豬弓形蟲病最新檢測(cè)方法研究概況

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

豬弓形蟲病最新檢測(cè)方法研究概況

莊金秋，梅建國(guó)，張 穎，楊麗梅，李 峰，沈志強(qiáng)

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

弓形蟲病是一種人獸共患寄生蟲病。本文綜述了豬弓形蟲病的最新實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究情況，如病原學(xué)檢測(cè)方法、血清學(xué)檢測(cè)方法（包括凝集試驗(yàn)和ELISA）和分子生物學(xué)檢測(cè)方法（包括PCR、熒光定量PCR、PCR-RFLP、原位PCR、免疫-PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法和核度探針技術(shù)）等，闡述了不同檢測(cè)方法的檢測(cè)效果和優(yōu)缺點(diǎn)，以期為豬弓形蟲病的檢測(cè)與防控提供參考。

弓形蟲；豬弓形蟲??；檢測(cè)方法；研究進(jìn)展

弓形蟲?。═oxoplasmosis）是由剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）引起的一種人獸共患原蟲病。該病主要引起孕婦流產(chǎn)、產(chǎn)弱胎、畸胎、死胎以及兒童生長(zhǎng)發(fā)育受阻、死亡。在家畜中，弓形蟲病主要感染豬，以高熱、呼吸困難、神經(jīng)癥狀以及繁殖障礙為特征。據(jù)了解，我國(guó)養(yǎng)豬場(chǎng)中曾大規(guī)模暴發(fā)弓形蟲病，死亡率高達(dá)60%，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)近年來(lái)的弓形蟲病血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，豬弓形蟲病感染率較高，且呈逐年上升趨勢(shì)。豬弓形蟲病嚴(yán)重威脅著動(dòng)物健康和人類公共衛(wèi)生安全，因此實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)豬群弓形蟲感染對(duì)于防控該病尤為重要。由于豬多表現(xiàn)為隱性感染，其臨床癥狀和病理變化與豬瘟相似，因此需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)才能確診。本文綜述了近年來(lái)豬弓形蟲病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究進(jìn)展，以期為科研工作者和廣大養(yǎng)豬業(yè)主更好地防治該病提供參考。

1 病原學(xué)檢測(cè)方法

病原學(xué)檢測(cè)方法包括直接涂片染色或組織切片染色觀察法、動(dòng)物接種或細(xì)胞培養(yǎng)法、卵囊檢查法等。該方法是查驗(yàn)弓形蟲最可靠的方法，缺點(diǎn)是敏感性低、耗時(shí)長(zhǎng)、容易漏診[1]。

2 血清學(xué)檢測(cè)方法

2.1 凝集試驗(yàn)

主要包括直接凝集試驗(yàn)（DAT）、間接血凝試驗(yàn)（IHAT）、乳膠凝集試驗(yàn)（LAT）以及改良凝集試驗(yàn)（MAT）。IHAT主要用于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查，Senet等[2]證實(shí)了IHAT檢測(cè)IgM抗體更敏感，且比間接免疫熒光試驗(yàn)（IFAT）更能檢測(cè)低滴度弓形蟲抗體。王天奇等[3]、王海燕等[4]先后以IHAT方法調(diào)查河南洛陽(yáng)地區(qū)豬弓形蟲感染情況，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)豬弓形蟲感染有明顯上升趨勢(shì)。羅才慶等[5]應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和IHAT方法，平行檢測(cè)來(lái)自福建龍巖市某豬場(chǎng)的32份豬血清中抗弓形蟲特異性抗體，結(jié)果顯示ELISA和IHAT方法對(duì)豬弓形蟲的抗體陽(yáng)性檢出率分別為62.5%（20/32）和53.13%（17/32）。王貝貝等[6]發(fā)現(xiàn)MAT方法適用于對(duì)初篩樣本以及臨床疑似弓形蟲感染個(gè)體的篩查，但該法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不宜在基層推廣使用。Lorry等[7]認(rèn)為MAT方法可用于畜群血清學(xué)檢測(cè)，且該法可作為檢測(cè)組織液的良好候選法。

