旋毛蟲病診斷方法研究綜述

（中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所，世界衛(wèi)生組織熱帶病合作中心，科技部國家級熱帶病國際聯(lián)合研究中心，衛(wèi)生部寄生蟲病原與媒介生物學(xué)重點實驗室，上海 200025）

旋毛蟲病診斷方法研究綜述

翟鋮鋮，陳家旭，陳韶紅，吳秀萍

（中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所，世界衛(wèi)生組織熱帶病合作中心，科技部國家級熱帶病國際聯(lián)合研究中心，衛(wèi)生部寄生蟲病原與媒介生物學(xué)重點實驗室，上海 200025）

旋毛蟲病對畜牧業(yè)及人類健康造成了嚴(yán)重危害。本文對動物及人類旋毛蟲病的診斷方法進(jìn)行了綜述，如病原學(xué)診斷方法（包括壓片鏡檢法和集樣消化法）、免疫學(xué)診斷方法（包括抗體檢測、循環(huán)抗原檢測和蛋白芯片技術(shù)）、分子生物學(xué)診斷方法（包括聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)）以及基因芯片技術(shù)，分析了現(xiàn)有研究方法的優(yōu)點和不足，為后續(xù)尋找更快速、高效、便捷、準(zhǔn)確的診斷方法提供理論參考。

旋毛蟲；旋毛蟲病；診斷方法

旋毛蟲病是由旋毛形線蟲引起的食源性人獸共患寄生蟲病，呈世界性分布。該病的感染宿主可達(dá)150余種[1]，動物及人類主要通過食入含有感染性幼蟲的肉類及其制品而感染該病。自1835年首次發(fā)現(xiàn)以來，旋毛蟲經(jīng)常引起突發(fā)性重大公共衛(wèi)生事件，是世界各國屠宰動物首檢和強制性必檢的人獸共患病病種，也是目前世界范圍內(nèi)投入防控費用較高的食源性人獸共患寄生蟲病之一。目前，加強對該病的檢驗與診斷，是控制該病的唯一有效途徑。

旋毛蟲病的診斷方法主要分為病原學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷。動物感染旋毛蟲后幾乎沒有任何癥狀，因此宰后檢疫大多采用病原學(xué)診斷方法[2]。分子生物學(xué)方法是通過肌肉樣本進(jìn)行診斷的新興診斷方法。而人旋毛蟲病因臨床表現(xiàn)癥狀不明顯，臨床診斷較為困難，易與其他傳染病混淆，所以主要通過肌肉活檢、發(fā)現(xiàn)幼蟲或包囊來確診，但在感染早期往往不易檢出，且通過外科手術(shù)進(jìn)行治療導(dǎo)致的創(chuàng)傷較大，病人往往難以接受。因此，通過血清樣本進(jìn)行診斷的免疫學(xué)方法是最理想的診斷方法。然而，當(dāng)前每種診斷方法都存在一定的弊端，完善旋毛蟲現(xiàn)有檢測方法以及尋找一種更合適的診斷技術(shù)，仍是眾多學(xué)者的研究熱點。本文對旋毛蟲病的診斷方法進(jìn)行了綜述，為進(jìn)一步完善和研制有效的旋毛蟲病診斷技術(shù)提供重要的理論參考。

1 病原學(xué)診斷方法

旋毛蟲病的病原學(xué)診斷方法包括壓片鏡檢法和集樣消化法。這2種方法是我國豬旋毛蟲病診斷的標(biāo)準(zhǔn)方法。

1.1 壓片鏡檢法

根據(jù)世界動物衛(wèi)生組織（OIE）的診斷檢測和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊，采集規(guī)定部位的28粒燕麥粒大?。? mm×10 mm）肌肉組織樣品，總質(zhì)量約0.5 g。用2個載玻片將肌肉粒壓至接近透明，在傳統(tǒng)立體顯微鏡或旋毛蟲檢查鏡下進(jìn)行檢查。OIE推薦方法適用于野豬、家豬和馬屬動物中旋毛蟲肌幼蟲的檢測[3]，而對于人體旋毛蟲病的臨床確診，一般取腓腸肌的肌肉進(jìn)行壓片鏡檢。在檢驗旋毛蟲時，往往會發(fā)現(xiàn)住肉孢子蟲和發(fā)育不完全的囊尾蚴，典型蟲體較容易被辨認(rèn)，但如果其發(fā)生鈣化、死亡或溶解現(xiàn)象，則容易混淆，在檢查時需注意鑒別。

