西羅莫司和環(huán)孢素對常染色體隱性遺傳性多囊腎病大鼠疾病進(jìn)展過程的影響*

王 碩 宋一萌 侯小飛 陸 敏 沈偉偉 吳 敏 李由昭 馬潞林

(北京大學(xué)第三醫(yī)院泌尿外科，北京 100083)

·實驗研究·

西羅莫司和環(huán)孢素對常染色體隱性遺傳性多囊腎病大鼠疾病進(jìn)展過程的影響*

王 碩 宋一萌 侯小飛**陸 敏①沈偉偉②吳 敏③李由昭 馬潞林

(北京大學(xué)第三醫(yī)院泌尿外科，北京 100083)

目的 觀察西羅莫司和環(huán)孢素(cyclosporin,CsA)對常染色體隱性遺傳性多囊腎病(autosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD) 大鼠疾病進(jìn)程的影響。 方法 20只4周齡ARPKD模型PCK大鼠，雌雄各半，采用成組設(shè)計隨機分為西羅莫司組(n=6)、環(huán)孢素組(n=8)和對照組(n=6)，分別每天以西羅莫司稀釋液、環(huán)孢素稀釋液和無藥物的飲用水灌胃，每周測體重，分別于4、6、8、10周齡內(nèi)眥靜脈取血監(jiān)測腎功能，分別在4、8、12周齡行雙腎超聲觀察囊腫數(shù)量及大小，12周齡時全部處死，取雙腎稱重，并行切片HE染色觀察囊腫體積密度(cyst volume density，CVD)。 結(jié)果 3組大鼠實驗過程中均無死亡，體重均增加，但3組間無顯著差異(P>0.05)。12周齡時西羅莫司組超聲下腎臟體積、腎臟內(nèi)囊腫數(shù)和最大囊腫最大截面面積均明顯低于對照組[(1.65±0.25)cm3vs. (2.00±0.36) m3，q=3.426，P<0.05；(31.75±6.57)個 vs.(43.08±10.28)個，q=3.638，P<0.05；(0.0828±0.0420)cm2vs. (0.1373±0.0536)cm2，q=3.966，P<0.05]；環(huán)孢素組超聲下腎臟體積、腎臟內(nèi)囊腫數(shù)和最大囊腫最大截面面積與對照組無顯著差異(P>0.05)。西羅莫司組、環(huán)孢素組和對照組在雙腎質(zhì)量、雙腎質(zhì)量/體重比(2-kidney/total body weight ratio，2K/TBW)、10周齡時血清BUN和Cr以及CVD均無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論 西羅莫司和CsA對PKD大鼠疾病的進(jìn)程未表現(xiàn)出明顯的影響。

常染色體隱性遺傳性多囊腎?。?PCK大鼠； 西羅莫司； 環(huán)孢素； 雌二醇

多囊腎病(polycystic kidney disease, PKD)是一組常見的單基因遺傳病，根據(jù)遺傳方式不同，可分為常染色體顯性遺傳性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)和常染色體隱性遺傳性多囊腎病(autosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD )。ADPKD多在成年后發(fā)病，發(fā)病率為1/1000～1/400；ARPKD多見于嬰兒和兒童，發(fā)病率在1/40 000～1/20 000[1]，多數(shù)早年夭折，很少存活至成年，且常伴有先天性肝纖維化的為主的肝功能損害。目前認(rèn)為ADPKD大致分為2型，致病基因分別為PKD1基因和PKD2基因，分別產(chǎn)生多囊蛋白-1和多囊蛋白-2；而ARPKD的致病基因為PKHD1基因，該基因編碼一種分布廣泛的膜內(nèi)在蛋白(fibrocystin/polyductin，F(xiàn)PC)[2]。相較于ADPKD，有關(guān)ARPKD的研究很少。與ADPKD一樣，目前尚無有效治療方法，往往進(jìn)展到終末期腎病需要長期透析或腎移植。

