魚藤酮誘導(dǎo)帕金森病模型的制備方法及其機(jī)制研究進(jìn)展

萬 葉，郭春燕，李永民

（河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北張家口 075000）

帕金森病（Parkinson disease，PD）是僅次于阿爾茨海默病的第二大類神經(jīng)退行性疾病，其病變特征為黑質(zhì)紋狀體多巴胺（dopamine，DA）神經(jīng)元缺失，出現(xiàn)路易士小體?；颊吲R床表現(xiàn)為精神癥狀、自主神經(jīng)活動受阻和靜止性震顫等［1-2］，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。目前PD的治療主要以DA替代為主，但不能阻止病程的進(jìn)展［2］。構(gòu)建更接近臨床PD特征的模型是抗PD新藥研發(fā)的重要手段。制備PD模型的藥物有6-羥多巴（6-hydroxydopamine，6-OHDA）、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）、魚藤酮和百草枯等［3-6］。6-OHDA不能透過血腦屏障，需直接腦內(nèi)給藥才能造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)DA神經(jīng)元損傷，不能完全復(fù)制PD患者的腦病理變化，不能模擬早期PD癥狀［7-8］。MPTP雖可穿越血腦屏障，能模擬人和動物PD樣癥狀，但所形成的PD呈現(xiàn)急性或亞急性過程，不能模擬臨床PD的緩慢進(jìn)展性過程［7］。百草枯雖能模擬PD患者的病理和行為學(xué)方面的部分改變，但不易穿過血腦屏障［9］。魚藤酮具有極強(qiáng)的親脂性，能透過血腦屏障和細(xì)胞膜，魚藤酮致PD模型不僅行為學(xué)改變能接近臨床PD，而且其病理學(xué)特征也與臨床PD相似［10-11］。已有文獻(xiàn)報道，通過不同方式給予魚藤酮，可成功制備大鼠或小鼠PD模型［12-15］。另外，還可用其制備細(xì)胞模型。本文為探明PD的發(fā)病機(jī)制和新藥研發(fā)提供文獻(xiàn)基礎(chǔ)、科研思路及方法。

1 魚藤酮誘導(dǎo)PD模型制備方法

魚藤酮誘導(dǎo)PD的建模方法有體內(nèi)和體外方式。體內(nèi)動物模型給藥途徑有立體定位腦內(nèi)給藥、靜脈給藥、腹腔注射給藥、經(jīng)皮給藥、灌胃和皮膚接觸給藥等。體外多選PC12或SH-SY5Y細(xì)胞，也有體外培養(yǎng)大鼠腦切片的造模方法。

1.1 動物模型

1.1.1 腦立體定位給藥

1985年，Heikkila等［16］采用腦立體定位方法用魚藤酮制備大鼠PD模型，造成大鼠DA黑質(zhì)紋狀體損傷。之后，Alam等［17］采用內(nèi)側(cè)前腦束立體定位給藥的方式，每只大鼠給予魚藤酮3 μg。與假手術(shù)組相比，PD模型大鼠自發(fā)活動顯著減少，強(qiáng)直癥狀顯著增強(qiáng)，紋狀體DA水平顯著缺失。立體定位給予魚藤酮第50天時，同時聯(lián)合給左旋多巴和外周氨基酸脫羧酶抑制劑芐絲肼31 d，大鼠紋狀體DA水平升高，自主活動改善。Saravanan等［18］立體定位于大鼠黑質(zhì)密致部，采用更低劑量魚藤酮（每只2～12 ng）制備PD模型，連續(xù)觀察90 d，黑質(zhì)DA水平呈時間和劑量依賴性下降，但未影響受損側(cè)紋狀體5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）水平；黑質(zhì)部位谷氨酸水平呈劑量依賴性降低，酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞顯著減少，大鼠出現(xiàn)偏側(cè)（立體定位灌注側(cè)）PD癥狀。立體定位給藥同樣適用于不能透過血腦屏障的藥物，且微量用藥即有效，能模擬臨床DA水平缺失，誘發(fā)PD癥狀。而低劑量給藥，短期內(nèi)5-HT含量不會發(fā)生明顯變化［19-20］。立體定位給藥量每只大鼠3 μg，給藥8周，大鼠不僅在行為上出現(xiàn)運動障礙，DA、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）呈時間依賴性減少，5-HT水平在第8周也顯著降低，且死亡率低，模型成功率高，造模劑量較為適宜。該造模方式給藥微量，且一次性定位，有助于篩選治療PD的藥物。但立體定位給藥操作較難，需要一定的操作能力，定位的準(zhǔn)確性關(guān)乎實驗的成敗。

