牛腸道病毒的病原學(xué)特征及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國(guó)，張 穎，劉吉山，沈志強(qiáng)

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

綜述與專論

牛腸道病毒的病原學(xué)特征及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國(guó)，張 穎，劉吉山，沈志強(qiáng)

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

牛腸道病毒（BEV）感染為國(guó)內(nèi)近年來(lái)的新發(fā)傳染病，在牛群中普遍存在，且常與其他病原體發(fā)生混合感染和繼發(fā)感染，導(dǎo)致牛群出現(xiàn)較高的死亡率，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。文章概述了牛腸道病毒的病原學(xué)特征及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展，以期為預(yù)防和控制該疾病提供參考。

牛腸道病毒；病原學(xué)；檢測(cè)；進(jìn)展

牛腸道病毒感染是由小RNA病毒科腸道病毒屬的牛腸道病毒（bovine enterovirus，BEV）引起的一種臨床上以發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、腹瀉和繁殖障礙為主要特征的傳染病。本病在我國(guó)為新發(fā)傳染病，在牛群中非常普遍，且常與其他病原體發(fā)生混合感染和繼發(fā)感染，導(dǎo)致牛群出現(xiàn)較高的死亡率，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，采取有效措施預(yù)防和控制BEV感染對(duì)于確保養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展非常重要。本文對(duì)牛腸道病毒的病原學(xué)特征及其檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了概述，以期為預(yù)防和控制此病提供參考。

1 牛腸道病毒的由來(lái)和發(fā)現(xiàn)

Moll等［1］于 1959 年首次報(bào)道了牛腸道病毒（BEV），之后許多國(guó)家也陸續(xù)報(bào)道了本病的暴發(fā)與流行情況。2011年李英利等［2］從內(nèi)蒙古發(fā)生腹瀉的犢牛體內(nèi)分離出1株腸道病毒，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該毒株為F種腸道病毒，進(jìn)而首次確定了我國(guó)存在F型牛腸道病毒感染。彭曉薇等［3］從北京發(fā)生嚴(yán)重腹瀉的泌乳奶牛中也分離獲得了F型腸道病毒。侯佩莉等［4］經(jīng)過(guò)一系列病毒鑒定方法最終從泌乳奶牛的糞便中也分離出一株F型牛腸道病毒。邢澤黎等［5］從發(fā)病嚴(yán)重致死的肉牛體內(nèi)分離得到E型腸道病毒。張海麗等［6］從山西發(fā)生嚴(yán)重腹瀉的泌乳奶牛中也分離獲得E型腸道病毒。BEV多從發(fā)生嚴(yán)重呼吸道癥狀、消化道癥狀和繁殖系統(tǒng)障礙的病牛體內(nèi)分離獲得。該病在世界各國(guó)牛群中較為常見(jiàn)，感染率達(dá)17.6%～80.0%。感染此病毒可引起牛下痢和呼吸道癥狀，食欲下降，嚴(yán)重的還有便血，產(chǎn)奶量大幅下降，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)本病的發(fā)生與流行有逐漸升高的趨勢(shì)。

2 病毒的形態(tài)及分類地位

牛腸道病毒的病毒粒子外觀呈球形、正二十面體、無(wú)包膜、大小在25～30 nm之間，其基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，全長(zhǎng)7.5 kb。根據(jù)最新病毒分類，牛腸道病毒與人脊髓灰質(zhì)炎病毒、人柯薩奇病毒和豬腸道病毒等同屬小RNA病毒科腸道病毒屬中的成員。該屬病毒包括 A、B、C、D、E、F、G、H、J九個(gè)腸道病毒種及 A、B、C三個(gè)鼻病毒種，其中腸道病毒E和F種屬于牛腸道病毒。E 種包括 E1～E4，F(xiàn) 種包括 F1～F6。

3 病毒的流行病學(xué)特點(diǎn)

牛腸道病毒感染符合腸道病毒屬病毒感染的普遍規(guī)律：一種綜合征可由不同腸道病毒所引起，同一種（型）腸道病毒可以導(dǎo)致不同綜合征；感染腸道病毒后多數(shù)為亞臨床表現(xiàn)（有超過(guò)90%的感染牛無(wú)癥狀），不易被發(fā)現(xiàn)；普遍分布于世界各地，感染廣泛存在，并且常引起暴發(fā)；在環(huán)境中非常穩(wěn)定，能在環(huán)境中存活很長(zhǎng)時(shí)間。牛腸道病毒的病原性并不明顯，但由于其有時(shí)會(huì)侵犯其他器官而導(dǎo)致臨床上各種綜合征的出現(xiàn)。牛腸道病毒的感染宿主較廣，包括牛、羊、馬、犬、羊駝等動(dòng)物。

4 病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

4.1 病毒的分離培養(yǎng)

病毒分離與鑒定是檢測(cè)BEV感染的金標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室常采用MDBK細(xì)胞進(jìn)行病毒分離試驗(yàn)。采集的樣品處理后，接種MDBK細(xì)胞培養(yǎng)，觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE），并對(duì)其核酸進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，確定是否存在BEV感染。病毒分離與鑒定是BEV最可靠的檢測(cè)方法，但其費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，技術(shù)人員也需要經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的培訓(xùn)。