既往ADPKD研究所用的動物模型，多為Han: SPRD大鼠模型，是目前研究PKD方面了解和應(yīng)用最多的動物模型，其疾病特征與人類ADPKD相似，但是尚未明確發(fā)現(xiàn)類似PKD1或PKD2基因的同源基因。對于ARPKD，常用的是PCK(polycystic kidney)大鼠，它因存在點突變(IVS35-2A→T)，導(dǎo)致翻譯過程中跳過外顯子36并發(fā)生一次移碼突變，最終形成一個人類PKHD1基因的同源基因，也即Pck基因[3]，使其成為一個優(yōu)秀的人類ARPKD模型[4，5]。

西羅莫司(sirolimus)是一種腎移植術(shù)后常用的免疫抑制劑，屬哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抑制劑，被報道為有抑制Han: SPRD大鼠的腎小管上皮細(xì)胞異常增殖作用，從而可以減緩疾病的發(fā)展[6，7]。環(huán)孢素(cyclosporin A，CsA)同樣是一種腎移植術(shù)后常用免疫抑制劑，屬鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(calcineurin inhibitor, CNI)，對于某些細(xì)胞亦具有一定的抑制增殖作用[8～10]。因ARPKD相關(guān)的肝纖維化進(jìn)展為終末期肝病而進(jìn)行肝移植后，多囊腎引起的癥狀如腰痛、血尿、高血壓等有所改善，考慮與免疫抑制劑環(huán)孢素可能有關(guān)[11]。本實驗探討西羅莫司和CsA對PCK大鼠疾病進(jìn)程的影響，為ARPKD的藥物治療探索方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

PCK大鼠購自美國Charles River公司，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部清潔級動物房飼養(yǎng)、繁殖。實驗流程經(jīng)北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會認(rèn)可。大鼠自由無限制攝食標(biāo)準(zhǔn)鼠糧和水。

1.2 實驗藥品

西羅莫司口服液(賽莫司)購自杭州中美華東制藥有限公司，規(guī)格為50 ml∶50 mg。CsA注射液(山地明)購自北京諾華制藥有限公司，規(guī)格為5 ml∶250 mg。

1.3 動物分組與處理

取20只4周齡PCK大鼠，10只雄性大鼠(體重161～196 g，平均182.0 g)、10只雌性大鼠(體重161～196 g，平均152.2 g)，隨機分成西羅莫司組(n=6)、環(huán)孢素組(n=8)和對照組(n=6)，雌雄各半。稱體重、眼眶靜脈取血測BUN、Cr。為保證灌胃藥品體積一致，將西羅莫司口服液用大鼠飲用水稀釋至1 ml∶0.2 mg，將CsA注射液用大鼠飲用水稀釋至1 ml∶5 mg。然后西羅莫司組按0.2 mg·kg-1·d-1劑量每天灌胃西羅莫司溶液1次；環(huán)孢素組按5 mg·kg-1·d-1劑量每天灌胃CsA溶液1次；對照組按1 mg·kg-1·d-1每天灌胃大鼠飲用水1次。 觀查大鼠生存狀況，每1周重復(fù)測體重，每2周(4、6、8、10周齡)眼眶取血1次測血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)，每4周注射2%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉大鼠，行雙腎超聲檢查，記錄每只大鼠雙腎的長徑、橫徑及矢狀徑，可探及的囊腫數(shù)，最大囊腫的長徑和短徑。12周齡時全部處死，注射2%戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉大鼠，取出雙腎去除腎臟包膜，稱量雙腎質(zhì)量，為減少體重差異的影響，計算并比較雙腎質(zhì)量/體重比(2K/TBW)。大鼠腎組織切片經(jīng)4 %磷酸緩沖多聚甲醛溶液固定，乙醇系列脫水，并包埋在石蠟中，備組織學(xué)觀察用。

1.4 超聲檢查

2D超聲檢查均在我院超聲科完成，測量者事先未知每只大鼠的分組與用藥情況，屬于單盲操作。長徑定義為冠狀面上的最大高度H，橫徑為冠狀面上的最大寬度W，矢狀徑為水平面上的最大厚度E。根據(jù)橢球公式可得出腎體積V的近似值，即：V=H×E×D×π/6，這種測量和計算方式被證明可以很好地評估腎臟體積[12，13]。

1.5 組織學(xué)