1.1.2 靜脈給藥

1997年，F(xiàn)errante等［21］靜脈灌注魚藤酮10～18 mg·kg-1連續(xù)給藥10 d，發(fā)現(xiàn)大鼠紋狀體和蒼白球損傷。2000年，Betarbet等［22］給大鼠靜脈注射魚藤酮，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)行為障礙，黑質(zhì)區(qū)域α-突觸核蛋白（alpha-synuclein，α-syn）的聚集。Fleming等［23］研究表明，魚藤酮導(dǎo)致大鼠運動遲緩，TH免疫活性降低，魚藤酮劑量依賴性地降低大鼠存活率，每天2 mg·kg-1，共28 d，成功造模，且存活率相對其他大劑量的存活率高。靜脈給藥操作簡單，藥物直接進(jìn)入體循環(huán)，無吸收過程，藥效發(fā)揮迅速，但全身毒性較大。

1.1.3 腹腔注射給藥

2002年，Alam等［24］報道，給大鼠腹腔注射魚藤酮1.5和2.5 mg·kg-1，連續(xù)給藥60 d，均能造成大鼠自主活動減少，紋狀體DA含量降低，TH免疫反應(yīng)性降低，并存在劑量依賴性。Bashkatova等［25］對腹腔注射魚藤酮1.5 mg·kg-1（連續(xù)10，20，30和60 d）大鼠額葉皮質(zhì)和紋狀體一氧化氮（nitric oxide，NO）和巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）的水平進(jìn)行了觀察。研究發(fā)現(xiàn)，第1～10天 NO和TBARS水平未升高；20 d之后，紋狀體NO和TBARS水平升高；30和60 d后，紋狀體和額葉皮質(zhì)NO和TBARS水平均升高，且表現(xiàn)出自發(fā)活動減少、僵直等行為癥狀。2009年，Canno和Drolet等［26］進(jìn)行了更長時間的觀察，給不同月齡（3，7和12～14個月）的雄性Lewis大鼠腹腔注射魚藤酮（每天2.75或3.0 mg·kg-1），各組大鼠均出現(xiàn)肌肉僵直、運動遲緩和姿勢反射喪失等病理特征，DA神經(jīng)元TH缺失，與之對應(yīng)的紋狀體DA水平降低，黑質(zhì)DA神經(jīng)元泛素化α-syn聚集。且不同月齡大鼠對魚藤酮的時間依賴性與劑量依賴性有差異。3月齡大鼠腹腔注射魚藤酮3.0 mg·kg-1，2 d時，約5%大鼠呈現(xiàn)PD癥狀（嚴(yán)重的運動性運動障礙，僵硬和體位不穩(wěn)定性），直至20 d呈現(xiàn)PD癥狀大鼠數(shù)量達(dá)到75%；7月齡和12～14月齡大鼠9 d時，就有＞95%大鼠出現(xiàn)上述癥狀。7月齡大鼠劑量效應(yīng)更為明顯，腹腔注射魚藤酮2.75 mg·kg-19 d時出現(xiàn)PD癥狀的比例是腹腔注射魚藤酮3.0 mg·kg-1的1/2。因此，腹腔注射魚藤酮不僅劑量和連續(xù)給藥時間對模型結(jié)果有影響，還應(yīng)考慮大鼠月齡的因素。綜合文獻(xiàn)認(rèn)為，研究重點如是PD模型生物標(biāo)志物和退化機(jī)制，則選用3月齡大鼠，采用低劑量1.5 mg·kg-1造模，便于觀察發(fā)現(xiàn)PD疾病進(jìn)程中各項生化指標(biāo)的變化，且造模成功率與存活率高；研究重點如是藥物對PD是否具有保護(hù)作用，則采用2.5～2.75 mg·kg-1。腹腔注射操作方便，吸收面積大，所復(fù)制的PD模型更接近臨床PD患者的臨床癥狀，且此方法還能制備PD的胃腸功能障礙模型［27］。

