表沒食子兒茶素沒食子酸酯作為Nrf2/ARE信號(hào)通路激活劑的研究進(jìn)展

楊 涪，劉 旭，李明春

（1.青島大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，山東青島266021；2.中國(guó)人民解放軍第401醫(yī)院藥劑科，山東青島 266071）

綠茶是一種廣受歡迎的飲品，流行病學(xué)研究表明，綠茶用量與降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)呈劑量正相關(guān)性，且綠茶被認(rèn)為是中國(guó)人群帕金森病的保護(hù)性因素［1］，具有較好的保健作用。兒茶素是茶葉中黃烷醇類物質(zhì)的總稱，是綠茶發(fā)揮保健作用的主要成分。兒茶素包括表兒茶素、表沒食子兒茶酚、表兒茶酚沒食子酸和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallo?catechin-3-gallate，EGCG）4種類型。其中EGCG是兒茶素中含量最多、活性最強(qiáng)的成分，是茶多酚乃至綠茶有效成分研究的主要對(duì)象。大量研究已證明，EGCG具有較強(qiáng)的抗氧化、清除自由基、金屬螯合、抗癌、抗凋亡和抗炎作用，同時(shí)參與信號(hào)通路調(diào)控，表現(xiàn)出多種生物學(xué)功效［2］，具有較大開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。核轉(zhuǎn)錄因子紅細(xì)胞系-2p45相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件（nuclear factor erythroid-2p45-related factor 2/antioxidant response element，Nrf2/ARE）信號(hào)通路是體內(nèi)抗氧化的重要通路，調(diào)控體內(nèi)氧化還原水平，與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫疾病、心血管疾病和腫瘤等多種疾病相關(guān)，是研究氧化應(yīng)激的主要靶通路之一。研究表明，EGCG參與Nrf2/ARE信號(hào)通路調(diào)控，對(duì)Nrf2及下游產(chǎn)物具有激活作用，影響機(jī)體氧化還原狀態(tài)。本文概述了EGCG及Nrf2/ARE信號(hào)通路的性質(zhì)，總結(jié)了EGCG作為Nrf2/ARE信號(hào)通路激活劑的研究進(jìn)展，為EGCG開發(fā)利用提供參考。

1 EGCG的生物學(xué)活性

EGCG是多羥基酚類化合物，是茶多酚的主要有效成分，蘋果和葡萄中也富含EGCG。EGCG已被證實(shí)具有抗氧化、抗癌、與膜蛋白互相作用、激活第二信使和信號(hào)通路、調(diào)控代謝酶和細(xì)胞自噬等多種生物學(xué)功效［3］。

EGCG抗氧化能力是維生素E的25倍，維生素C的100倍，酚羥基是其抗氧化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，可提供活躍的氫以清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）；EGCG能螯合金屬離子形成非活性化合物，防止金屬離子氧化產(chǎn)生自由基；還能促進(jìn)抗氧化酶表達(dá)。EGCG抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移主要是引發(fā)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期；抑制NF-κB信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase pathway，MAPK）信號(hào)通路、表皮生長(zhǎng)因子受體介導(dǎo)的信號(hào)通路、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體介導(dǎo)的信號(hào)通路，抑制環(huán)氧合酶2過表達(dá)及蛋白酶體激活；調(diào)控與腫瘤血管生成、轉(zhuǎn)移和遷移相關(guān)的信號(hào)通路，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體和基質(zhì)金屬蛋白酶等；且這種抑制增殖、促凋亡的功效選擇性地作用于腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞無影響。放射元素標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，人結(jié)腸癌細(xì)胞中約75%EGCG存在于胞漿，且細(xì)胞膜的放射性隨時(shí)間增加，說明EGCG的生物學(xué)作用可能由其代謝產(chǎn)物與細(xì)胞內(nèi)分子結(jié)合后產(chǎn)生，且EGCG的同二聚體與膜結(jié)合［4］。EGCG可產(chǎn)生低水平的ROS［5］，可能作為下游信號(hào)通路的第二信使；可能調(diào)控的第二信使和膜表面受體還包括Ca2+、cAMP、cGMP、血小板衍生生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體和表皮生長(zhǎng)因子受體等［3］。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，EGCG能夠激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，酪氨酸激酶JAK/轉(zhuǎn)錄因子STAT（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）通路，MAPK通路，磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶（phosphatidylinositol-3-kinaseserine/threonine kinase，PI3K/AKT）通路，Wnt和Notch等信號(hào)通路，參與細(xì)胞調(diào)控。

