基于斑馬魚模型評價多肽紅參飲調節(jié)氣血作用

李開瑩，郭朝萬，陳 杰，裴運林，

（1.廣東丸美生物技術股份有限公司，廣東 廣州 510000；2.廣州美域醫(yī)學檢驗有限公司，廣東 廣州 510000）

宋朝陳自明首次明確提出了“女子以血為本”的中醫(yī)學理論，“今婦人之生，有余于氣，不足于血，以其數(shù)脫血也”被記載于《靈樞·五音五味》中，提示女子以血為本的生理特點易產(chǎn)生“氣有余而血不足”的情況[1]。女子的脈細、唇舌色淡、面色無華或萎黃，并伴有心悸、健忘、多夢失眠等癥狀是血虛的表現(xiàn)[2]。女性氣血虛會導致出現(xiàn)一些疾病癥狀，如痛經(jīng)[3]、月經(jīng)過少病[4]、圍絕經(jīng)期綜合征[5]、卵巢功能衰退[6]。針對以上女性問題，市面上功能性食品常用的藥食同源原料有紅參、阿膠和燕窩等。有研究表明，阿膠對鹽酸苯肼型貧血小鼠有補血效果[7]，能夠促進血細胞形式功能，提升人體造血能力[8]；燕窩具有提高細胞免疫功能和促使人體組織與細胞再生的作用[9]。利用現(xiàn)代酶解技術制備得到的相應的肽類成分，如阿膠肽[10]、燕窩肽和血肽等成分，因為其吸收率高及有效作用得到市場高度認可，但現(xiàn)有的研究報道主要集中在免疫調節(jié)和抗氧化作用[11-12]，在氣血方面的作用無較多研究。另外，動物續(xù)血液制品將食源性活性肽作為主要成分與紅參進行科學組合得到多肽紅參飲（Polypeptide Hongshen Drink，PPHSD），研究此組合物在調節(jié)氣血方面的作用，以驗證經(jīng)酶解處理后的肽類是否依舊保留原物質所具有的功效。

斑馬魚是一種非常重要的模式動物，這種動物作為一種哺乳動物在遺傳學范疇上與人類相似，基因同源度高達87%[13]，相對于大鼠和小鼠動物試驗，斑馬魚試驗模型具有費用低、試驗周期短的特點[14]。近年來，斑馬魚模型已被廣泛用于功能性食品領域的功效評價，用于評價物質的調節(jié)免疫力作用[15-16]、改善微循環(huán)[17]、降血脂[18]、抗炎[19]、降血糖作用[20]和神經(jīng)保護作用[21]等。該課題組采用斑馬魚模型，建立相應的試驗模型，研究評價由食源性活性肽類為主要成分制備成的組合物飲品的調節(jié)氣血，提高免疫力的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗動物

選取4 dpf 的野生型AB 品系斑馬魚用于評價PPHSD 改善貧血作用；選取4 dpf 黑色素等位基因突變型半透明Albino 品系斑馬魚用于評價PPHSD 改善微循環(huán)障礙作用；選取3 dpf 野生型AB 品系斑馬魚用于評價PPHSD 改善免疫力作用。斑馬魚均飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚用水中（水質：每1 L 反滲透水中加入200 mg 速溶海鹽，硬度為50~100 mg/L CaCO3，pH值為6.5~8.5，電導率為450~550 μs/cm），試驗動物使用許可證號為：SYXK（浙） 2022-0004，飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC 認證（認證編號：001458） 的要求。

1.1.2 試劑與儀器

二甲基亞砜（DMSO，批號BCCD8942，Sigma），Switzerland 公司提供；鄰聯(lián)茴香胺（批號MKBX3619V）， Sigma 公司提供； 苯肼 （批號YH0170509），上海依赫生物科技有限公司提供；甲基纖維素（批號C2004046），上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供； 戊四唑 （PTZ， 批號YH0171126），上海依赫生物科技有限公司提供；Latex besads，carboxylate-modified polystyrene，fluirescent red 熒光微球（批號MKCB2036V），Sigma 公司提供。

解剖顯微鏡（SZX7），OLYMPUS 公司產(chǎn)品；CCD 相機（VertA1）；6 孔板，Nest 公司產(chǎn)品；精密電子天平（CP214），OHAUS 公司產(chǎn)品；電動聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡（AZ100），Nikon 公司產(chǎn)品；心跳血流分析系統(tǒng)（Zebralab3.） 3 PB2084C 公司產(chǎn)品；顯微注射儀（IM-300），Narishige 公司產(chǎn)品；拉針儀（PC-10），Narishige 公司產(chǎn)品；行為分析儀（V3.11），ViewPoint Life Sciences 公司產(chǎn)品。