1.1.4 皮下注射

Luo等［28］報道，慢性低劑量皮下注射魚藤酮（每天2.0～3.0 mg·kg-1），從第5～56 天，大鼠時間依賴性地出現(xiàn)運動功能和黑質(zhì)神經(jīng)元的損傷，出現(xiàn)類似臨床PD的癥狀。Feng等［29］報道，大鼠皮下注射魚藤酮造成α-syn廣泛分布于腦組織，特別是海馬、皮質(zhì)和紋狀體部位，而且選擇性地造成中腦黑質(zhì)和紋狀體TH陽性表達(dá)降低，神經(jīng)纖維缺失。Lin等［30］報道，大鼠皮下注射魚藤酮除了造成運動功能減退、α-syn聚集、黑質(zhì)和紋狀體TH陽性表達(dá)降低、DA轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)降低及DA D2受體蛋白表達(dá)升高外，還會造成藍(lán)斑核區(qū)去甲腎上腺素神經(jīng)元活性減弱。Ulusoy等［31］報道，魚藤酮選擇性地降低大鼠黑質(zhì)紋狀體DA水平，但不改變下丘腦DA水平。Lax等［32］研究了魚藤酮對大鼠體溫調(diào)節(jié)和運動功能的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)長期皮下注射魚藤酮造成體溫調(diào)控系統(tǒng)功能減弱，并且減弱程度和運動功能減弱成正相關(guān)。Binienda等［33］采用皮下低劑量（每天 1.0～2.0 mg·kg-1）注射魚藤酮，連續(xù)注射7 d后，魚藤酮組60%大鼠黑質(zhì)DA神經(jīng)元缺失，注射27 d，80%大鼠黑質(zhì)DA神經(jīng)元缺失，與溶媒組比較，注射7和27 d的大鼠感覺和運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度顯著變慢，提示DA缺失與感覺和運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢存在相關(guān)性。Sharma等［34］給大鼠皮下注射魚藤酮2 mg·kg-1，1/d，連續(xù)28 d，發(fā)現(xiàn)紋狀體DA水平降低80%才表現(xiàn)出PD癥狀，提示PD癥狀出現(xiàn)前體內(nèi)已經(jīng)發(fā)生了一系列的生化指標(biāo)的變化。所以，PD的早期干預(yù)和治療非常重要。皮下注射魚藤酮35 d后，DA水平降低80%，GSH和SOD顯著下降，脂質(zhì)過氧化水平升高60%，這些生化指標(biāo)的改變，可以作為運動功能顯著惡化的標(biāo)志物。在用藥物進(jìn)行治療時發(fā)現(xiàn)，上述生化指標(biāo)的改善比運動功能的改善提前3周，據(jù)此進(jìn)一步推斷，生化指標(biāo)的改變是PD進(jìn)程惡化的早期信號。2016年，Sharma等［35］報道，大鼠皮下注射魚藤酮（每天1.5 mg·kg-1，連續(xù)28 d）導(dǎo)致了PD模型大鼠神經(jīng)遞質(zhì)（DA、去甲腎上腺素、5-HT、γ-氨基丁酸、谷氨酸、二羥苯乙酸、高香草酸和5-羥基吲哚乙酸）、生化指標(biāo)（過氧化脂質(zhì)、GSH和亞硝酸鹽）、神經(jīng)炎癥因子（腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1和白細(xì)胞介素6）發(fā)生變化及其運動功能也發(fā)生變化。低劑量皮下注射魚藤酮能模擬PD的疾病進(jìn)程變化和PD癥狀。目前多篇文獻(xiàn)報道了給大鼠皮下注射低劑量（1.5 mg·kg-1）魚藤酮的方法，大鼠均在第3周出現(xiàn)行為上的運動障礙，且能成功模擬PD的疾病進(jìn)程和PD癥狀，更符合慢性疾病的致病過程［36-38］。此法操作簡單，費用少，造模成功率高。但皮下注射會引起大鼠全身毒性，并非特異性地造成神經(jīng)系統(tǒng)DA神經(jīng)元退變，且死亡率高。

1.1.5 灌胃給藥

Inden等［39］采用給小鼠灌胃的方式成功模擬了PD動物模型。連續(xù)灌胃魚藤酮不同劑量（0.25，1.0，2.5，5.0，10和30 mg·kg-1）28 d。0.25～5.0 mg·kg-1劑量組的小鼠黑質(zhì)區(qū)TH未發(fā)生明顯變化，而10和30 mg·kg-1劑量組的小鼠黑質(zhì)區(qū)TH變化顯著。進(jìn)一步實驗表明，給小鼠持續(xù)灌胃給予魚藤酮30 mg·kg-1，7 d內(nèi)小鼠存活率為70%；直到28～56 d，小鼠存活率依舊為70%。而劑量增加為100mg·kg-1，連續(xù)給藥56 d小鼠存活率下降為15%。灌胃給予魚藤酮造成的DA系統(tǒng)受損程度、TH變化及運動功能減退等均存在時間依賴性和劑量依賴性。因此既要保證造模成功，又要保證存活率，應(yīng)采用慢性灌胃給藥方式造模，給予魚藤酮30 mg·kg-1，該劑量灌胃給藥有利于研究PD的疾病進(jìn)程和DA神經(jīng)退化機(jī)制［40］。但是，灌胃給藥不僅藥效較低，劑量控制不當(dāng)，長期灌胃給藥仍會增加死亡率，影響實驗進(jìn)程［40］。