2 Nrf2/ARE信號(hào)通路

2.1 Nrf2/ARE信號(hào)通路的分子基礎(chǔ)

線粒體呼吸、黃嘌呤有氧分解等生理活動(dòng)會(huì)產(chǎn)生ROS。紫外線、輻射等外源因素也會(huì)促使ROS形成［5］。ROS是指含未成對(duì)電子的氧原子的自由基和活性代謝產(chǎn)物，主要形式為激發(fā)態(tài)氧分子、氧自由基、過氧化物和氮氧化物等［6］。ROS使核酸損傷、蛋白質(zhì)變性、膜滲透性改變，破壞體內(nèi)氧化還原平衡，與神經(jīng)退行性疾病、自身免疫疾病和腫瘤等多種疾病相關(guān)。

ROS過多，機(jī)體會(huì)發(fā)生自我保護(hù)性反應(yīng)，產(chǎn)生內(nèi)源性抗氧化酶和解毒酶降低損傷。其中，Nrf2/ARE信號(hào)通路直接影響細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，是調(diào)控氧化還原的核心通路。該通路包括3個(gè)基本組成：①KELCH樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH association protein 1，Keap1），它通過細(xì)胞骨架蛋白將Nrf2定位于細(xì)胞質(zhì)，含624個(gè)氨基酸，包括3個(gè)主要功能結(jié)構(gòu)域：N端BTB為同二聚化結(jié)合結(jié)構(gòu)域；中部IVR結(jié)構(gòu)域是氧化劑和親電子劑的感受區(qū)，專司調(diào)節(jié)蛋白活性；C端Kelch/DGR結(jié)構(gòu)域與Nrf2結(jié)合，維持兩者間相互作用。②核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2，它具有高度保守的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，是CNC轉(zhuǎn)錄因子家族中活性最強(qiáng)的成員，對(duì)氧化應(yīng)激具有高敏感性，廣泛表達(dá)于肌肉、肝、腎、心、肺和神經(jīng)等多種組織，由589個(gè)氨基酸組成，N端Neh2是主要調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，與Keap1C端Kelch/DGR結(jié)構(gòu)域結(jié)合，同時(shí)是Keap1介導(dǎo)Nrf2泛素化的必要通道；Neh1與Maf蛋白結(jié)合形成異二聚體，核轉(zhuǎn)位后與ARE結(jié)合；Neh3，Neh4和Neh5為反式激活結(jié)構(gòu)域，專司與其他轉(zhuǎn)錄輔助因子結(jié)合；Neh6和Neh7可能是非Keap1依賴性的Nrf2轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控結(jié)構(gòu)域［7-8］。③ARE是調(diào)節(jié)多個(gè)基因的順式作用元件，核心序列為TGA＊＊＊＊GC。下游基因包括編碼抗氧化酶、解毒酶、抗凋亡蛋白和蛋白酶體的基因等［8］。