1.1.3 試驗藥物

多肽紅參飲PPHSD 由阿膠肽、燕窩肽、血肽和紅參等組成。多肽類成分為相應原料經(jīng)過酶解工藝制備得到，然后將多種原料按科學配比經(jīng)過溶解、均質、過濾等步驟制備得到。配方采用食品級原料組成，以保證長期服用無毒性。

瑞克R生血寧片，以下簡稱生血寧片，黑綠色片劑，批號為20211003，武漢聯(lián)合藥業(yè)有限責任公司提供，陰涼干燥貯存，用超純水配制成50.0 mg/mL母液，現(xiàn)配現(xiàn)用；毛蕊異黃酮，白色粉末，批號211218044，華中海威（北京） 基因科技有限公司提供，冷藏干燥貯存。用DMSO 配制成3.41 mg/mL 母液，現(xiàn)配現(xiàn)用；破壁靈芝孢子粉，褐色粉末，批號為2112001，金日制藥（中國） 有限公司提供，陰涼、干燥貯存，用超純水配制成50.0 mg/mL 母液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 試驗方法

1.2.1 PPHSD 最大可用濃度考查（MTC）

在進行功效評價之前先考查3 種斑馬魚模型對不同質量濃度PPHSD 的耐受情況，使用質量濃度分別為72.9，146，292，583，1 167 μg/mL 的PPHSD對3 種模式斑馬魚進行毒性作用考查。隨機選取對應模式斑馬魚于6 孔板中，30 尾/孔/試驗組，分別水溶給予不同質量濃度的PPHSD 水溶液，同時設置正常對照組（標準稀釋水） 和模型對照組，每孔容量為3 mL。在試驗過程中，觀察記錄斑馬魚的死亡情況并移除死亡的斑馬魚，確定不同質量濃度PPHSD 對不同模式斑馬魚的毒性作用。

1.2.2 研究PPHSD 的改善貧血作用

隨機選取4 dpf 野生型AB 品系斑馬魚于6 孔板中，30 尾/ 孔。受試組分別水溶給予多肽紅參飲PPHSD，陽性對照組給予生血寧片250 μg/mL，同時設置正常對照組和模型對照組，每孔容量為3 mL。28 ℃條件下處理6 h 后，除正常對照組外，其余各試驗組均水溶給予苯肼建立斑馬魚營養(yǎng)性貧血模型。28 ℃條件下繼續(xù)處理18 h 后，用鄰聯(lián)茴香胺染色，染色結束后每個試驗組隨機選取10 尾斑馬魚置于解剖顯微鏡下拍照，用NIS-Elements D 3.20 高級圖像處理軟件采集數(shù)據(jù)，分析統(tǒng)計斑馬魚心臟紅細胞染色強度，以心臟紅細胞染色強度的統(tǒng)計學意義評價多肽紅參飲PPHSD 對營養(yǎng)性貧血改善作用。

1.2.3 研究PPHSD 的改善微循環(huán)作用

隨機選取4 dpf 黑色素等位基因突變型半透明Albino 品系斑馬魚于6 孔板中，每孔均處理30 尾斑馬魚。分別水溶給予PPHSD，陽性毛蕊異黃酮4.26 μg/mL 質量濃度，同時設置正常對照組，每孔容量為3 mL。28 ℃處理1d 后，每個試驗組隨機選取10 尾斑馬魚置于斑馬魚心跳血液分析系統(tǒng)中錄制視頻并采集數(shù)據(jù)，分析節(jié)間血管血流速度，以該指標的統(tǒng)計學分析結果評價PPHSD 改善微循環(huán)功效。

1.2.4 研究PPHSD 的增強免疫力作用

隨機選取3 dpf 野生型AB 品系斑馬魚于6 孔板中，30 尾/孔。受試組分別水溶給予PPHSD，陽性對照組給予破壁靈芝孢子粉2 000 μg/mL，同時設置正常對照組，每孔容量為3 mL。于28 ℃條件下處理4 d 后，每個試驗組隨機選取10 尾斑馬魚置于熒光顯微鏡下拍照，用Image J 軟件分析并采集數(shù)據(jù)，分析斑馬魚熒光微球殘留數(shù)目，以該指標的統(tǒng)計學分析結果評價PPHSD 增強免疫力功效。

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述1.2.1~1.2.4 的研究結果均用mean±SE 表示，方差分析和Dunnett's T- 檢驗對結果進行統(tǒng)計學分析，p<0.05 表明具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 PPHSD 試驗濃度確定

試驗研究中所涉及的3 種斑馬魚模型的試驗終點，PPHSD 在72.9~1 167 μg/mL 的所有濃度組中斑馬魚無死亡現(xiàn)象，也無明顯形態(tài)和行為異常。在功效評價試驗中，PPHSD 選取適宜濃度進行分組試驗。