1.1.6 皮下埋置緩釋微球或微滲透泵給藥

黃君等［41］以聚乳酸-羥基乙酸共聚物（polylacticco-glycolic acid，PLGA）為載體，將魚藤酮制作成緩釋微球，采用皮下注射魚藤酮緩釋微球的方法制作PD大鼠模型。該法只需1次給藥，魚藤酮在大鼠體內(nèi)緩慢釋放，造成大鼠自主活動減少，黑質(zhì)致密帶內(nèi)TH免疫反應(yīng)顯著降低，黑質(zhì)內(nèi)絕大多數(shù)DA能神經(jīng)元受損，便能模擬PD進(jìn)程，但制劑過程繁瑣。如能將制劑商業(yè)化，則可為科研人員提供方便。Sherer等［42］采用皮下埋置微滲透泵，大鼠每日灌注魚藤酮2.0～3.0 mg·kg-1，成功復(fù)制了慢性攝入魚藤酮致PD模型。該法可引起嚙齒動物高選擇性的黑質(zhì)DA病變，黑質(zhì)神經(jīng)元α-syn聚集，但紋狀體神經(jīng)元、蒼白球神經(jīng)元和丘腦核未見病變。此類造模方法一次給藥，藥物在體內(nèi)持續(xù)釋放，較以往的多次給藥方法方便，將微滲透泵植入體內(nèi)，可實現(xiàn)恒定速度持續(xù)釋放藥物，且能減少多次給藥引起的應(yīng)激反應(yīng)，能模擬PD進(jìn)程，但微滲透泵價格貴，實驗成本較大。

1.1.7 接觸給藥

以上幾種給藥方式，不僅與人接觸魚藤酮的方式存在差異，而且控制不當(dāng)死亡率提高。我國學(xué)者采用模擬環(huán)境接觸的方式制備PD模型取得了成功。陳乃宏實驗室［43-44］將魚藤酮溶于橄欖油，置于無墊料鼠籠中，放入C57BL/6小鼠，鼠籠置于暗處，小鼠在含有魚藤酮的籠中自由活動2 h，給藥劑量分別為每只0.1和 0.2 mg·d-1。連續(xù)給藥2～6周，期間取材檢測中腦α-syn含量、TH陽性細(xì)胞數(shù)和小鼠爬桿能力。0.1 mg·d-1劑量組給藥后2周，模型組α-syn表達(dá)較對照組明顯增加，小鼠中腦TH陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少，小鼠爬桿能力顯著降低；給藥4周后，模型成功率接近100%。0.2 mg·d-1劑量組造模成功時間縮短為2周，但給藥4周后死亡率較高。結(jié)果表明，采用低劑量0.1 mg·d-1接觸式給藥4周的造模方式能使小鼠產(chǎn)生PD的行為學(xué)改變和相應(yīng)的病理學(xué)變化，是有效的PD造模方式。該造模方式能模擬自然慢性進(jìn)行性病程，不僅避免了魚藤酮其他給藥方式所造成的外周毒性，而且模型的死亡率顯著降低，造模成功率提高，有助于研究PD發(fā)病機(jī)制和病程變化以及抗PD藥物的作用機(jī)制。

1.2 體外模型

1.2.1 腦切片或DA神經(jīng)元

Testa等［45］建立了大鼠腦切片的培養(yǎng)方法，并用魚藤酮10～50 nmol·L-1作用于體外培養(yǎng)的大鼠腦片。結(jié)果表明，魚藤酮濃度和時間依賴性地造成黑質(zhì)致密度損傷，神經(jīng)元缺失，TH水平降低。Li等［46］將魚藤酮作用于原代培養(yǎng)的大鼠胚胎中腦DA神經(jīng)元，E3泛素化連接酶Parkin和黃素單氧化酶1顯著降低成功復(fù)制了PD模型。