2.2 Nrf2/ARE通路的生理作用

該通路是已知的最強(qiáng)大的抗氧化途徑。生理狀態(tài)下，Keap1介導(dǎo)Nrf2降解和泛素化，使Nrf2保持在較低水平。細(xì)胞氧化應(yīng)激和（或）受到親電子試劑攻擊時(shí)，Keap1 IVR結(jié)構(gòu)域感受外來刺激，Nrf2得以轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核。核轉(zhuǎn)位后，Nrf2的Neh1與Maf蛋白結(jié)合形成異二聚體，再與ARE結(jié)合，同時(shí)Neh4、Neh5募集輔助轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)下游約200種基因的轉(zhuǎn)錄，具有抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)炎癥損傷、抗細(xì)胞凋亡和緩解鈣離子超載等多重功能，維持細(xì)胞環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。下游產(chǎn)物包括：①Ⅱ相解毒酶。血紅素加氧酶1（heme oxygenase，HO-1）和NAD（P）H醌氧化還原酶1（NAD（P）H：quinone oxidoreduc?tase l，NQO-1）等。②抗氧化酶。γ-谷氨酰胺半胱氨酸合成酶（gamma glutamine cysteine synthe?tase，γGCS）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽還原酶（glutathione，GR）、硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，TR）和過氧化物酶（perox?iredoxin，Prx）等。③分子伴侶和蛋白酶體如熱休克蛋白等［8］。

2.3 Nrf2/ARE通路調(diào)控機(jī)制

2.3.1 蛋白質(zhì)水平調(diào)控

蛋白質(zhì)水平是調(diào)控Nrf2通路的主要方式，其中Keap1是最重要的調(diào)控蛋白。Keap1將Nrf2錨定于胞漿內(nèi)，是E3泛素連接酶底物并介導(dǎo)Nrf2泛素化，使Nrf2含量保持在較低水平。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Kaep1所介導(dǎo)的Nrf2泛素化減弱，Keap1被Nrf2飽和，新生成的Nrf2得以轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核［7］。因此，Keap1是Nrf2的負(fù)性調(diào)控蛋白。蛋白激酶如MAPK，PI3K，糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）和c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）等能使Nrf2部分結(jié)構(gòu)域磷酸化，激活或抑制其活性，是另一種蛋白質(zhì)水平上的調(diào)控方式。此外，分子伴侶（如P21和小窩蛋白等）也參與通路調(diào)控［9］。

2.3.2 表觀遺傳學(xué)調(diào)控

Nrf2表達(dá)量的組織差異性可能與不依賴蛋白的表觀遺傳學(xué)調(diào)控有關(guān)。目前認(rèn)為Nrf2啟動(dòng)子多態(tài)性（如甲基化）和微小RNA（miRNA，miR）（如miR-144，miR-28和miR-200a）等因素參與Nrf2調(diào)控，與蛋白質(zhì)調(diào)控共同維持Nrf2相對(duì)穩(wěn)定［9］。該方式敏感性差，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，研究結(jié)果有限。

2.3.3 小分子化合物

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Nrf2誘導(dǎo)劑主要分為雙酚、胺和醌類物質(zhì)，如特丁基對(duì)苯二酚和EGCG等；邁克爾加成受體，如二十碳五烯酸；異硫氰酸酯類，如萊菔硫烷；氫過氧化物、三價(jià)砷化合物等。它們與Ke?ap1半胱氨酸殘基中的巰基結(jié)合，或?qū)€基氧化，使Keap1構(gòu)象改變，繼而Nrf2與Keap1解離后核轉(zhuǎn)位；或產(chǎn)生低水平H2O2刺激Nrf2表達(dá)［10］。已證實(shí)萊菔硫烷［11］、丹酚酸A［12］和銀杏二萜內(nèi)酯［13］等天然產(chǎn)物能激活Nrf2，促進(jìn)NQO1和HO-1等下游產(chǎn)物表達(dá)。

2.3.4 Nrf2/ARE通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)

Nrf2/ARE通路存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)，即Nrf2表達(dá)過多時(shí)，其本身即可誘導(dǎo)Keap1表達(dá)，增加Nrf2泛素化，防止通路過度活化，但具體機(jī)制尚不明確［7］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，多藥耐藥肺癌細(xì)胞的Nrf2信號(hào)通路活性更高，Nrf2基因敲除后多藥耐藥蛋白表達(dá)降低，藥物敏感性得以恢復(fù)。40例腫瘤組織免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，Nrf2和多藥耐藥蛋白表達(dá)量均明顯高于癌旁組織，基因相關(guān)性分析也顯示兩基因的表達(dá)具有相關(guān)性［14］。以上報(bào)道提示，Nrf2/ARE通路過度激活可能與腫瘤耐藥性相關(guān)，其后續(xù)研究需明確該通路過度活化帶來的后果，為以該通路為靶標(biāo)的藥物研發(fā)提供參考。