利用HE染色的切片計算囊腫體積密度(cyst volume density，CVD)，測量者事先未知每只大鼠的分組與用藥情況，使用數(shù)點法[14]。為減少選擇偏倚，從腎門處90°、180°、270°選取腎皮質(zhì)，以防止區(qū)域選擇偏差。

1.6 血生化

眼眶靜脈取血(采用內(nèi)眥取血法抽取大鼠靜脈血)，促凝管收集后4 ℃下分離(3000 r/min，10 min)血清，冰浴下立即送我院檢驗科，測量BUN、Cr 2個指標(biāo)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況和CVD的比較

3組20只PCK大鼠實驗過程中均無死亡，也無明顯衰弱跡象。3組PCK大鼠攝食量和攝水量均無明顯差異；體重均增加，但3組間無顯著差異(P>0.05)。3組CVD無統(tǒng)計學(xué)差異(表1)。

2K/TBW：雙腎質(zhì)量/體重比；CVD：囊腫體積密度

2.2 超聲下腎臟體積、腎臟內(nèi)囊腫數(shù)、最大囊腫最大截面面積的比較

3組大鼠在4、8、12周齡3次超聲測量中腎臟體積、腎臟內(nèi)囊腫數(shù)、最大囊腫最大截面面積均進(jìn)行性增加，且3組4、8周齡時超聲結(jié)果無顯著差異。12周齡時西羅莫司組腎臟體積比對照組減少17.5%(P<0.05)，腎臟內(nèi)囊腫數(shù)比對照組減少26.3%(P<0.05)，最大囊腫最大截面面積比對照組減少39.7%(P<0.05)。環(huán)孢素組與對照組此3項比較無顯著差異(P>0.05)，見表2。

2.3 血清BUN、Cr

3組大鼠血清4、6、8、10周齡BUN均無統(tǒng)計學(xué)差異。6周齡時環(huán)孢素組血清Cr比對照組增加11.7%(P<0.05)，其余時間無顯著差異(表3)。

2.4 雌雄分別比較

為探討2種藥物在不同性別PCK大鼠中的影響，我們將西羅莫司組(n=6)、環(huán)孢素組(n=8)和對照組(n=6)中的雌雄鼠研究結(jié)果分開進(jìn)一步探討，分為西羅莫司M組(n=3)、西羅莫司F組(n=3)、環(huán)孢素M組(n=4)、環(huán)孢素F組(n=4)、對照M組(n=3)和對照F組(n=3)。雄性3個組大鼠雙腎質(zhì)量、2K/TBW、超聲下腎臟體積、腎臟內(nèi)囊腫數(shù)、最大囊最大截面面積，血清BUN、Cr和CVD等均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，在此不列表。

西羅莫司F組和環(huán)孢素F組大鼠雙腎質(zhì)量、2K/TBW均明顯低于對照F組(P<0.05)，但西羅莫司F組與環(huán)孢素F組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；西羅莫司F組CVD明顯低于環(huán)孢素F組和對照F組(P<0.05)，但對照F組與環(huán)孢素F組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表4。12周齡時西羅莫司F組和環(huán)孢素F組B超下腎臟體積明顯低于對照F組(P<0.05)，但羅莫司F組與環(huán)孢素F組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，但雌性3組B超下囊腫數(shù)、最大囊腫最大截面面積無顯著差異(P>0.05)，見表5。雌性3組血清BUN、Cr比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，不在此列表。

