE患者與健康個體的血清樣本采集及保存
SLE血液采自2006年6月至2012年12月包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院的114例確診SLE患者,均為初診、未接受糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑治療、病情處活動期患者,收集血清并記錄臨床癥狀及指標(biāo)。病人的血清被存放在-80℃冰箱內(nèi)。所有患者均符合2002年關(guān)于SLE修訂的歐洲分類標(biāo)準(zhǔn)。健康個體血液采自285名包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院門診健康體檢者,并排除了血常規(guī)、肝功、腎功、血糖異常者。采集入選SLE病人外周靜脈血5 mL,3 000轉(zhuǎn)/min離心分離血清,編制號碼存入血清庫,-80℃冰箱保存進行抗IFN-α 2b抗體檢測。
1.1.2 主要儀器見表1。
表1 主要儀器及生產(chǎn)廠家
1.1.3 主要藥品及試劑見表2。
表2 主要藥品試劑及生產(chǎn)廠家
1.2 方法
1.2.1 包被 用0.1 mol/L pH8.6碳酸氫鈉包被緩沖液將人類重組IFN-α 2b稀釋至1 μg/mL,在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加100 μL,4℃過夜。次日,棄去孔內(nèi)溶液,用5‰磷酸緩沖鹽吐溫溶液(phosphate buffer saline with Tween-20,PBST)洗滌緩沖液洗3次,每次3 min。
1.2.2 封閉 每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加入封閉液(5 g/L的PBST+50 g/L脫脂奶粉)300 μL,37℃封閉2 h。
1.2.3 加一抗 棄去孔內(nèi)溶液,加用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)以1:500稀釋SLE病人和健康體檢者血清100 μL,室溫孵育2 h。用5‰PBST洗滌緩沖液洗6次,每次3 min。
1.2.4 加二抗 棄去孔內(nèi)溶液,加用PBS以0.5 μg/mL稀釋的辣根過氧化物(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗人抗體(二抗)100 μL,室溫孵育1 h。用5‰PBST洗滌緩沖液洗8次,每次3 min。
1.2.5 加入2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽 室溫避光孵育30 min,后讀取405 nm的吸光度(A405)值。
1.3 實驗室指標(biāo)的測定 抗IFN-α 2b抗體采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測,補體C3、C4、免疫球蛋白(IgG/IgA/IgM)、C反應(yīng)蛋白(C-reactionprotein,CRP)均采用免疫散射濁度法檢測,紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)采用魏氏法檢測。
1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。Cutoff值的計算用敏感性與特異性之和最高值對應(yīng)的405 nm處的吸光度值。正態(tài)分布的計量資料以表示,組間比較采用t檢驗,非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示,組間比較采用U檢驗,計數(shù)資料用例數(shù)(率或構(gòu)成比)表示,組間率的比較采用χ2檢驗,兩變量之間相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析P<0.05(均為雙側(cè)檢驗)表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 SLE患者數(shù)據(jù)統(tǒng)計 入選的SLE患者共114病程人,女106人、男8人,SLE中度患者30人,女29人、男1人,平均年齡(39.63±11.15)歲,平均病程(4.13± 4.99)年,CRP(17.70±35.76)mg/dL,尿蛋白定量(0.96 ±1.12)g,ESR(43.50±39.14)mm/h,IgG(14.87± 8.14)mg/mL。
2.2 各組血清抗IFN-α 2b抗體水平 SLE患者輕度、中度、重度組和健康對照組血清抗IFN-α 2b抗體水平分別為(0.875 0±0.433 5),(0.941 9±0.439 1),(0.814 4±0.383 8),(0.745 3±0.332 4),其中中度組高于健康對照組,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。具體結(jié)果見圖1。
2.3 抗IFN-α 2b抗體陽性組和陰性組的對比 抗IFN -α 2b抗體陽性和陰性 SLE患者在年齡、病程、IgA、IgM、CRP等指標(biāo)上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但在IgG、ESR、血管炎上差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表3。
表3 抗IFN-α 2b抗體陽性組和陰性組在臨床表現(xiàn)和實驗室檢測中的對比
2.4 相關(guān)性分析 在進行相關(guān)性比較分析后發(fā)現(xiàn),中度SLE患者抗IFN-α 2b抗體與尿蛋白定量呈負相關(guān),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(r=-0.585,P<0.05)。結(jié)果見表4。
人們早在幾十年前就發(fā)現(xiàn)機體能夠產(chǎn)生抗細胞因子的抗體,并且這些抗體在正常人、自身免疫性疾病患者、感染性疾病患者、腫瘤患者等體內(nèi)都被發(fā)現(xiàn)過。由于輔助性T細胞是高親和力IgG抗體產(chǎn)生所必需對的,因此T細胞對細胞因子耐受的消失可能與自身抗體的產(chǎn)生有關(guān)。慢性或反復(fù)的感染,或者是T細胞但對天然細胞因子上表位的耐受性的永久性消失,或許可以解釋這些自身抗體的持續(xù)產(chǎn)生。