2.2 ELISA

ELISA是國(guó)內(nèi)外多數(shù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)弓形蟲抗體的最常用方法。管剛等[8]用弓形蟲的重組蛋白P30作為抗原建立了ELISA方法，對(duì)青海省互助縣的139份豬血清抗體進(jìn)行豬弓形蟲病檢測(cè)，陽(yáng)性率為5.76%，應(yīng)用IHAT方法檢出的陽(yáng)性率為13.67%，ELISA檢測(cè)的陽(yáng)性率明顯低于IHAT檢出的陽(yáng)性率。江濤等[9]應(yīng)用弓形蟲重組微線體蛋白3（rMIC3）作為包被抗原建立了間接ELISA方法，以ELISA與LAT平行檢測(cè)471份豬血清樣本，弓形蟲抗體陽(yáng)性檢出率分別為39.49%和44.16%，二者總符合率為92.56%。羅才慶等[5]對(duì)ELISA和IHAT比較發(fā)現(xiàn)，ELISA更適用于豬弓形蟲抗體檢測(cè)。楊亞曉等[10]比較金標(biāo)法、IHAT和ELISA發(fā)現(xiàn)，ELISA檢測(cè)弓形蟲IgG抗體的敏感性和特異性較高，適合于大規(guī)模的弓形蟲IgG抗體篩查。丁邦勝等[11]建立了3種重組抗原（rSAG1 + rHXGPRT + rAK）混合的間接ELISA方法，檢測(cè)弓形蟲IgM和IgG。Bartomiej等[12]使用5組弓形蟲重組嵌合抗原建立ELISA方法，檢測(cè)馬、豬、羊3種家畜動(dòng)物血清中的IgG，結(jié)果顯示所有嵌合抗原具有高特異性（100%）。許正茂等[13]以弓形蟲TgSAG2蛋白作為包被抗原，對(duì)新疆巴州地區(qū)433份豬血清樣品進(jìn)行了ELISA檢測(cè)，平均陽(yáng)性率為12.70%（55/433），其中，散養(yǎng)豬場(chǎng)陽(yáng)性率為16.83%（35/208），規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)為9.94%（16/161），散養(yǎng)豬場(chǎng)陽(yáng)性檢出率顯著高于規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)。邵曉冬等[14]采集河南洛陽(yáng)地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)和散養(yǎng)戶母豬、育肥豬、保育豬血清樣品410份，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)抗弓形蟲IgG抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬弓形蟲血清抗體陽(yáng)性率達(dá)35.4%，母豬、育肥豬和保育豬的陽(yáng)性率分別是50.4%、34.5%和22.2%，規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)母豬及育肥豬陽(yáng)性率極顯著或顯著低于散養(yǎng)戶。目前，市場(chǎng)上的各種豬弓形蟲病ELISA診斷試劑盒質(zhì)量參差不齊，進(jìn)口試劑盒與國(guó)產(chǎn)試劑盒的符合率、敏感性和特異性都存在較大差距。何勇等[15]、白昀等[16]先后比較國(guó)內(nèi)外ELISA商品化試劑盒后提出，選用臨床試劑盒時(shí)可從性價(jià)比方面考慮，選用質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的國(guó)產(chǎn)試劑盒，不必完全依賴進(jìn)口試劑盒，但在確有必要引進(jìn)國(guó)外試劑盒時(shí)，也應(yīng)選用質(zhì)量穩(wěn)定可靠的產(chǎn)品。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

目前，根據(jù)研究者選擇弓形蟲基因組中拷貝數(shù)和保守型的不同，PCR檢測(cè)技術(shù)的靈敏度和特異性也有所不同，常作為弓形蟲檢測(cè)的基因主要有：200～300個(gè)拷貝的529 bp重復(fù)序列，基于35個(gè)拷貝數(shù)的B1基因、P30基因，以及核糖體第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS-1序列）等。

Homan等[17]從弓形蟲基因組中鑒定出200～300個(gè)拷貝的529 bp DNA片段，可作為遺傳標(biāo)記，用于弓形蟲與其他寄生蟲的種間鑒定。宋慧群等[18]對(duì)我國(guó)不同宿主、不同地域的9個(gè)弓形蟲蟲株及國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株（RH株），在529 bp重復(fù)序列的變異進(jìn)行研究，進(jìn)一步證實(shí)了該DNA片段可用于種間鑒定。Edvinsson等[19]針對(duì)529 bp重復(fù)序列181～274 bp位設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)下限約為1個(gè)弓形蟲速殖子。Opsteegh等[20]針對(duì)529 bp重復(fù)序列243～405 bp位設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)下限約0.14個(gè)速殖子。趙東岳等[21]針對(duì)529 bp重復(fù)序列178～376 bp位設(shè)計(jì)引物，最低檢出限僅為173個(gè)拷貝。候照峰等[22]針對(duì)529 bp重復(fù)序列268～359 bp位設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)下限10個(gè)拷貝，約0.03～0.05個(gè)速殖子。