4.2 血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)

1989年Zhang等［7］建立了捕獲ELISA法來(lái)檢測(cè)血清中的BEV抗體。此法具有敏感性強(qiáng)、特異性高的特點(diǎn)，更重要的是比血清中和試驗(yàn)（SN）更經(jīng)濟(jì)。1990年Zhang等［8］又建立了阻斷ELISA法檢測(cè)牛血清中的BEV抗體，該方法與傳統(tǒng)SN法相比敏感性高，而且耗時(shí)短，可替代傳統(tǒng)SN法用于大規(guī)模牧場(chǎng)的抗體檢測(cè)。郭金玉等［9］利用北京某牛場(chǎng)BEV-2型分離毒株的VP1蛋白構(gòu)建了檢測(cè)BEV抗體的間接ELISA方法，此法操作比較簡(jiǎn)單、快速、使用價(jià)值比較高。朱彤等［10］通過(guò)擴(kuò)增BEV的VP2基因并進(jìn)行一系列的轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá)、純化出重組蛋白，制備了較高效價(jià)的多克隆抗體，為BEV的血清學(xué)診斷方法的建立及亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。周萍萍［11］將純化好的3D蛋白作為包被抗原，建立了BEV-3D-ELISA方法，應(yīng)用該方法對(duì)哈爾濱市送檢的425份奶牛血清進(jìn)行了檢測(cè)，陽(yáng)性率高達(dá)41.41%。蓋小春［12］應(yīng)用表達(dá)純化的E種腸道病毒HY12 VP2重組蛋白作為包被抗原，建立了檢測(cè)E種腸道病毒抗體的間接ELISA方法，并對(duì)實(shí)驗(yàn)感染小鼠抗體消長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行了研究，為本病的免疫機(jī)理和疫苗研制打下基礎(chǔ)。邢澤黎等［13］應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)純化的E種腸道病毒HY12的VP1和VP2重組蛋白制備了抗體，并建立了檢測(cè)BEV病原的雙抗體夾心ELISA方法，對(duì)吉林省不同地區(qū)的牛群感染BEV進(jìn)行了病原流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)調(diào)查地區(qū)牛群的BEV感染率為8.16%～58.70%。雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)糞便中的BEV抗原的方法，可以快速、有效地確定牛群是否存在BEV感染，將為新發(fā)生BEV感染牛的防控和牛群的凈化提供了有效的技術(shù)手段。

4.3 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

4.3.1 RT-PCR 技術(shù) Jimenez-Clavero等［14］針對(duì) BEV 5′UTR基因建立了RT-PCR方法，并對(duì)西班牙多個(gè)地區(qū)的牛、綿羊、山羊、驢、馬以及地表水樣進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，除了在驢的檢測(cè)樣本中未檢測(cè)到外，其余均有陽(yáng)性樣本存在。Nathamon 等［15］也根據(jù) 5′UTR 基因設(shè)計(jì)引物建立了RT-PCR方法，并對(duì)泰國(guó)部分地區(qū)的本地牛、印度牛及山羊攜帶BEV的感染率進(jìn)行了調(diào)查和分析，結(jié)果表明，以上幾種動(dòng)物均有BEV的攜帶，其中本地牛攜帶率最高，為76%。吳丹等［16］根據(jù)口蹄疫病毒（FMDV）和BEV基因的5′UTR保守基因區(qū)域分別設(shè)計(jì)引物，首次建立了同時(shí)檢測(cè)FMDV和BEV的雙重RT-PCR快速檢測(cè)方法，對(duì)FMDV的最低檢出限為8 TCID50/0.1mL，對(duì)BEV的最低檢出限為2 TCID50/0.1mL。采用該方法檢測(cè)了852份臨床樣品，并與病毒分離方法比較，結(jié)果兩種方法檢測(cè)結(jié)果完全一致。侯佩莉等［17］針對(duì)BEV非結(jié)構(gòu)蛋白3D基因設(shè)計(jì)引物建立了RT-PCR方法，敏感度高達(dá)10-1TCID50。侯佩莉等［18］根椐牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛冠狀病毒（BCoV）和BEV基因的保守序列，設(shè)計(jì)合成引物，在建立單一病毒RT-PCR檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化條件，建立了上述3種病毒的多重RT-PCR方法，對(duì)24份臨床腹瀉病料進(jìn)行了檢測(cè)，與單項(xiàng)RTPCR的符合率100%。該多重RT-PCR鑒別診斷方法對(duì)牛腹瀉性疾病病因的確診、流行病學(xué)調(diào)查和防控具有重要意義。

