二氫楊梅素通過上調自噬活性抑制MPP+誘導的PC12細胞損傷

周湘華＊，趙其輝＊，周壽紅

（1.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術學院，衡陽湖南 421001；2.南華大學醫(yī)學院生理學教研室，衡陽湖南 421001）

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是60歲以上老年人中常見的神經系統退行性疾病，其發(fā)病率可高達2%［1］。黑質的多巴胺能神經元選擇性壞死和死亡是PD的主要病理特征，而氧化應激在PD患者黑質多巴胺能神經元死亡中發(fā)揮了十分重要的作用［2］。氧化應激時大量產生的自由基可導致脂質過氧化反應、細胞內鈣穩(wěn)態(tài)失調以及細胞內細胞色素c大量釋放，最終引發(fā)神經元凋亡或死亡［3］。1-甲基-4-苯基吡啶離子（1-methyl-4-phenylpyridiniu?mion，MPP+）是一種具有神經毒性的化合物，能抑制線粒體的呼吸鏈復合物的形成和功能，產生氧化應激，最終引起多巴胺能神經元的死亡［4-5］。PC12細胞具有神經細胞的部分特征，常采用MPP+誘導PC12細胞損傷來建立PD的細胞模型［6-7］。二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）是一種從藤茶莖葉中分離得到的雙氫黃酮類化合物［8］。研究發(fā)現，DMY能抑制硝普鈉誘導的PC12細胞的氧化損傷［9］，但其作用機制尚未完全闡明。

自噬是真核生物細胞降解和回收細胞內的長壽蛋白質、生物大分子和受損細胞器的過程。有研究顯示，自噬參與了MPP+誘導的PC12細胞氧化應激損傷［10］。本研究通過MPP+誘導的PC12細胞損傷模型，觀察DMY對MPP+誘導PC12細胞損傷的保護作用，從細胞自噬的角度探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

MPP+和 3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）（美國Sigma公司），DMY（大連美侖生物科技有限公司），DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（南京建成生物工程公司）。兔抗大鼠Beclin 1、微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein light chain-3，LC3）、P62和β肌動蛋白單克隆抗體（一抗）和相應的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體（二抗）（美國Santa Cruz公司）。

1.2 儀器

TECNAI 20 U-TWIN型透射電鏡（荷蘭菲利浦電子光學公司），全自動酶標儀（瑞士哈美頓公司），紫外分光光度計（日本島津），CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），Bio-Rad 550型酶標儀（美國Bio-Rad公司產品），FlexStation 3多功能酶標儀工作站（美國MD公司），Sigma 3K15離心機（德國Sigma公司）。

1.3 細胞培養(yǎng)

培養(yǎng)PC12細胞采用含鏈霉素100 kU·L-1、青霉素100 kU·L-1和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長融合至70%～80%時，進行細胞傳代培養(yǎng)，處于對數生長期的細胞用于實驗。

1.4 細胞分組

根據培養(yǎng)液中加入藥物，實驗分為細胞對照組、MPP+500 μmol·L-1組、DMY 80 μmol·L-1組、MPP+＋DMY 5，10，20，40 和 80 μmol·L-1、3-MA 10 mmol·L-1組和MPP+＋DMY 20 μmol·L-1+3-MA組，DMY預處理PC12細胞0.5 h后，再加入相應藥物于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h。每組設5復孔。

1.5 MTT法檢測細胞存活率

將PC12細胞按每孔5×105細胞接種在96孔板中，放置于含5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)24 h。按

1.4 處理細胞，處理結束后，加1 mL MTT（0.5 g·L-1）繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去上清液，加200 μL DMSO，振蕩混勻。設定波長為570 nm，在全自動酶標儀上檢測樣本的吸光度（A570nm）值。細胞存活率（%）=（實驗組A570nm-空白對照組A570nm）/（細胞對照組A570nm-空白對照組A570nm）×100%。

1.6 比色法檢測細胞培養(yǎng)液中LDH水平

按1.4處理細胞，處理結束后收集各組細胞培養(yǎng)液，離心，取上清液，采用LDH檢測試劑盒，通過比色法檢測細胞上清液中LDH的水平，操作按照試劑盒說明進行。

