神龍抗栓膠囊微生物限度檢查法的驗證

王麗麗 楊麗霞

（1 大連蛇島醫(yī)院，遼寧 大連 116041；2 大連市旅順口區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，遼寧 大連 116041）

神龍抗栓膠囊微生物限度檢查法的驗證

王麗麗1楊麗霞2

（1 大連蛇島醫(yī)院，遼寧 大連 116041；2 大連市旅順口區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，遼寧 大連 116041）

目的建立神龍抗栓膠囊微生物限度檢查法。方法按中國藥典2015版采用增加稀釋液的方法進(jìn)行方法學(xué)驗證。結(jié)果采用增加稀釋液的方法，需氧菌檢查中所要求的各實驗菌樣品中的回收率均達(dá)到50%以上。結(jié)論神龍抗栓膠囊所采用的檢驗方法可以消除制劑的抑菌作用，有效檢出污染的微生物。

神龍抗栓膠囊；微生物限度檢查法；回收率

神龍抗栓膠囊是大連蛇島醫(yī)院醫(yī)院的特色制劑，其主要由水蛭、牛黃、紅花、川芎、當(dāng)歸及蛇毒提取物組成，有活血化瘀，疏通經(jīng)絡(luò)的功效。主要用缺血性中風(fēng)恢復(fù)期、后遺癥期，屬于淤血阻絡(luò)者。神龍抗栓膠囊含有抑菌的藥物成分，在微生物限度檢測前需對其抑菌作用進(jìn)行抑制或消除，檢查結(jié)果才能代表制劑中實際污染的微生物數(shù)量[1]。

1 儀器與材料

1.1 儀器：超凈工作臺（生產(chǎn)商為蘇州凈化設(shè)備有限公司），手提式壓力蒸汽滅菌器（生產(chǎn)商為上海三申醫(yī)療器械有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（生產(chǎn)商為上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）。

1.2 菌種：檢測所用到的菌種分別為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌。

1.3 培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，腸道菌增菌液體培養(yǎng)基，紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，麥康凱液體培養(yǎng)基，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基，木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基，三鐵糖瓊脂培養(yǎng)基均由北京三藥提供。

1.4 樣品：神龍抗栓膠囊（批號：20160411，20160413，20160418）。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗菌液制備：將新培養(yǎng)出來的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、乙型副傷寒沙門菌和大腸埃希菌，用濃度為0.9%的氯化鈉溶液調(diào)制為濃度合適的菌懸液；將新培養(yǎng)出來的黑曲霉混入濃度為0.9%的氯化鈉溶液5 mL當(dāng)中，用無菌試管將篩選好的孢子裝好，再用濃度為0.9%的氯化鈉溶液調(diào)制為濃度合適的黑曲霉孢子懸液。

2.2 調(diào)制供試液：量取10克的供試品，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100 mL，混勻，制成1∶10的供試液。

2.3 計算回收率

2.3.1 常規(guī)方法預(yù)試驗測定：①試驗組：選取已調(diào)制好的供試液，注入待用試驗菌液當(dāng)中，使每1 mL供試液中含菌量不大于100 cfu，混勻，取1 mL注入平皿中。加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)平皿，放入胰酪大豆胨瓊脂作為培養(yǎng)基，保持生長溫度為30～35 ℃，培養(yǎng)時間為3 d，統(tǒng)計數(shù)量。將白色念珠菌、黑曲霉的培養(yǎng)平皿放入胰酪大豆胨瓊脂作為培養(yǎng)基，30～35 ℃培養(yǎng)5 d；傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，20～25 ℃培養(yǎng)5 d，計數(shù)。每個試驗組制備2個平皿。②菌液組：統(tǒng)計每個菌株試驗菌的變化數(shù)量。③供試品對照組：選取已調(diào)制好的1 mL供試液，根據(jù)菌落計數(shù)方法檢測供試品的基本菌數(shù)。表明：神龍抗栓膠囊無法抑制白色念珠菌和黑曲霉的生長，對銅綠假單胞菌及枯草芽孢桿菌的抑制作用較強(qiáng)。應(yīng)選擇合適的方法消除其在檢驗條件下對這兩種菌的抑制作用，提高微生物的檢出率。2.3.2 增加需氧菌稀釋液的方法測定：①試驗組：取上述供試液，稀釋至1∶100，加入已制備好的試驗菌液，使每1 mL供試液中含菌量不大于100 cfu，混勻，取1 mL注入平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基。加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的試驗平皿30～35 ℃培養(yǎng)3 d，加入白色念珠菌、黑曲霉的試驗平皿，30～35 ℃培養(yǎng)5 d；②菌液組：測定每一菌株所加的試驗菌數(shù)。③供試品對照組：取上述供試液1 mL，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)[2]。得知，增加需氧菌稀釋液可以讓試驗組的回收率在50%以上，表示使用增加需氧菌稀釋液的方法能夠抵制供試品的抑菌效果。因此需氧菌數(shù)的測定可以采用增加稀釋液的方法。

2.4 控制菌檢查方法的驗證：①試驗組：取上述1∶10供試液，及已制備好的試驗菌液，接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，使每1 mL試驗液中含菌量不大于100 cfu，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行。②陰性對照組：以稀釋劑代替供試液照相應(yīng)大腸菌群檢查法進(jìn)行。③陽性對照組：以試驗菌液代替供試液照相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行，對照菌的加量應(yīng)不大于100 cfu。使用控制菌的常規(guī)驗證方法表示陽性對照的控制菌生長情況好，陰性對照的控制菌沒有生長。說明了控制菌檢查法具有專一性，因此，神龍抗栓膠囊的控制菌檢查可以采用常規(guī)法。

3 討 論

藥品的微生物限度檢查，應(yīng)根據(jù)藥品的性質(zhì)選用適宜的一種或幾種方法進(jìn)行驗證[3]，神龍抗栓膠囊的成分中，有一定的抑菌作用，因此在檢查前，要首先消除藥物的抑菌性。在之前的檢查中，經(jīng)過驗證，神龍抗栓膠囊的微生物計數(shù)法檢查采用培養(yǎng)基稀釋法[4]（即取1 mL供試液分別加到5個培養(yǎng)皿中，計5個培養(yǎng)皿的菌落數(shù)總和）；考慮到微生物生長的特殊性，在2015版藥典中，將微生物計數(shù)法試驗中的回收率調(diào)整為50%，以及藥品是中藥原粉，取樣存在不均勻性；因此，采用了增加稀釋液的方法。結(jié)果表明采用增加稀釋液的方法，可以使試驗菌在需氧菌的檢查驗證試驗中的回收率達(dá)到50%以上，方法可行。

[1] 中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M].北京:中國科學(xué)技術(shù)出版社,2005:325-358.

[2] 中國藥典.2015年版[S].四部.中國醫(yī)藥科技出版社,2015:142-143.

[3] 張敏.保婦康栓微生物限度檢查法的驗證[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2009,15(1):22-23.

[4] 馬緒榮,蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗手冊[M].北京:科學(xué)出版社,2000:60.

R282.710.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1671-8194（2017）30-0024-02