3 EGCG對(duì)Nrf2/ARE信號(hào)通路的激活作用

EGCG對(duì)Nrf2/ARE信號(hào)通路具有激活作用，但具體分子機(jī)制說法不一。Zheng等［15］研究發(fā)現(xiàn)，小窩蛋白-1在EGCG吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用，它的位移與EGCG啟動(dòng)保護(hù)作用密切相關(guān)。利用小干擾RNA（siRNA）使小窩蛋白沉默后，發(fā)現(xiàn)Nrf2、HO-1和膽紅素的表達(dá)上調(diào)，證明EGCG誘導(dǎo)小窩蛋白-1轉(zhuǎn)移并使之發(fā)生功能變化，這種變化可能為EGCG激活Nrf2細(xì)胞保護(hù)系統(tǒng)所必須。定量研究發(fā)現(xiàn)，Keap1蛋白表達(dá)量未受EGCG影響，但活性下降。計(jì)算機(jī)分子對(duì)接研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能進(jìn)入Keap1蛋白，與蛋白內(nèi)特定的氨基酸殘基形成氫鍵互相結(jié)合，使Nrf2-Keap1結(jié)合過程被抑制，Keap1所介導(dǎo)的降解作用減弱，Nrf2得以轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用［16-17］。該發(fā)現(xiàn)與早期綜述中Nrf2通路調(diào)控機(jī)制的部分觀點(diǎn)相類似［10］。EGCG作為Nrf2通路激活劑在各系統(tǒng)疾病模型中的研究進(jìn)展總結(jié)如下。

3.1 泌尿系統(tǒng)疾病

EGCG對(duì)于慢性腎病具有潛在保護(hù)作用，靶通路包括與炎癥反應(yīng)相關(guān)的NF-κB通路和Nrf2通路，以及與細(xì)胞自噬相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體通路［18］。Ye等［19］研究發(fā)現(xiàn)，EGCG明顯降低新月型腎小球腎炎模型小鼠死亡率，尿蛋白、血清肌酐和組織學(xué)檢查明顯改善。Nrf2及下游蛋白表達(dá)增加，同時(shí)p-AKT，p-JNK，p-ERK1/2和p-P38等蛋白表達(dá)降低，表明EGCG同時(shí)靶向作用于Nrf2信號(hào)通路和炎癥反應(yīng)等多種途徑對(duì)新月型腎小球腎炎發(fā)揮保護(hù)作用。Tsai等［20］發(fā)現(xiàn)，在狼瘡性腎炎小鼠模型中，EGCG能預(yù)防尿蛋白和嚴(yán)重腎功能損傷，增強(qiáng)腎Nrf2活性，降低腎氧化應(yīng)激和炎癥因子活性，降低NLRP3、胱天蛋白酶1、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18的表達(dá)，增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性，即EGCG對(duì)于狼瘡性腎炎的保護(hù)作用是通過激活Nrf2通路、降低NLRP3和增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)的協(xié)同作用。在順鉑導(dǎo)致的大鼠腎毒性模型中，EGCG可上調(diào)Nrf2和HO-1蛋白水表達(dá)平，并降低氧化應(yīng)激標(biāo)志物NF-κB和4-羥基壬烯酸水平，明顯增強(qiáng)腎抗氧化酶和谷胱甘肽活性。該研究認(rèn)為，Nrf2通路是EGCG對(duì)順鉑導(dǎo)致的大鼠腎毒性發(fā)揮保護(hù)作用的首要靶通路［21］。Sun等［16］研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能減少糖尿病性腎?。╠iabetic nephropathy DN）模型小鼠腎纖維化、炎癥因子表達(dá)和氧化應(yīng)激，發(fā)揮保護(hù)作用；EGCG促進(jìn)了Nrf2核轉(zhuǎn)錄但不改變其基因轉(zhuǎn)錄量，且Keap1表達(dá)不受影響；將Nrf2基因敲除后，上述保護(hù)作用消失。EGCG對(duì)高糖作用下的小鼠腎小球系膜細(xì)胞具有抗炎、抗氧化、防止纖維化作用，細(xì)胞Keap1基因經(jīng)siRNA干擾后以上作用減弱。該研究說明，EGCG能抑制Keap1活性，進(jìn)而激活Nrf2，對(duì)DN發(fā)揮保護(hù)作用。上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤轉(zhuǎn)移和組織纖維化等生物學(xué)過程密切相關(guān)。Kanlaya［22］等利用草酸鈉處理腎小管上皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞發(fā)生纖維狀改變，間充質(zhì)細(xì)胞蛋白表達(dá)增加，而上皮標(biāo)志物表達(dá)均下降。EGCG預(yù)處理通過激活Nrf2通路，增加了抗氧化酶表達(dá)，減少了細(xì)胞ROS含量，抑制間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。siRNA干擾Nrf2基因表達(dá)進(jìn)一步證實(shí)了Nrf2通路即為EGCG作用的關(guān)鍵通路。Wang等［24］研究結(jié)果表明，EGCG濃度依賴性地抑制腎小管上皮細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，以及Smad 2和Smad 3的磷酸化，并增加Nrf2的核聚積。Nrf2基因敲除后上述作用消失，說明EGCG對(duì)腎纖維化的保護(hù)作用可能是通過Nrf2通路產(chǎn)生。