B1基因是從弓形蟲RH株基因組文庫(kù)中克隆篩選的1個(gè)2.2 kb的片段，它是在整個(gè)基因組中有35個(gè)拷貝的串聯(lián)重復(fù)片段。Hoyen等[23]應(yīng)用B1基因設(shè)計(jì)合成引物，成功建立了巢式PCR方法用于檢測(cè)病人血液樣品中的弓形蟲。王海燕等[4]以B1基因作為弓形蟲種特異的遺傳標(biāo)記，建立診斷弓形蟲病特異性的PCR方法，最低能檢測(cè)到10個(gè)弓形蟲速殖子DNA。P30基因?yàn)榫幋a弓形蟲速殖子表膜蛋白。Sawa等[24]首先應(yīng)用P30基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)對(duì)所檢測(cè)的7株弓形蟲株都能擴(kuò)增，且對(duì)任何其他寄生蟲與微生物都未見(jiàn)擴(kuò)增。崔平等[25]以P30基因設(shè)計(jì)引物建立的PCR方法，最低能檢測(cè)到5個(gè)弓形蟲速殖子的DNA?？椎孟璧萚26]以P30基因設(shè)計(jì)了3條特異性引物，建立了半巢式PCR方法，最低檢測(cè)的DNA含量為18 fg。

ITS序列是各物種間相對(duì)較為保守的序列，已成為在序列水平上探討科內(nèi)、屬間及種間遺傳關(guān)系的有效手段。Homan等[27]證實(shí)ITS-1可作為分子標(biāo)記物，用于弓形蟲與其他原蟲的種間鑒定。Jauregui等[28]根據(jù)弓形蟲ITS-1序列設(shè)計(jì)引物建立PCR，敏感性最少可檢100 fgDNA，相當(dāng)于1個(gè)蟲體的DNA含量。謝德華等[29]以ITS-1序列作為弓形蟲種特異性的遺傳標(biāo)記，建立了PCR方法。廖申權(quán)等[30]應(yīng)用該法對(duì)2例豬弓形蟲病進(jìn)行了特異診斷。邵國(guó)青等[31]以弓形蟲ITS-1序列為遺傳標(biāo)記建立PCR，最低可以檢測(cè)1 pg弓形蟲速殖子DNA，相當(dāng)于10個(gè)速殖子的DNA。黃翠琴等[32]分別以弓形蟲ITS-1序列和529 bp重復(fù)序列為目的片段，對(duì)疑似豬弓形蟲病的病料進(jìn)行PCR診斷。

弓形蟲微線體蛋白MIC是分布于蟲體前端棒狀體周圍的微線體所分泌的粘附因子。MIC3在弓形蟲的速殖子、緩殖子和子孢子期都能表達(dá)，在弓形蟲病的早期診斷中具有重要價(jià)值。任科研等[33]以MIC3基因作為弓形蟲特異的遺傳標(biāo)記，建立了PCR方法，為弓形蟲基因重組疫苗奠定了基礎(chǔ)。

3.2 熒光定量PCR

王頻佳等[34]、Lin等[35]先后建立了以弓形蟲高度保守的529 bp重復(fù)序列作為檢測(cè)靶基因的熒光定量PCR。候照峰等[22]以529 bp重復(fù)序列作為靶基因建立了熒光定量PCR方法，檢測(cè)的69個(gè)組織樣品中，熒光定量PCR方法的檢出率（50.7%）明顯高于常規(guī)PCR方法的檢出率（34.8%）。朱祥明等[36]建立了以B1基因作為檢測(cè)靶基因的弓形蟲SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)方法。Edvinsson等[19]分別以529 bp重復(fù)序列和B1基因?yàn)榘谢蚪晒舛縋CR方法，發(fā)現(xiàn)529 bp的靈敏性是B1基因的10倍。Menotii等[37]根據(jù)529 bp序列設(shè)計(jì)Taq Man-AF-PCR檢測(cè)方法，與B1-PCRELISA檢測(cè)方法相比，144份臨床樣本中，B1-PCR-ELISA檢測(cè)出的72份陰性樣本，經(jīng)過(guò)Taq Man-AF-PCR檢測(cè)出15份（20.8%）為陽(yáng)性，且可提前4～10 d檢測(cè)到病原。趙東岳等[38]以529 bp重復(fù)序列、ITS-1序列和B1基因作為檢測(cè)的靶基因，建立檢測(cè)弓形蟲的三重SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，并與ELISA進(jìn)行比較，陽(yáng)性符合率為53.44%（P<0.01），表明建立的三重SYBR Green I熒光定量PCR具有高特異性和敏感性，可為臨床弓形蟲的診斷提供科學(xué)依據(jù)。

3.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）

謝德華等[39]通過(guò)對(duì)我國(guó)不同來(lái)源、不同宿主的4個(gè)弓形蟲蟲株以及國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株RH株的致密顆粒抗原（GRA6）基因進(jìn)行PCR-RFLP分析，結(jié)果證明弓形蟲包含了I和II基因型。Su等[40]利用10個(gè)基因標(biāo)記物建立了多重多位點(diǎn)巢式PCRRFLP進(jìn)行基因分型。Zhou等[41]從來(lái)自我國(guó)湖北省、河南省的434頭病豬中分離出16個(gè)弓形蟲蟲株，用PCR-RFLP方法也鑒定出2個(gè)基因型。