1.2.2 PC12細(xì)胞或SH-SY5Y細(xì)胞

采用不同濃度的魚藤酮（0～1000 nmol·L-1）［47-49］作用于PC12細(xì)胞或SH-SY5Y細(xì)胞，可以成功復(fù)制PD細(xì)胞模型，魚藤酮濃度和時間依賴性地造成細(xì)胞凋亡和壞死。體外模型造模方法簡單，特別是隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和實時模擬人體生理環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)儀器平臺的發(fā)展，使得體外造模方法成為研究PD發(fā)病機(jī)制和藥物保護(hù)機(jī)制及高通量篩選藥物的主要方式。

2 魚藤酮致PD模型的毒性機(jī)制

魚藤酮致PD模型的毒性機(jī)制是多因素的，如α-syn異常聚集、線粒體功能異常和活性氧產(chǎn)生增加、抗氧化防御系統(tǒng)受損及細(xì)胞凋亡等，或多因素綜合作用［12，14-15］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)受損線粒體主要通過自噬途徑降解，自噬途徑的異常可阻礙受損線粒體的降解，從而導(dǎo)致PD發(fā)生。

2.1 誘導(dǎo)α -syn異常聚集

α-syn最初于1988年由Maroteaux等［50］發(fā)現(xiàn)，且確定其分布在神經(jīng)突觸前末梢和核周。在正常生理狀態(tài)下，α-syn無細(xì)胞毒性，參與DA的攝取調(diào)控、神經(jīng)的可塑性以及學(xué)習(xí)和記憶、維持突觸結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)突觸膜的囊泡釋放和細(xì)胞黏附、維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性等［51］。當(dāng)有外界損傷刺激時，α-syn的錯誤折疊和寡聚態(tài)增多，會產(chǎn)生細(xì)胞毒性。多數(shù)學(xué)者研究表明，魚藤酮濃度和時間依賴性地造成細(xì)胞死亡，誘發(fā)α-syn聚集。研究表明，魚藤酮作用于SH-SY5Y細(xì)胞的半數(shù)致死濃度為100 nmol·L-1。還能造成α-syn過度磷酸化，磷酸化位點與129位絲氨酸特異性的高度磷酸化有關(guān)，α-syn過度磷酸化進(jìn)而影響線粒體功能和活性氧水平［52-54］。

2.2 引起線粒體功能異常（障礙）和活性氧產(chǎn)生增加

魚藤酮是線粒體呼吸鏈復(fù)合物拉的抑制劑［55-56］，降低復(fù)合物Ⅰ的活性，破壞線粒體呼吸鏈的正常運轉(zhuǎn)［55］，通過“滲透機(jī)制”使自由基產(chǎn)生增加，活性氧增加［56-58］?；钚匝跤忠鹁€粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的打開，致使線粒體的ATP耗竭或ATP合成減少、功能衰退、膜電位下降，以及通透性增加［58-61］，細(xì)胞色素c釋放。正常生理條件下，細(xì)胞色素c位于線粒體內(nèi)膜，不能通過外膜。但在線粒體功能衰退；其膜通透性增加，神經(jīng)元凋亡過程中，細(xì)胞色素c從線粒體釋放增加，胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9激活，胱天蛋白酶3斷裂［58-61］，引起促凋亡蛋白Bax與抑制凋亡蛋白Bcl-2的比值增加［56］。抑制線粒體膜通透性開放和活性氧產(chǎn)生的物質(zhì)，可能有助于PD的治療［61-62］。

2.3 造成抗氧化防御系統(tǒng)受損

抗氧化防御系統(tǒng)對人體預(yù)防疾病和延緩衰老起著至關(guān)重要的作用。正常情況下，人體自由基和活性氧的生成和清除處于動態(tài)平衡，病理條件或環(huán)境因素等的改變會打破原有的動態(tài)平衡。魚藤酮作為一種環(huán)境毒素，能破壞人體的抗氧化防御系統(tǒng)。已有眾多學(xué)者的實驗證實，魚藤酮能顯著降低超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和還原型GSH活性，增加氧化型GSH含量，降低GSH與氧化性GSH比值；魚藤酮還能造成丙二醛顯著增加［54-63］