1.7 透射電鏡觀察自噬體

將PC12細胞按每孔1×106接種在6孔培養(yǎng)板中，待細胞生長至融合度約85%時，按1.4處理細胞，處理結束后，用0.25%胰酶消化細胞后，刮下細胞，1000×g離心25 min收集細胞于EP管中。加入2%戊二醛在4℃下固定2 h。經常規(guī)脫水、包埋、超薄切片和重金屬染色后，采用透射電鏡觀察細胞中的自噬體并拍照記錄。用圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0測定并計算出自噬泡占細胞胞漿總面積的百分比。

1.8 Western蛋白質印跡法檢測Beclin-1，LC3和P62蛋白表達

收集各實驗組的細胞，用預冷PBS沖洗2遍，加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min，提取總蛋白。BCA試劑盒定量樣本的蛋白濃度。總蛋白樣本加入上樣緩沖液充分煮沸變性蛋白。10%SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，轉移到PVDF膜。3%BSA室溫下孵育2 h封閉非特異性抗原。加入Beclin-1（1∶150）、LC-3（1∶200）、P62（1∶200）和β肌動蛋白（1∶400）的一抗，4℃過夜。洗膜后加入相應的二抗（1∶1000），室溫下脫色搖床上緩慢搖晃繼續(xù)孵育2 h。洗膜后用ECL試劑盒顯色，清洗終止反應。ChemiDoc MP多色熒光凝膠成像分析系統中觀察并記錄結果，采用Image J軟件進行灰度分析，分析目的蛋白的相對表達水平。采用目的蛋白與β肌動蛋白積分吸光度比值表示蛋白的相對表達量。

1.9 統計學分析

實驗數據結果以x±s表示，數據分析處理采用SPSS 18.0統計分析軟件完成，單因素方差分析用于組間差異的比較，而組間差異的兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DMY對MPP+誘導下PC12細胞存活率的影響

與細胞對照組比較，MPP+組的細胞存活率顯著降低（P＜0.05）（表1）。與MPP+組比較，MPP++DMY 10～80 μmol·L-1組細胞存活率顯著升高（均P＜0.05）。DMY 80 μmol·L-1組細胞存活率與細胞對照組無顯著差異。MPP++DMY 5 μmol·L-1組細胞存活率與MPP+組無顯著差異。DMY 20 μmol·L-1為最佳的作用濃度，用于后續(xù)實驗。與MPP++DMY 20 μmol·L-1組比較，MPP++DMY+3-MA組細胞存活率顯著降低（P＜0.05）。而DMY和3-MA組細胞存活率與細胞對照組無顯著性差異。

2.2 DMY對MPP+誘導下PC12細胞培養(yǎng)上清液中LDH水平的影響

與細胞對照組比較，MPP+組細胞上清液中LDH水平顯著增加（P＜0.05）（表2）。與MPP+組比較，MPP++DMY 10～80 μmol·L-1組細胞培養(yǎng)上清液中LDH水平顯著降低（均P＜0.05）。DMY 80 μmol·L-1組與細胞對照組比較細胞培養(yǎng)上清液中LDH水平無顯著性差異。MPP++DMY 5 μmol·L-1組細胞培養(yǎng)上清液中LDH水平與MPP+組亦無顯著性差異。與 MPP++DMY 20 μmol·L-1組比較，MPP++DMY+3-MA組細胞培養(yǎng)上清液中LDH水平顯著增加（P＜0.05）。DMY和3-MA組細胞上清液中LDH水平與細胞對照組無顯著性差異。

Tab.1 Effect of dihydromyricetin（DMY）on cell viability of PC12 cells exposed to 1-methyl-4-phenylpyridinium（MPP+）

Tab.2 Effect of DMY on level of lactate dehydroge?nase（LDH）in culture medium supernatant of PC12 cells exposed to MPP+

2.3 DMY對MPP+誘導下PC12細胞自噬體形成的影響

透射電鏡觀察結果表明（圖1），細胞對照組PC12細胞中可觀察到特征性雙層膜的自噬體，而MPP+組細胞中自噬體數量明顯減少，細胞中自噬泡占胞質總面積的百分率顯著降低〔（7.5±0.5）%vs（2.9±0.3）%，P＜0.05〕。與MPP+組比較，MPP++DMY 20 μmol·L-1組細胞中自噬體的數量明顯增加，細胞中自噬泡占胞質總面積的百分率顯著增加〔（2.9 ± 0.3）%vs（5.9±0.4）%，P＜0.05〕。DMY 20 μmol·L-1組中自噬體的數量與細胞對照組無明顯差異，細胞中自噬泡占胞質總面積的百分率無明顯差異〔（7.8±0.7）%vs（7.5± 0.5）%〕。

Fig.1 Effect of DMY on ultrastructure of PC12 cells exposed to MPP+by transmission electron microscope.See Tab.1 for the treatment.Arrows show autophagic vacuols.