3.4 原位PCR（In Situ PCR，IS-PCR）

盧慎[42]應(yīng)用免疫組化、原位雜交及間接原位PCR技術(shù)，檢測(cè)組織細(xì)胞中的弓形蟲，結(jié)果表明弓形蟲檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率從高到低依次為間接原位PCR、原位雜交及免疫組化。

3.5 免疫-PCR（I-PCR）

李輝等[43]建立免疫-PCR檢測(cè)弓形蟲抗原最低濃度為0.1 ng/mL，I-PCR檢測(cè)弓形蟲抗原靈敏度高于傳統(tǒng)ELISA檢測(cè)6 000倍，高于ABCELISA 750倍。

3.6 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）

鄒杰等[44]建立的弓形蟲LAMP法能夠檢測(cè)出10個(gè)拷貝的目的基因。余傳信等[45]依據(jù)弓形蟲的B1基因設(shè)計(jì)引物建立LAMP方法，其敏感性是常規(guī)PCR的10倍。Sotiriadou等[46]分別以LAMP和套式PCR方法對(duì)26個(gè)弓形蟲的陽(yáng)性水樣進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果LAMP的檢出率為100%，而套式PCR的檢出率為53.8%。Zhang等[47]根據(jù)弓形蟲529 bp重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)疑似弓形蟲感染的豬分別以常規(guī)PCR方法和已建立的LAMP方法檢測(cè)其淋巴結(jié)樣本，結(jié)果LAMP檢測(cè)的陽(yáng)性率為85.7%，而常規(guī)PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率為76.9%。曹利利等[48]在建立LAMP方法的基礎(chǔ)上，對(duì)吉林省部分地區(qū)的423份豬血液樣本進(jìn)行了豬弓形蟲病檢測(cè)，陽(yáng)性率為7.8%（33/423），表明該地區(qū)仍是豬弓形蟲病的流行地區(qū)。

4 小結(jié)

豬弓形蟲感染途徑多、傳播方式廣，且目前尚無(wú)特效治療藥物和方法。因此，加強(qiáng)養(yǎng)殖環(huán)節(jié)對(duì)該病的預(yù)防控制，提高豬產(chǎn)品中弓形蟲檢測(cè)技術(shù)水平，對(duì)減少其對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害、降低其通過(guò)豬產(chǎn)品而致人感染的風(fēng)險(xiǎn)性，具有極其重要的意義。目前，豬弓形蟲病檢測(cè)方法很多，其中以病原學(xué)方法結(jié)果最為可靠，但其敏感性低，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。常規(guī)的免疫學(xué)方法雖具有簡(jiǎn)易、快速等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果的分析要慎重。以PCR為代表的分子生物學(xué)方法具有敏感、特異、檢測(cè)迅速等優(yōu)點(diǎn)，能直接反應(yīng)現(xiàn)癥感染，但存在假陽(yáng)性、操作繁瑣、需專用儀器等缺點(diǎn)。因此，在實(shí)際中應(yīng)按照國(guó)家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)業(yè)主生產(chǎn)環(huán)節(jié)及加強(qiáng)防疫衛(wèi)生的需要，選擇弓形蟲病檢測(cè)方法和配套試劑，以滿足生產(chǎn)管理和公共衛(wèi)生需求，使豬弓形蟲病檢測(cè)方法得到更快、更好的發(fā)展。

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（責(zé)任編輯：杜憲）

Research Progress on Detection Methods of Swine Toxoplasmosis

Zhuang Jinqiu，Mei Jianguo，Zhang Ying，Yang Limei，Li Feng，Shen Zhiqiang
（Binzhou Animal Science and Veterinary Medicine Academy，Binzhou，Shandong 256600）

Toxoplasmosis is a zoonotic parasitic disease. The research progress on the latest detection methods of Swine Toxoplasmosis were introduced in this paper，inluding the pathogenic serological detection methods，detection methods（including agglutination test and ELISA），molecular biological detection methods（including PCR，PCR，PCR-RFLP，fluorescence quantitative PCR，in situ immune -PCR，loop mediated isothermal amplification of probe and nuclear technology）and so on. The advantages and disadvantages of different detection methods were analyzed，in order to provide reference for the detection and prevention of Swine Toxoplasmosis

Toxoplasma gondii；swine toxoplasmosis；detection method；research advance

S855.9+9

：B

：1005-944X（2017）06-0063-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.06.020

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2015GSF121027）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-08-17）