2.4 造成細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)異常

魚藤酮作用于SH-SY5Y細(xì)胞和SN-N-MC細(xì)胞會造成細(xì)胞周期調(diào)節(jié)異常和細(xì)胞凋亡甚至死亡［63-65］。魚藤酮＜0.25 μmol·L-1刺激細(xì)胞，細(xì)胞周期阻滯在G1/S期，G2/M期細(xì)胞數(shù)量變化不明顯；而魚藤酮高濃度如 2 μmol·L-1刺激細(xì)胞，細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，G2/M期之后不發(fā)生細(xì)胞分裂，而是出現(xiàn)核內(nèi)復(fù)制［66-68］。魚藤酮能使細(xì)胞中G2/M期關(guān)鍵調(diào)控分子細(xì)胞分裂周期蛋白2（cell division cycle protein 2，Cdc2）在細(xì)胞漿中的表達(dá)明顯增高，且能造成Cdc2顆粒聚集；然而，細(xì)胞中的Cdc2總蛋白中Cdc2活性是降低的［66］。有學(xué)者認(rèn)為，引起的G2/M期明顯阻滯可能和Cdc2活性降低、Cdc2表達(dá)升高相關(guān)［66-67］。魚藤酮立體定位給予SD大鼠，致大鼠DA神經(jīng)元受損，受損神經(jīng)元G1期標(biāo)志性蛋白D型細(xì)胞周期蛋白表達(dá)升高，G2/M關(guān)鍵調(diào)控分子Cdc2表達(dá)增高，凋亡分子胱天蛋白酶3活化增加，細(xì)胞周期調(diào)控分子E2F1免疫活性增強(qiáng)［66］。有學(xué)者認(rèn)為，Cdc2異常表達(dá)是從細(xì)胞周期阻滯到細(xì)胞死亡的一個過渡期，Cdc2表達(dá)異常，可能參與了胱天蛋白酶3和9依賴的細(xì)胞凋亡。魚藤酮引起DA神經(jīng)元細(xì)胞周期異?？赡軈⑴c細(xì)胞凋亡過程［66-68］。

2.5 抑制神經(jīng)細(xì)胞自噬途徑

自噬是細(xì)胞內(nèi)一種依賴溶酶體的物質(zhì)降解途徑，也是細(xì)胞在外界環(huán)境刺激以及生理病理調(diào)控下的自我保護(hù)過程，自噬不足或過度自噬都會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這也是許多疾病的重要致病機(jī)制。魚藤酮作用于SH-SY5Y細(xì)胞和PC12細(xì)胞會造成細(xì)胞線粒體損傷，線粒體損傷是誘導(dǎo)PD的一個原因。Jang等［69］研究表明，魚藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞降低了其生存能力，增加了活性氧的水平，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和α-syn表達(dá)，且增強(qiáng)了mTOR表達(dá)和抑制Beclin-1表達(dá)，說明魚藤酮抑制了自噬系統(tǒng)。Dadakhujaev等［70］建立了SH-SY5Y細(xì)胞系，超表達(dá)突變的α-syn誘導(dǎo)了一些蛋白質(zhì)聚集和細(xì)胞死亡。而自噬的激活則阻斷了魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡且減輕了α-syn變異表達(dá)細(xì)胞的線粒體膜電位損傷和魚藤酮誘導(dǎo)的活性氧累積，說明自噬對魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)聚集體起到清除作用。細(xì)胞內(nèi)的受損線粒體主要通過自噬途徑降解，因此，自噬途徑的異常可阻礙受損線粒體的降解，從而導(dǎo)致PD發(fā)生。自噬主要的研究方法如電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、Western蛋白印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白、細(xì)胞免疫熒光檢測自噬斑等，均已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞自噬的研究［71-74］。

3 結(jié)語

綜上所述，魚藤酮產(chǎn)生的毒性機(jī)制與目前對PD病理機(jī)制認(rèn)識相近。無論是體內(nèi)還是體外，魚藤酮都能再現(xiàn)人類PD的病理學(xué)特征。近年來，在魚藤酮誘導(dǎo)PD模型的方法、毒性機(jī)制的研究方面都有了新的進(jìn)展。梳理文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，相同給藥方式劑量不同，造模成功所需時間不同；不同給藥方式，急、慢性造模所需劑量不同，造成的病理變化和毒性機(jī)制亦存在差異。不同給藥方式、不同劑量的造模各有優(yōu)缺點，其生化指標(biāo)、行為學(xué)變化、神經(jīng)病理特征及毒性機(jī)制均有所不同，給藥方式及劑量的不同都會影響實驗結(jié)果，建立一個穩(wěn)定、死亡率低、成模率高的模型是科研亟待解決的問題。相比之下，慢性暴露的接觸式給藥方式能更好地模擬人類PD自然慢性進(jìn)行性的發(fā)病進(jìn)程，為PD病理機(jī)制研究提供了依據(jù)，對于研究病程變化以及藥物的作用機(jī)制有十分重要的意義。

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