表4 血清抗IFN-α 2b抗體與中度SLE患者臨床及實驗室指標(biāo)的相關(guān)性分析
雖然證明了機體可以產(chǎn)生這些高親和力的抗體,但是這些抗體的生理學(xué)和臨床機制仍然不是很清楚。自身抗體在體外均可特異性地中和相應(yīng)的重組和天然的細胞因子,而抗IFN-α自身抗體可在體內(nèi)中和IFN-α。研究發(fā)現(xiàn),自身免疫性疾病病人體內(nèi)可以產(chǎn)生多種抗細胞因子的自身抗體。當(dāng)首次在SLE患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)抗IFN-α的自身抗體之后,人們又陸續(xù)在RA、SLE、SSc、混合性結(jié)締組織病等患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了自身抗體[1]。這些自身免疫性疾病中抗細胞因子抗體多為IgG和IgM型。在不同類型的自身免疫性疾病中,同種的自身抗體的滴度變化較大。
細胞因子自身抗體可能通過一定的反饋機制參與到了免疫反應(yīng)的調(diào)控的過程當(dāng)中,自身抗體在早期會隨著細胞因子的升高而升高,但是當(dāng)細胞因子自身抗體超過某個閾值后,就會在某一個水平持續(xù)一段時間并最終開始回落[1]。這一特殊的現(xiàn)象存在于很多自身免疫性疾病中,因此,很多自身免疫性疾病中,抗細胞因子抗體可以被當(dāng)做一種很好的生物標(biāo)記物,用于檢測患者的疾病活動度[2-4]。
在我們的研究中發(fā)現(xiàn),中度SLE患者組與健康對照組相比,抗IFN-α 2b自身抗體顯著升高,尤其是中度SLE組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這表明在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi),抗IFN-α 2b自身抗體可能在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病過程中起到了一定的作用。為了進一步確定抗IFN-α 2b抗體在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的作用,我們用cutoff值將SLE病人分成自身抗體陽性和自身抗體陰性兩組,分別研究了這兩組病人抗細胞因子抗體與臨床表現(xiàn)和實驗室特征之間的關(guān)系。統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)中度SLE患者組中IgG、ESR、血管炎上抗IFN-α 2b陰性和陽性個體是有顯著的差異,并有統(tǒng)計學(xué)意義,并且在隨后的相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn),抗IFN-α 2b抗體與SLE患者的IgG和ESR也是具有相關(guān)性,且具有統(tǒng)計學(xué)意義。血管生成因子可刺激血管內(nèi)皮細胞放電或分泌血管生長因子如血管內(nèi)皮生長因子,引起血管內(nèi)皮的炎性病變。在SLE患者中血管生成因子高度表達,并且和IgG、ESR成正相關(guān),這些與我們的研究結(jié)果是一致的[5]。
以上結(jié)果提示我們IFN-α 2b的自身抗體,在SLE中有一定的特異性,可作為臨床上診斷SLE的一個新的實驗指標(biāo),并且與疾病活動及病情嚴重程度相關(guān),可能有助于提高SLE的診斷率所以,深入研究抗IFN-α 2b的自身抗體將有助于我們深入探索SLE的發(fā)病機制及拓展SLE診斷和治療的新領(lǐng)域。
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Study on correlation between moderate systemic lupus erythematosus and autoantibodies
ZHANG Ying,BAI Li,YIN Xuehong,WANG Yongfu
(First Affiliated Hospital of Baotou Medical College,Baotou014010,China)
Objective:To study the serum expression of interferon-α(IFN-α)2b autoantibody in the patients with systemic lupus erythematosus(SLE)and its correlation with the disease.Methods:Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)method was adopted to detect the serum levels of IFN-α 2b aotoantibody in SLE patients and the healthy controls.The correlation analysis was made between the antibody in SLE patients and the clinical indicators and laboratory examinations.Results:IFN-α 2b aotoantibody in moderate SLE patients is significantly higher than that in the healthy controls(P<0.01)and is related to clinical indicators and laboratory examinations.Conclusion:Serum expression of IFN-α 2b aotoantibody in moderate SLE patients increased compared with that in the healthy controls,suggesting that IFN-α 2b aotoantibody may be involved in the pathogenesis of SLE.
Systemic lupus erythematosus;IFN-α 2b aotoantibody;Autoimmune diseases;Autoantibodies;Immune inflammation
2015-10-15)
國家自然科學(xué)基金資助項目(81360464)
王永福