2.3 DMY對MPP+誘導PC12細胞Beclin-1，p62和LC3蛋白表達的影響

與細胞對照組比較，MPP+組細胞中Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值均顯著性降低，P62的表達顯著性增加（均P＜0.05）（如圖2）。與 MPP+組比較，MPP++DMY 20 μmol·L-1組細胞Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值均顯著性增加，P62的表達顯著性降低（P＜0.05）。DMY 20 μmol·L-1組自噬相關蛋白的表達與細胞對照組無明顯差異。

Fig.2 Effect of DMY on expression of Beclin-Ⅰ（A），P62（B），microtubule-associated protein light chain-3（LC3）-Ⅱand LC3-Ⅰ（C）in PC12 cells exposed to MPP+by Western blotting.See Tab.1 for the treatment.A2，B2，C2 and C3 were the semi-quantitative results of A1，B1 and C1，respectively.x±s，n=5.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with MPP+group.

3 討論

本研究結果表明，MPP+500 μmol·L-1處理48 h后PC12細胞的存活率顯著降低，培養(yǎng)上清液中LDH水平顯著增加，表明細胞損傷的模型成功建立。而給予DMY 10，20，40和80 μmol·L-1預處理抑制了MPP+誘導的PC12細胞損傷，且隨濃度增加保護效應也呈現增加的趨勢，DMY 5 μmol·L-1預處理未表現出保護作用。本結果表明，DMY能抑制MPP+誘導的PC12細胞損傷，可能具有神經保護作用。DMY是一種從藤茶莖葉中分離得到的天然的二氫黃酮醇類化合物，又稱蛇葡萄素和雙氫楊梅素等［11-12］。鄧之婧等［13］研究發(fā)現，DMY能抑制小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷。研究也發(fā)現，DMY可通過Akt/ERK1/2信號通路抑制硝普鈉誘導的PC12細胞的損傷［9］。

自噬是真核生物細胞在自噬相關基因的調控下，通過自噬泡的形成將細胞內損傷的細胞器、衰老的蛋白質和病原微生物等包裹起來，通過形成自噬-溶酶體將其降解回收的過程［14］。Beclin-1常被認為是自噬體形成的標志性蛋白。LC3在自噬相關基因4（autophagy related genes，ATG4）的降解作用下產生為細胞溶質形式LC3-Ⅰ，然后在ATG7的作用下LC3-Ⅰ和E2酶At93結合，進一步與磷脂酰乙醇胺產生作用生成LC3-Ⅱ，參與了自噬體形成和成熟。因此，LC3-Ⅱ和LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比值也常用來反映細胞自噬活性的水平［15］。P62是自噬的底物，自噬可將其降解，常用來評價自噬活性［16］。有研究顯示，MPP+能降低PC12細胞的自噬活性［17-18］。Chen 等［19］研究發(fā)現，DMY 能激活FOXO3a介導的自噬，抑制缺血-再灌注損傷誘導的肝細胞凋亡。Fan等［20］研究發(fā)現，DMY通過ROSSTAT3信號通路誘導頭頸鱗狀細胞癌的自噬和細胞凋亡。Shi等［21］研究也發(fā)現，DMY通過AMPKPGC-1α-Sirt3信號通路誘導細胞自噬，改善骨骼肌細胞的胰島素抵抗。上述研究表明，DMY對細胞自噬具有調控作用。本研究結果顯示，MPP+可減少PC12細胞中自噬體數量和細胞中自噬泡占胞質總面積的百分率，顯著降低細胞中Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值，顯著升高P62的表達。這表明MPP+能降低PC12細胞的自噬水平，與以往的研究結果一致［18-19］，MPP+能被多巴胺能神經元攝取，并在細胞中聚集，能抑制神經元中線粒體呼吸鏈復合體的功能，抑制細胞自噬，誘導神經元損傷［22］。而給予DMY 20 μmol·L-1預處理，明顯增加細胞中自噬體數量，顯著增加細胞中自噬泡占胞質總面積的百分率，顯著上調Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值，而下調了P62的表達。這些結果提示，DMY對MPP+誘導的PC12細胞自噬水平降低具有抑制作用，此抑制作用可被3-MA部分逆轉，提示DMY抑制MPP+誘導的PC12細胞損傷可能通過細胞自噬途徑介導。

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