對于壓片鏡檢法，當(dāng)肌肉中蟲體密度達(dá)到3條/g時方可檢出。該法對操作者的要求較高，且對早期感染、輕度感染及沒有包囊的蟲種不易檢出，容易誤診和漏診。我國在動物屠宰檢疫中多用目檢法和鏡檢法相結(jié)合的方法[4]，有的則采用壓片鏡檢法和免疫膠體金檢測相結(jié)合的方法[5]，需耗費大量人力與時間。

1.2 集樣消化法

根據(jù)歐盟法令（77/96/EEC號令）規(guī)定的磁力攪拌器法[6]，取待檢動物易感部位肌肉組織樣品約100 g于燒杯中，加入含1%胃蛋白酶和1%鹽酸的人工消化液，將其置于熱板磁力攪拌器，46～48 ℃下均勻攪拌30 min，用網(wǎng)篩（180目）過濾肉渣組織，靜置沉淀30 min，將10 mL下層沉淀液轉(zhuǎn)移至帶有網(wǎng)格的培養(yǎng)皿中，在旋毛蟲檢查鏡或者立體顯微鏡（15～40×）下檢測樣品中是否存在旋毛蟲。該法是國際旋毛蟲病委員會的推薦方法，其敏感性為肉中蟲體密度達(dá)到1條/g時即可被檢出，大多數(shù)發(fā)達(dá)國家采用此法對屠宰動物進(jìn)行檢疫。但吳秀萍等[7]指出，對于不同種及基因型的旋毛蟲，在不同溫度和沉降時間上，回收的肌幼蟲百分比存在明顯差異，用現(xiàn)有國際標(biāo)準(zhǔn)的消化法檢驗旋毛蟲會有一定的偏差，且在感染率低或?qū)Ω腥?4～18 d的成囊前幼蟲檢查時，可能會造成漏檢[8]。單個胴體檢驗需要耗費大量人力和時間，相比之下，集樣消化法可一次檢測胴體多達(dá)100余頭。雖然集樣消化法需要相對較多的科研技術(shù)和設(shè)備，但其更為廉價和有效，所以大多數(shù)發(fā)達(dá)國家仍采用消化法對屠宰動物進(jìn)行例行檢驗。

2 免疫學(xué)診斷方法

免疫學(xué)方法具有快速、簡便、敏感性高等優(yōu)點，既解決了人體取材的局限性，又克服了臨床病癥易誤診的難題，并且人與動物可通用，該法逐漸成為旋毛蟲病診斷方法的研究熱點。目前，旋毛蟲病診斷抗原主要有蟲體粗抗原、表面抗原、排泄分泌（ES）抗原、桿細(xì)胞顆粒相關(guān)抗原、重組抗原和循環(huán)抗原等。然而，免疫學(xué)診斷方法所應(yīng)用的抗原存在特異性和敏感性差以及存在診斷盲區(qū)等弊端，因此僅能作為臨床輔助檢查方法。

2.1 抗體檢測

2.1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。ELISA由于敏感性和特異性較高且具備早期應(yīng)用診斷價值，是目前檢測旋毛蟲感染最常用的輔助方法之一。ELISA方法檢測的一系列實驗或?qū)嵉匮芯?，已被廣泛應(yīng)用于豬血清和肉汁樣品檢測，檢出率高于鏡檢法[9]。ELISA的敏感性和特異性很大程度上取決于應(yīng)用抗原的質(zhì)量，也與操作程序和宿主種類有關(guān)。由于旋毛蟲肌幼蟲的ES抗原較好制備，所以它是旋毛蟲病最常用的診斷抗原。但其對IgG 抗體敏感性較高，往往假陽性結(jié)果偏高，需用免疫印跡法來確認(rèn)。由于肌幼蟲的ES抗原具有階段特異性[10]，所以IgG抗體一般可以在感染后12～60 d內(nèi)被檢測出來[11]，但因其對早期的IgE和IgM不敏感，所以利用單一肌幼蟲期ES抗原檢測旋毛蟲最佳感染期應(yīng)為感染45 d后[12]，因此不能用來做早期診斷。雖然肌幼蟲易獲得，但因必須人工制備，會導(dǎo)致每批質(zhì)量不一，且交叉反應(yīng)嚴(yán)重，因而無法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，其特異性和程序標(biāo)準(zhǔn)化問題也有待解決[13]。雖然ELISA方法使用廣泛，其試劑盒也在市場中全面推廣，但商業(yè)化的ELISA試劑盒還沒有標(biāo)準(zhǔn)化，大多數(shù)不穩(wěn)定，也未用健康人群和旋毛蟲病確診人群的血清樣本進(jìn)行驗證。由于肌幼蟲ES蛋白有以上諸多弊端，因此敏感性和特異性更高、穩(wěn)定性更好、更容易制備、可用于早期診斷的抗原成為各國學(xué)者研究的焦點。隨著基因工程的發(fā)展，重組抗原有著廣闊的前景，如：旋毛蟲腸道期6 h幼蟲的ES蛋白[14]，旋毛蟲成蟲的ES抗原[15]，旋毛蟲腸道期6 h幼蟲的cDNA文庫篩選出的半胱氨酸蛋白酶抑制劑編碼基因表達(dá)出的重組Ts-CLP蛋白[16]，從肌幼蟲ES蛋白中篩選出來的編碼31 kDa基因而后表達(dá)出的重組31 kDa蛋白[17]，以及旋毛蟲成蟲ES蛋白中定位于桿狀體的L20h-Ts3蛋白等[18]。