3.2 呼吸系統(tǒng)疾病

EGCG減少肺組織水腫、炎癥因子和可誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)，通過上調(diào)Nrf2表達(dá)對(duì)氟化物導(dǎo)致的大鼠肺組織損傷發(fā)揮保護(hù)作用，促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，抑制炎癥因子和Keap1表達(dá)。分子對(duì)接分析發(fā)現(xiàn)，EGCG可與Keap1結(jié)合，進(jìn)而抑制其活性。該研究提示，EGCG可作為重金屬引起的敗血癥的潛在藥物［17］。EGCG同樣能改善大鼠放射性肺損傷、水腫及纖維化病變，顯著上調(diào)Nrf2，HO-1和NQO-1表達(dá)，可能的機(jī)制是通過Nrf2/ARE信號(hào)通路增加抗氧化酶的表達(dá)［24］。Sriram等［25］研究認(rèn)為，EGCG對(duì)平陽霉素（博來霉素）導(dǎo)致的肺纖維化的抗氧化和抗炎作用是通過Nrf2信號(hào)通路增強(qiáng)抗氧化作用和Ⅱ相解毒酶表達(dá)。由此可見，EGCG對(duì)肺部疾病緩解作用的主要機(jī)制是激活Nrf2/ARE通路，促進(jìn)Nrf2及下游蛋白表達(dá)。

3.3 心腦血管系統(tǒng)疾病

Bai等［26］發(fā)現(xiàn)，EGCG對(duì)中早期缺血性腦卒中模型小鼠具有保護(hù)作用，可能的途徑是EGCG激活了Nrf2信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)血管生成。該研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能使腦卒中小鼠腦梗死面積減少、血管密度增大、血管新生增多，腦神經(jīng)功能評(píng)分更高；利用MAPK/ERK抑制劑將Nrf2活化過程阻斷后，Nrf2表達(dá)減少，上述保護(hù)作用減弱。Han等［29］利用大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型發(fā)現(xiàn)，EGCG具有顯著抗氧化和神經(jīng)保護(hù)作用，能減少腦梗死面積和神經(jīng)元丟失，同時(shí)增加Nrf2和下游基因表達(dá)。同時(shí)EGCG能抑制人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖，其機(jī)制是通過激活Nrf2核轉(zhuǎn)位，增加HO-1的表達(dá)，且具有劑量和時(shí)間依賴性［28］。Yang等［29］利用激酶特異性抑制劑和基因沉默技術(shù)發(fā)現(xiàn)，EGCG通過激活p38/MAPK和ERK1/2通路上調(diào)Nrf2/HO-1表達(dá)，從而對(duì)PM2.5導(dǎo)致的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮保護(hù)作用。當(dāng)巨噬細(xì)胞暴露于腫瘤壞死因子α?xí)r，細(xì)胞呈現(xiàn)泡沫細(xì)胞狀態(tài)，而泡沫細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化的主要特征之一。EGCG預(yù)處理可緩解上述癥狀。EGCG促進(jìn)Nrf2與Keap1解離，使Nrf2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)ARE下游基因轉(zhuǎn)錄，從而抑制NF-κB；同時(shí)Keap1直接影響NF-κB調(diào)節(jié)亞單位，下調(diào)NF-κB表達(dá)。EGCG對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化同樣具有保護(hù)作用［30］。