2.2 PPHSD 的改善貧血作用

多肽紅參飲改善營養(yǎng)性貧血功效試驗結果（n=10） 見表1。

表1 多肽紅參飲改善營養(yǎng)性貧血功效試驗結果（n=10）

由表1 可知，正常對照組斑馬魚心臟紅細胞染色強度與模型對照組比較有顯著性差異（p<0.001），而陽性對照藥生血寧組斑馬魚心臟紅細胞染色強度與模型對照組比較顯著上升（p<0.001），表明模型建立成功。PPHSD 中、高濃度組292 和583 μg/mL 斑馬魚心臟紅細胞染色平均強度分別為4 729 和4 789，與模型對照組比較顯著增加，增加率為29.7%和31.34%，差異均顯著（p<0.01)。結果表明，在該試驗濃度條件下，PPHSD 對苯肼誘導的斑馬魚貧血具有明顯的改善作用。

多肽紅參飲處理后斑馬魚心臟紅細胞染色強度典型圖見圖1。

圖1 多肽紅參飲處理后斑馬魚心臟紅細胞染色強度典型圖

由圖1 可知，模型組的心臟紅細胞染色程度明顯比正常對照組少，多肽紅參飲（PPHSD） 組心臟紅細胞染色程度明顯比模型組高，其結果與上述描述的一致。

2.3 PPHSD 的改善微循環(huán)作用

多肽紅參飲改善微循環(huán)功效試驗結果（n=10）見表2。

表2 多肽紅參飲改善微循環(huán)功效試驗結果（n=10）

由表2 可知，陽性對照組毛蕊異黃酮的血管血流速度與正常對照組相比，顯著上升（p<0.001）。PPHSD 的低中高292，583，1 167 μg/mL 這3 個劑量組斑馬魚平均血管血流速度分別為646，665，674 μm/s，與正常對照組比較顯著上升，分別提升了30.37%，34.10%，35.88%（p<0.05）。試驗結果表明，PPHSD 可以促進正常斑馬魚的血液流動，改善斑馬魚微循環(huán)。

2.4 PPHSD 的增強免疫力作用

多肽紅參飲對斑馬魚吞噬熒光微球作用（n=10）見表3。

表3 多肽紅參飲對斑馬魚吞噬熒光微球作用（n=10）

由表3 可知，陽性對照組破壁靈芝孢子粉（2 000 μg/mL） 的斑馬魚體內熒光微球殘留數(shù)目與正常對照組相比，降低率為21.39%，具有顯著性（p<0.05）。PPHSD 的低中高72.9，146，292 μg/mL 這3 個劑量組斑馬魚體內熒光微球殘留數(shù)目與正常對照組相比，分別降低31.96%，32.22%，32.73%，具有顯著差異（p<0.01）。

紅參多肽飲處理后斑馬魚熒光微球殘留數(shù)目典型圖見圖2。

圖2 紅參多肽飲處理后斑馬魚熒光微球殘留數(shù)目典型圖

由圖2 可知，多肽紅參飲組（PPHSD） 紅色熒光數(shù)明顯少于正常對照組。當熒光微球在體內殘留量少，說明斑馬魚體內巨噬細胞對外來異物的吞噬能力強。結果表明，PPHSD 具有增強免疫力作用。

3 結論

采用現(xiàn)代模式生物模型——斑馬魚模型研究組合物在氣血調節(jié)方面的作用及作用機理。試驗結果表明，72.9~1 167 μg/mL 質量濃度范圍的PPHSD 對斑馬魚無毒性；292 和583 μg/mL PPHSD 組能夠明顯提升苯肼誘導的貧血斑馬魚的心臟紅細胞染色強度增強，與模型對照組相比增加率為29.7%和31.34%，差異均顯著（p<0.01）；給予PPHSD 的斑馬魚組的血管血流速度明顯強于正常對照組，292，583，1 167 μg/mL 的PPHSD 對斑馬魚平均血管血流速度分別提升了30.37%，34.10%，35.88%，具有顯著性差異（p<0.05）；72.9，146，292 μg/mL 的PPHSD明顯降低斑馬魚體內熒光微球殘留數(shù)目，與正常對照組相比分別降低31.96%，32.22%，32.73%，差異均顯著（p<0.01），其增強免疫力作用明顯且優(yōu)于陽性對照破壁靈芝孢子粉。綜上所述，食源性多肽為主的組合物具有增強免疫力、改善貧血及改善微循環(huán)作用，可改善斑馬魚的總體氣血狀況。試驗結果與已有的原料功效認知相一致，具有綜合調節(jié)機體免疫功能，共同改善機體貧血并增強免疫力的作用。不僅為此類活性多肽成分的功效提供試驗佐證，而且也為具有評價此類功效提供了新的試驗模型。