2.1.2 免疫印跡法（WB）。WB有著較高的特異性和敏感性，但其操作過程比較繁瑣，通常用來確認(rèn)ELISA檢測的陽性血清。有研究稱，采用ELISA與WB相結(jié)合的方法來檢驗豬旋毛蟲病，其敏感性是消化法的31.4倍[19]。另外，Gómez-Morales等[20]發(fā)現(xiàn)，所有旋毛蟲病陽性血清用WB檢測后都有1個三條帶模式，人血清在53～72 kDa之間，豬血清在48～72 kDa之間，這意味著WB可能會成為檢測旋毛蟲病的金標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.3 環(huán)幼沉淀試驗（CPT）。CPT是旋毛蟲特有的血清學(xué)試驗，幼蟲分泌的排泄物與特異性抗體結(jié)合，在幼蟲的體表特別是口及肛門部位，產(chǎn)生具有折光性的團塊狀或泡沫狀沉淀物，結(jié)果易于判斷，具有較高的敏感性和特異性，操作簡單且無需特殊設(shè)備，適用于基層應(yīng)用。朱敬等[21]同時運用斑點ELISA和CPT來檢測這2種方法對旋毛蟲病的特異性與敏感性，結(jié)果陽性率分別為97.5%和95%，且特異性較高，表明在臨床診斷時，用這2種方法同時檢測，可提高臨床診斷的準(zhǔn)確率。

2.1.4 免疫酶染色試驗（IEST）。IEST的原理與ELISA基本相似。朱敬等[22]采用IEST和CPT相結(jié)合的方法檢測實驗感染旋毛蟲的大鼠血清特異性抗體，其陽性率分別為97.6%和95.1%，說明IEST和CPT對旋毛蟲特異性IgG抗體的檢測均有較好的敏感性和特異性。在診斷方法的評價方面，在診斷旋毛蟲病時，IEST以含有旋毛蟲幼蟲的肌肉組織切片為抗原，具有敏感性高、特異性強、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，且抗原片可置于-20 ℃以下長期保存，通過光學(xué)顯微鏡即可觀察結(jié)果，無需特殊設(shè)備。

2.1.5 膠體金免疫層析法。膠體金免疫層析法是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，因其將免疫分子親和原理和免疫印記法、經(jīng)典的薄層層析技術(shù)相結(jié)合，操作簡便、快速，日益受到重視。秦銀霞等[23]用膠體金標(biāo)SPA和旋毛蟲排泄分泌抗原的免疫層析試紙條檢測，整個操作時間僅需15 min，操作簡便，不需特殊儀器設(shè)備，檢測結(jié)果可長期保存。李雁萍[24]利用免疫層析試紙條檢測經(jīng)5 000條旋毛蟲感染的豬，并與鏡檢法做比較，結(jié)果表明試紙條有著很高的敏感性與特異性，在豬肉檢疫中有很好的應(yīng)用前景。