3.4 消化系統(tǒng)疾病

乙?；蟮腅GCG能降低炎癥介質(zhì)水平，下調(diào)PI3K/Akt/NF-κB的磷酸化和調(diào)節(jié)蛋白P65的乙?；?，并通過調(diào)節(jié)ERK1/2通路和Nrf2通路增加HO-1表達(dá)，從而減輕葡聚糖硫酸酯鈉導(dǎo)致的小鼠結(jié)腸炎，并顯著降低結(jié)腸癌發(fā)?。?1］。Dong等［31］研究認(rèn)為，食物富硒時(shí)，EGCG可增加小鼠肝GR和TR含量，當(dāng)食物缺硒時(shí)，EGCG更傾向于激活肝Nrf2通路，提高NQO-1蛋白水平，增強(qiáng)硫氧還蛋白活性。也就是說，正常情況下抗氧化酶可對(duì)抗高劑量EGCG，避免Nrf2激活；缺硒時(shí)，EGCG對(duì)Nrf2為激活作用。Han等［32］研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能抑制砷化物所引起的肝病理損傷，降低ROS和丙二醛水平，減少砷化物在肝中的殘留。同時(shí)EGCG激活Nrf2信號(hào)通路，增強(qiáng)了包括Nrf2，NQO-1和HO-1在內(nèi)的通路相關(guān)基因的表達(dá)，從而減輕肝毒性。該結(jié)果表明EGCG是砷中毒可能的治療藥物。

3.5 神經(jīng)系統(tǒng)疾病

神經(jīng)系統(tǒng)富含對(duì)氧自由基敏感的不飽和脂肪酸，又相對(duì)缺乏抗氧化酶，易受氧自由基損害發(fā)生神經(jīng)退行性疾病和腦缺血損傷等。Romeo等［33］證實(shí)，EGCG能誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)元細(xì)胞HO-1表達(dá)，可能的機(jī)制是活化Nrf2，并通過該通路保護(hù)細(xì)胞免受鋅原卟啉Ⅺ所致的氧化損傷。

3.6 生殖系統(tǒng)疾病

有研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能顯著改善氟化物中毒大鼠類固醇生成酶、睪酮水平和精子功能，改善抗氧化狀態(tài)，減少睪丸病變，使炎癥因子和細(xì)胞凋亡標(biāo)志物也接近正常值。機(jī)制研究結(jié)果顯示，Nrf2及下游基因表達(dá)增強(qiáng)，而Keap1表達(dá)被抑制［34］，說明EGCG在生殖系統(tǒng)中同樣可以激活Nrf2通路。Pan等［35］研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病可導(dǎo)致小鼠睪丸重量減輕、細(xì)胞凋亡，精子數(shù)減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化損傷增加，EGCG能通過活化Nrf2使損傷減輕。Nrf2基因敲除后，睪丸損傷更為嚴(yán)重，且EGCG的緩解作用消失。提示Nrf2是EGCG緩解糖尿病所致睪丸損傷的關(guān)鍵因素。