4.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR技術(shù) 吳丹等［19］根據(jù)5′UTR基因設(shè)計(jì)引物建立了檢測(cè)BEV的TaqMan熒光定量RT-PCR方法，對(duì)BEV的最小檢測(cè)量為0.1 TCID50/0.1 mL。對(duì)北京周邊地區(qū)牛群采集的852份臨床樣本進(jìn)行了檢測(cè)，且與分離病毒法進(jìn)行了敏感性比較，結(jié)果表明，該方法檢出陽(yáng)性樣本與病毒分離法檢出的一致，但敏感性比病毒分離法高10倍。朱彤等［20］根據(jù)BEV 3D基因設(shè)計(jì)引物建立了檢測(cè)BEV的SYBR Green I熒光定量RTPCR 方法，敏感度達(dá) 7.13×101拷貝/μL，是常規(guī) RT-PCR的10倍。應(yīng)用該方法檢測(cè)了3個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)送檢的41份奶牛腹瀉樣本和3份氣溶膠樣本，腹瀉樣品陽(yáng)性檢出率39.02%（16/41）；3份氣溶膠樣本均為陽(yáng)性。說(shuō)明SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法具有特異、穩(wěn)定、高效的優(yōu)點(diǎn)，既可以用于臨床檢測(cè)，又可對(duì)環(huán)境中的BEV進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，為BEV流行病學(xué)調(diào)查、診斷提供了有力的技術(shù)支持。

5 小結(jié)

BEV感染在世界范圍內(nèi)流行，由于其所引起的臨床癥狀與其他病原體（如BVDV、BCoV等）所引起的疾病癥狀非常相似，僅從臨床上進(jìn)行診斷很容易造成誤診，致使病情加重，甚至威脅到生命安全。能夠及早確診所感染的病毒及類型，對(duì)于及時(shí)撲滅疫情，控制疫病的傳播具有重要作用。目前，我國(guó)對(duì)牛腸道疾病的診斷和防治還很薄弱，完善該病的診斷技術(shù)及研發(fā)亞單位疫苗對(duì)我國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)具有重大意義。

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《中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué)》對(duì)優(yōu)秀稿件實(shí)行數(shù)字優(yōu)先出版通告

《中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué)》是由農(nóng)業(yè)部主管、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所主辦的國(guó)家級(jí)畜牧類學(xué)術(shù)期刊，其前身為《中國(guó)養(yǎng)羊》、《草與畜雜志》和《中國(guó)草食動(dòng)物》。本刊2011年被《美國(guó)化學(xué)文摘》(CA)收錄，曾榮獲中國(guó)科技論文在線優(yōu)秀期刊二等獎(jiǎng)、第三屆和第四屆全國(guó)優(yōu)秀農(nóng)業(yè)學(xué)術(shù)期刊二等獎(jiǎng)、第四屆全國(guó)畜牧獸醫(yī)優(yōu)秀期刊二等獎(jiǎng)，先后被評(píng)為全國(guó)中文核心期刊、中國(guó)農(nóng)業(yè)核心期刊、中國(guó)科技核心期刊和RCCSE中國(guó)核心學(xué)術(shù)期刊?！吨袊?guó)草食動(dòng)物科學(xué)》為中國(guó)科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫(kù)（CSCD）、中國(guó)科技論文與引文數(shù)據(jù)庫(kù)、中國(guó)學(xué)術(shù)期刊綜合評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫(kù)（CAJCED）和中國(guó)生物學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)等的統(tǒng)計(jì)源期刊；是《中國(guó)核心期刊（遴選）數(shù)據(jù)庫(kù)》、《萬(wàn)方數(shù)據(jù)－數(shù)字化期刊群》、《中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)(CJFD)》、《中國(guó)生物學(xué)文摘》、《中國(guó)生物學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)》、臺(tái)灣《CEPS中文電子期刊》、中國(guó)科技論文在線來(lái)源期刊和收錄期刊。優(yōu)先出版稿件的條件：①國(guó)家“973”、“863”項(xiàng)目資助論文；②國(guó)家級(jí)及省級(jí)科學(xué)基金項(xiàng)目資助論文；③海外聯(lián)合基金資助論文；④有重大臨床意義的病例報(bào)告；⑤創(chuàng)新研究結(jié)果的首報(bào)。

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Progress in the Pathogenic Characteristics of the Bovine Enterovirus and Its Detection Techniques

Zhuang Jinqiu，Mei Jianguo，Zhang Ying，et al
（Binzhou Academy of Animal Scienceamp;Veterinary Medicine，Binzhou 256600，Shandong，China）

Bovine enterovirus（BEV）infection is a new infectious disease.It has been prevalent in the herd in China in recent years，and often has mixed with other pathogens infection and secondary infection.It often results in high mortality of cattle，causes huge economic losses to the cattle industry.In this paper，the research progress in the pathogenic characteristics and detection techniques of bovine enterovirus was summarized in order to provide reference for its prevention and control.

bovine enterovirus；etiology；detection；progress

S852.653

A

2095-3887（2017）06-0049-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.06.014

2017-06-30

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2015GSF121027）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系牛產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-09-12）

莊金秋（1978-），女，副研究員，碩士，主要從事細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物用病毒疫苗研制工作。