2.1.6 乳膠凝集試驗。乳膠凝集試驗是以乳膠顆粒作為載體的一種間接凝集試驗，即吸附可溶性抗原于其表面，待特異性抗體與之結(jié)合之后，產(chǎn)生凝集反應(yīng)。這種方法簡單、省時、客觀性強，但其敏感性主要取決于待檢查的肉制品，通常比人工消化法的敏感性要低，且這種方法不適用于腌制的肉制品檢測[25]。但伯樂公司生產(chǎn)的乳膠凝集試劑盒在經(jīng)過歐洲5個實驗室的驗證之后，證明該試劑盒的敏感性較高，特異性好，重復(fù)性和穩(wěn)健性也較好，可用于豬肉中的旋毛蟲快速檢測[26]。

2.2 循環(huán)抗原檢測

宿主感染旋毛蟲后，旋毛蟲的排泄分泌物進(jìn)入血液中形成循環(huán)抗原，因此可以利用已知的抗體來檢測抗原。王中全等[27]利用IgY和單克隆抗體的夾心ELISA來檢測感染旋毛蟲的鼠血清中的循環(huán)抗原，結(jié)果表明，這種方法可以檢測鼠血清中排泄分泌抗原的量為1 ng/mL，并且可以在500條旋毛蟲感染小鼠的第3天就檢測到血清中的循環(huán)抗原。這種方法的敏感性可以用作檢測旋毛蟲早期感染以及旋毛蟲病的化學(xué)治療評價，但在特異性上仍存在不足。

2.3 蛋白芯片技術(shù)

陳家旭等[28]曾用蛋白芯片技術(shù)及5種不同的半純化粗抗原和人類血清來檢測5種食源性蠕蟲（豬囊尾蚴、廣州管圓線蟲、并殖吸蟲、旋毛形線蟲和迭宮絳蟲），結(jié)果顯示，此方法敏感、快速、通量高，可應(yīng)用于這5種蠕蟲的大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查，為寄生蟲病的大量樣品檢測提供了思路。另外，旋毛蟲排泄分泌物質(zhì)表面的多糖抗原可作為ES抗原的替代抗原，成為芯片技術(shù)的檢測抗原，并顯示出較高的敏感性與特異性[29]，但因肌幼蟲期ES抗原存在諸多弊端及該技術(shù)的局限性，仍無法在臨床上進(jìn)行推廣。

3 分子生物學(xué)診斷方法

隨著PCR技術(shù)和核酸序列技術(shù)的迅速發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)逐步運用于旋毛蟲的研究。由于特異性強、敏感性高，分子生物學(xué)診斷方法也越來越被人們所關(guān)注，成為目前最為敏感的診斷方法。

3.1 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）

目前，PCR技術(shù)已應(yīng)用于旋毛蟲的基因診斷、種屬鑒定等多個領(lǐng)域，且逐漸發(fā)展出常規(guī)PCR、實時PCR、多重PCR、熒光定量PCR等方法。這種方法的敏感性可達(dá)0.1條/g幼蟲，比推薦的人工消化法的敏感性高5～10倍[30]，有的甚至能達(dá)到0.016條幼蟲/g[31]，在旋毛蟲病的診斷方面有著廣闊的前景。同時，食品監(jiān)管機構(gòu)和醫(yī)學(xué)實驗室利用這種穩(wěn)定而簡單的方法，可有效檢測肉中的旋毛蟲。該法快速、敏感性高、特異性強，可同時檢測多個肌肉樣本，并且節(jié)省人力和時間，適用于動物群的流行病學(xué)調(diào)查，因此PCR方法有望成為旋毛蟲病早期診斷的替代方法。但由于目前檢測儀器昂貴，且該法對操作環(huán)境和人員的要求較高，限制了其廣泛應(yīng)用。

3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）

LAMP技術(shù)是近年來發(fā)展的一種新的核酸擴增技術(shù)，不需要PCR技術(shù)用的精確儀器，只需要恒溫水浴箱并且設(shè)計合適的引物，就可以在現(xiàn)場實現(xiàn)高通量快速檢測，檢測結(jié)果明顯直觀，通過肉眼即可辨認(rèn)，檢測成本低于傳統(tǒng)的ELISA方法，因此該法在食品安全方面日益受到重視[32]?，F(xiàn)已發(fā)明出60 min內(nèi)進(jìn)行快速檢測的LAMP試劑盒，使其更適用于現(xiàn)場和基層醫(yī)療單位使用[33-34]。有研究人員曾以旋毛蟲線粒體的大亞基蛋白DNA為目的基因，比較實時PCR、LAMP、常規(guī)PCR這3種方法對豬旋毛蟲的檢測效果。結(jié)果表明：實時PCR是一種快速、特異性強、敏感性強的檢測工具；LAMP方法的敏感性比常規(guī)PCR高10倍，且有快速、易操作、花費少等優(yōu)點[35]。LAMP技術(shù)比PCR技術(shù)更適合用于肉類旋毛蟲的快速檢測，但易出現(xiàn)假陽性[36]，且無法鑒別旋毛蟲的地理株。