3.7 其他

EGCG具有較強(qiáng)的抗癌作用，及時(shí)誘導(dǎo)Ⅱ相解毒酶、阻止致癌物代謝活化、增強(qiáng)細(xì)胞防御活性是EGCG重要的化學(xué)預(yù)防機(jī)制，并通過誘導(dǎo)Nrf2直接或間接參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡和細(xì)胞黏附等活動(dòng)。Nair等［36］利用Nrf2基因敲除小鼠和PC-3細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能影響前列腺癌細(xì)胞的基因表達(dá)，該作用依賴于Nrf2通路和AP-1轉(zhuǎn)錄因子的介導(dǎo)。Kilic等［37］研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能協(xié)同順鉑抑制宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減少氧化應(yīng)激，通過調(diào)控NF-kB，p65，COX-2，p-Akt和p-mTOR通路，激活Nrf2/ARE通路增強(qiáng)了順鉑對(duì)HeLa細(xì)胞的治療作用。這在三陰性乳腺癌細(xì)胞中也得到相同的結(jié)果［38］。

由樹脂單體構(gòu)建的牙科復(fù)合材料由于不完全聚合或降解產(chǎn)生ROS并消耗谷胱甘肽，可能引起接觸過敏和牙髓損傷。有假說認(rèn)為，可利用EGCG對(duì)Nrf2的激活作用，降低樹脂材料對(duì)人體損傷，是未來EGCG的應(yīng)用方向之一［39］。破骨細(xì)胞會(huì)影響牙齒正畸效果，破骨細(xì)胞分化因子是誘導(dǎo)破骨細(xì)胞發(fā)育和發(fā)揮功能的細(xì)胞因子，而ROS是激發(fā)該因子的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子。Kanzaki等［40］利用萊菔硫烷和EGCG作為Nrf2激活劑，清除ROS，抑制畸形牙的復(fù)發(fā)。

Zhu等［41］發(fā)現(xiàn)，EGCG能減輕X線對(duì)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的損傷，提高細(xì)胞存活率，降低線粒體損傷，減少細(xì)胞凋亡，減少ROS和DNA雙鏈斷裂。敲除基因或使用抑制劑將HO-1阻斷后，EGCG的保護(hù)作用明顯減弱，說明HO-1在上述過程中具有重要作用。Nrf2/ARE通路是HO-1的上游通路，推測(cè)該保護(hù)作用可能與之相關(guān)。

在抗病毒方面，Zhang等［42］發(fā)現(xiàn)，Nrf2信號(hào)通路是EGCG阻止Tat轉(zhuǎn)錄反式激活因子引導(dǎo)的HIV-1轉(zhuǎn)錄的首要靶通路，同時(shí)EGCG還可抑制AKT通路并激活A(yù)MPK通路，最終降低NF-κB的活性。EGCG能抑制流感病毒侵入人鼻上皮細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，敲除Nrf2基因后這種抑制作用消失，說明EGCG通過Nrf2對(duì)流感病毒發(fā)揮作用［43］，為阻止病毒侵入提供了新的思路。

EGCG對(duì)于控制血糖同樣有效。與對(duì)照組相比，高脂飲食小鼠腹腔注射EGCG后的體質(zhì)量增加量、血糖和胰島素水平、肝和腎的質(zhì)量均顯著降低。EGCG能抑制血漿和肝中晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體的表達(dá)，并激活Nrf2，增加還原型與氧化型谷胱甘肽的比例，從而控制血糖、降低體質(zhì)量，減輕糖尿病并發(fā)癥［44］。