3 討論

西羅莫司通過阻斷mTOR的過度活化可以減慢ADPKD疾病腎臟損害的進(jìn)展，已有相關(guān)的動物實驗[6，7]和分子水平的研究[15，16]證明。既往文獻(xiàn)[17～21]表明FPC與ADPKD的責(zé)任蛋白質(zhì)PC1、PC2有交互作用，AKT/mTOR信號通路在兒童ARPKD的腎臟組織中有活化[22]。目前，鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin, CaN)被認(rèn)為對PC1和PC2都有作用[23]。對于PC2，目前認(rèn)為PC1可以通過與其結(jié)合的CK2激酶磷酸化PC2，從而使鈣通道開放，Ca2+內(nèi)流，激活CaN，從而使PC2去磷酸化，CK2和CaN就形成相反的作用，達(dá)到一個平衡狀態(tài)；對于PC1，目前認(rèn)為PC1可以通過其他途徑引起持續(xù)的Ca2+內(nèi)流，而不是通過PC2，這個持續(xù)的Ca2+內(nèi)流可以激活calcineurin/NFAT途徑，CaN被激活后，將磷酸化的NFAT去磷酸化，使NFAT轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與其相應(yīng)的靶基因結(jié)合，轉(zhuǎn)錄并引起細(xì)胞增殖和分化。據(jù)此我們猜測mTOR阻滯劑如西羅莫司或CNI如CsA可能也會對ARPKD的疾病進(jìn)程產(chǎn)生積極影響。

目前，在腎移植患者中，西羅莫司一般按2 mg/d的劑量給藥，按500 g左右體重的大鼠體表面積校正后，用藥劑量定為0.2 mg·kg-1·d-1較為合適， 大致與腎移植術(shù)后用量相同。在既往進(jìn)行的類似實驗研究中，Tao等[6]給實驗給藥的途徑是腹腔注射，劑量是0.2 mg·kg-1·d-1，臨床如果長期應(yīng)用該給藥方法很不方便。Wahl等[7]報道給藥劑量為2 mg·kg-1·d-1，按體表面積計算，約是目前腎移植術(shù)后患者應(yīng)用西羅莫司劑量的10倍，副作用及費用都顯著增大，通過飲水給藥會不會導(dǎo)致飲水量的變化，藥物溶解在飲用水中2 d(該實驗2 d更換1次飲水)是否有分解變質(zhì)，對這些問題該實驗均未能顧及。我們采用更符合臨床用藥特點的實驗方案，即按0.2 mg·kg-1·d-1劑量灌胃(類似臨床頓服藥物)。腎移植患者CsA一般按3～5 mg·kg-1·d-1口服給藥，同樣按照體表面積校正后，用藥劑量約為25 mg·kg-1·d-1，既往實驗有這樣的用法，但目的是為研究CsA的毒副作用[24]。Homan等[25]研究顯示對于Lewis大鼠，CsA灌胃劑量在5 mg·kg-1·d-1或靜脈注射劑量在2 mg·kg-1·d-1就可達(dá)到抗排異的作用而少有死亡，因此，我們采用最接近臨床應(yīng)用的5 mg·kg-1·d-1灌胃。

本研究結(jié)果顯示從雙腎質(zhì)量、2K/TBW、CVD以及血清BUN等指標(biāo)來講，西羅莫司和CsA對PCK大鼠的疾病進(jìn)程均無顯著影響，與Renken等[5]的研究結(jié)果相似。本研究超聲檢查結(jié)果顯示12周齡時西羅莫司組腎臟體積、腎臟內(nèi)囊腫數(shù)和最大囊最大截面面積明顯小于對照組(P<0.05)，但考慮到最終雙腎質(zhì)量及組織病理學(xué)檢查均未體現(xiàn)出明顯差異，我們認(rèn)為有以下2種可能：①超聲檢查結(jié)果受到檢查者主觀判斷的影響較大，存在不準(zhǔn)確的可能；②囊腫本身形態(tài)不規(guī)則，在超聲下計數(shù)、測量困難，易產(chǎn)生誤差的可能。為減小這些誤差，我們建議在今后的相關(guān)研究中采用CT、MRI或三維甚至四維彩超的檢查手段。

本研究只在6周齡時環(huán)孢素組血清Cr值明顯高于對照組(P<0.05)，其余時間3組血清BUN和Cr均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，這可能與實驗進(jìn)行的時間點大鼠周齡較小有關(guān)，Mason等[3]報道8周之前PCK大鼠無論雄性還是雌性，BUN和Cr方面均未表現(xiàn)出明顯升高。