3.3 基因芯片技術(shù)

與蛋白芯片不同，基因芯片技術(shù)利用旋毛蟲的某個特異性基因可變區(qū)來設(shè)計引物及探針，點樣于玻片，制成基因芯片，旋毛蟲的DNA經(jīng)過引物擴增后與芯片上的探針雜交，然后通過掃描圖像判斷是否檢測到旋毛蟲。張媛等[37]曾利用這種方法進(jìn)行3種寄生蟲的檢測，結(jié)果顯示，探針特異性高，敏感度約為15 ng/mL，而旋毛蟲的敏感性達(dá)1條/200 mg。另外，楊朋欣等[38]建立了一種基于雙重PCR的液相基因芯片檢測方法，來同時檢測食品中的弓形蟲和旋毛蟲，結(jié)果靈敏度和特異性較高，分別為65.6 ng/mL和39.06 ng/mL，重復(fù)性良好，為食源性寄生蟲的檢測提供了新的思路與方法。

4 小結(jié)

旋毛蟲的生存能力強、宿主范圍廣，引起的臨床特征不具特異性，其診斷方法也不夠完善，導(dǎo)致了旋毛蟲病從首次發(fā)現(xiàn)至今180多年來，依然在全世界范圍內(nèi)流行。加強動物檢疫，杜絕病肉流入市場，同時對人體旋毛蟲病早診斷、早治療，對減少畜牧業(yè)損失、增進(jìn)人類健康、減少人類重大公共衛(wèi)生事件意義重大。對于屠宰動物旋毛蟲病的檢驗，OIE法定的檢驗方法為鏡檢法及集樣消化法，目前我國也在使用這2種方法，但這2種方法均存在一定的弊端：鏡檢法費時、費力且敏感性差；集樣消化法雖可提高檢出率，但操作復(fù)雜。可結(jié)合免疫學(xué)方法，提高結(jié)果的可靠性。分子生物學(xué)方法敏感性高、特異性強，有可能成為替代傳統(tǒng)檢驗方法的新型檢測手段。人體旋毛蟲病仍通過肌肉活檢發(fā)現(xiàn)幼蟲或包囊來確診，然而輕度感染及感染早期往往不易被檢出，且不易被人們接受。分子生物學(xué)診斷方法受樣本采集、儀器設(shè)備等因素的影響，也無法在臨床上得到有效應(yīng)用。免疫學(xué)方法，如ELISA，是最為敏感的方法，然而由于目前所采用抗原的局限性，如蟲體及其排泄分泌物抗原不宜大量制備，來自肌幼蟲期的抗原存在檢驗盲區(qū)與非特異性等特點，致使免疫學(xué)方法始終未被納入法規(guī)方法。所以，尋找一種敏感性和特異性高、穩(wěn)定性好，可大量制備，可用于早期診斷且節(jié)省人力物力的重組抗原，是未來研究中亟待解決的問題。

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（責(zé)任編輯：杜憲）

Research Progress of Diagnosis Methods about Trichinellosis

Zhai Chengcheng，Chen Jiaxu，Chen Shaohong，Wu Xiuping
（National Institute of Parasitic Diseases，Chinese Center for Disease Control and Prevention；WHO Collaborating Centre for Tropical Diseases；National Center for International Research on Tropical Diseases，Ministry of Science and Technology；Key Laboratory of Parasite and Vector Biology，Ministry of Health，Shanghai 200025）

Trichinellosis caused serious harm to human health and animal husbandry. Diagnostic methods of animal and human′s trichinellosis were introduced in this paper，including etiologic diagnosis methods（including compression microscopy and sample digestion method），immunological diagnostic methods（including antibody detection，detection of circulating antigen and protein chip technology），molecular diagnosis methods（including polymerase chain reaction and loop mediated isothermal amplif i cation）and gene chip technology. The advantages and disadvantages of existing research methods were analyzed，in order to provide a theoretical reference for a rapid，eff i cient，convenient and accurate diagnostic methods.

Trichinella spp.；Trichinellosis；diagnosis method

S852.73

：A

：1005-944X（2017）06-0068-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.06.021

國家科技重大專項（2012ZX10004220）