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesenchymal stem cells，hMSC）具有可塑性高、免疫反應(yīng)小和制備容易等特點(diǎn)，有較大的細(xì)胞治療潛力。ROS過多時(shí)，hMSC會(huì)發(fā)生細(xì)胞衰老，可用性降低。Shin等［45］將hMSC置于H2O2造成的高ROS環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)衰老細(xì)胞數(shù)增加，乙?；痯53和p21表達(dá)顯著增多；而EGCG預(yù)處理可以預(yù)防H2O2造成的細(xì)胞衰老。細(xì)胞Nrf2基因被敲除后，EGCG失去抗氧化作用，此時(shí)盡管經(jīng)過了EGCG預(yù)處理，細(xì)胞p53和p21仍表現(xiàn)出較高的乙?；痯53和p21水平。該研究提示，Nrf2通路和抑癌蛋白p53/p21與EGCG預(yù)防hMSC細(xì)胞衰老有關(guān)，Nrf2是EGCG發(fā)揮作用的關(guān)鍵通路。

4 結(jié)語

眾多研究證實(shí)，EGCG對(duì)Nrf2/ARE具有激活作用，可能是多種機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果，涉及抗氧化、抗炎等多種機(jī)制，因此需要開展多通路研究，深入闡明其機(jī)制。以上證據(jù)表明，EGCG在全身各系統(tǒng)中對(duì)Nrf2/ARE的通路均具有一定激活作用，但這種激活作用在各組織間是否存在特異性尚未明確。有研究分別在肝和小腸中發(fā)現(xiàn)了671個(gè)和288個(gè)受EGCG調(diào)控的依賴于Nrf2的基因，這種差異可能與Nrf2主要調(diào)控解毒酶和抗氧化酶的表達(dá)有關(guān)，而肝是最主要的解毒器官［46］。

目前EGCG的藥理學(xué)研究主要是細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，僅有的臨床試驗(yàn)證實(shí)了EGCG具有抗癌功效，但尚未對(duì)抗癌機(jī)制進(jìn)行深入探討。而EGCG抗氧化、抗炎和通路激活等其他生物學(xué)功效尚未在人體得到證實(shí)，因此臨床試驗(yàn)將是下一步研究的重點(diǎn)。目前主要面臨的未明確問題有：①EGCG在人體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)尚未明確，這是臨床試驗(yàn)亟待解決的問題。②體外實(shí)驗(yàn)濃度通常為20～100 μmol·L-1，而人口服EGCG保健膠囊后的血藥峰濃度僅為 7.5 μmol·L-1［47］，臨床試驗(yàn)給藥量也僅為10～20 mg·kg-1，血藥濃度僅為體外實(shí)驗(yàn)的1/10，生物學(xué)效應(yīng)減弱，這種濃度差異是臨床試驗(yàn)中值得注意的問題。③EGCG存在低發(fā)生率的肝毒性，且與性別有關(guān)，可能與綠茶提取物中或制劑中的其他成分有關(guān)［48］，也有研究認(rèn)為是高劑量EGCG會(huì)自氧化產(chǎn)生ROS，對(duì)Nrf2及下游蛋白雖有激活作用，但依舊大量消耗肝中HO-1和NQO-1等解毒酶，使其他組織暴露在高ROS環(huán)境中，從而產(chǎn)生損傷［49］，因此應(yīng)對(duì)毒副作用進(jìn)行充分評(píng)估。

EGCG胃腸道通透性差，生物利用度較低，在小鼠和大鼠體內(nèi)的生物利用率分別為26.5%和1.6%，且其酚羥基在中性或堿性條件下易發(fā)生去質(zhì)子化作用而迅速分解，發(fā)生甲基化、糖酯化、磺化等生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，存在體內(nèi)不穩(wěn)定、脂溶性差、吸收率低等問題，影響生物活性。為了提高利用率，有研究嘗試對(duì)EGCG進(jìn)行化學(xué)修飾，修飾位點(diǎn)主要是酚羥基、D環(huán)羥基和苯環(huán)上的氫原子，已證實(shí)乙?；疎GCG與EGCG相比具有更高效的防止結(jié)腸病變和減少淋巴結(jié)節(jié)的作用［31］；也有研究對(duì)EGCG進(jìn)行物理改性，如利用納米化、微膠囊等方法，在保留原有生物活性的基礎(chǔ)上改善理化性質(zhì)，提高生物利用度，擴(kuò)寬了EGCG應(yīng)用范圍，是EGCG開發(fā)方向之一［50］。

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