另外，由于既往類似研究中多僅采用雄性大鼠作為實驗對象[6，7]，本研究雌雄大鼠各半，Mason等[3]報道雌性與雄性PCK大鼠的多囊腎發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程有差異，本研究結(jié)果顯示雖然各組樣本量偏少(n=3或4)，但結(jié)果仍顯示出西羅莫司在雌性PCK大鼠身上能夠減少囊腫數(shù)量、減小CVD，從而減小腎臟大小的作用。通過查閱既往文獻(xiàn)，推測可能與雌激素的作用有關(guān)，Cowley 等[26]和Anderson等[27]的研究顯示雌二醇用于雄性多囊腎大鼠可以下調(diào)AKT和mTOR的表達(dá)，從而限制腎皮質(zhì)囊腫的增長和改善腎功能。我們猜測mTOR抑制劑可能與雌激素存在某種協(xié)同作用，從而減緩多囊腎疾病的進(jìn)程，但需要進(jìn)一步大樣本量的實驗及細(xì)胞或分子水平的研究。

本實驗未能從細(xì)胞或分子層面對此問題做進(jìn)一步的闡釋，我們進(jìn)一步的研究也將側(cè)重于這方面。實驗進(jìn)行時間并不長，而我們知道多囊腎的發(fā)展過程相對漫長，我們只研究了ARPKD大鼠模型在疾病早期的變化特征和CsA、西羅莫司的藥效情況，進(jìn)一步的研究可以做一些更長時間的模型。

總體來講，本研究結(jié)果否認(rèn)西羅莫司和CsA對PKD大鼠疾病進(jìn)程的影響,但西羅莫司對于雌性PKD大鼠的腎囊腫數(shù)量、大小的增長表現(xiàn)出一定的延緩作用，對腎功能無明顯影響，有待后續(xù)研究。

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(修回日期：2017-01-31)

(責(zé)任編輯：李賀瓊)

The Effects of Sirolimus and Cyclosporine on the Progression of Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease in PCK Rats

WangShuo,SongYimeng,HouXiaofei,etal.

DepartmentofUrology,PekingUniversityThirdHospital,Beijing100083,China

HouXiaofei,E-mail:houxf12@163.com

Objective To observe the effects of sirolimus and cyclosporine in the progression of autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) in an orthologous animal model of human ARPKD, the PCK rats. Methods Four-week-old PCK rats (n=20), sex in half, were randomly divided into control group (drug free drinking water,n=6), sirolimus group (n=6), and cyclosporine group (n=8), respectively. They were given daily gavage with drinking water, sirolimus dilution, or cyclosporine dilution. The body weight was measured every week. The renal function was monitored throughout the treatment periods at 4, 6, 8, and 10 weeks. The kidney volume, number of cysts and maximum area of the largest cyst under ultrasound were measured at 4, 8, and 12 weeks. The kidneys were harvested, weighed, and analyzed histologically (cyst volume density, CVD) at 12 weeks. ResultsNone of the PCK rats died during the study. The body weight was increased in all the rats, witnout significant difference among the 3 groups (P>0.05). At 12 weeks, the kidney volume (cm3), number of cysts and maximum area of the largest cyst (cm2) under ultrasound were reduced significantly in the sirolimus group than the control group [(1.65±0.25) cm3vs. (2.00±0.36) cm3,q=3.426,P<0.05; 31.75±6.57 vs. 43.08±10.28,q=3.638,P<0.05; (0.0828±0.0420) cm2vs. (0.1373±0.0536) cm2,q=3.966,P<0.05]. There were no significant differences between cyclosporine group and control group on kidney volume, number of cysts and maximum area of the largest cyst under ultrasound (P>0.05). The sirolimus group, cyclosporine group and control group showed no significant difference in kidney weight, 2-kidney/total body weight ratio (2K/TBW), serum BUN and Cr, and CVD at 10 weeks (P>0.05). Conclusion Sirolimus and cyclosporine showed no significant effects on the disease process of PKD rats.

Autosomal recessive polycystic kidney disease; PCK rat; Sirolimus; Cyclosporine; Estrogen

衛(wèi)生部國際交流與合作中心項目(項目編號：IHECC08-201205)

A

1009-6604(2017)04-0348-06

10.3969/j.issn.1009-6604.2017.04.017

2016-07-29)

**通訊作者，E-mail：houxf12@163.com

①病理科

②超聲診斷科

③普通外科