念珠菌菌株分型實驗研究進展

項國仕， 程 曦， 黃孝天

·綜述·

念珠菌菌株分型實驗研究進展

項國仕， 程 曦， 黃孝天

念珠菌； 菌株分型； 基因分型； 分型方法

菌株分型是通過分類，比較不同分離株之間的遺傳相關性和差異性，并結合其流行病學特點，探討菌株之間進化關系的一種研究手段。臨床念珠菌分型在研究其物種相關性、評估流行病學、追溯流行源頭、控制和預防臨床感染以及抗真菌藥物研發(fā)和抗真菌治療等方面具有重要的指導意義。本文將從原理和優(yōu)缺點等方面，介紹當前念珠菌屬主要分型方法及新型分型方法，包括基于蛋白/酶的分型方法、基于精準DNA序列的分型方法、無需精準DNA序列的分型方法等。

1 基于蛋白/酶的分型方法

1.1 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）

研究證實質譜儀可以用于細菌分型，病原菌鑒定通?；诓煌N屬微生物的保守蛋白峰，而對同一物種的高分辨力分型則依賴于不同分離株特異的蛋白峰[1]，其鑒定的結果穩(wěn)定、可靠[2]。2009年，MALDI-TOF MS被首次用于酵母的鑒定，2011年，開始將其應用于酵母和類酵母等的分型。隨著念珠菌MALDI-TOF MS蛋白質譜數據庫的不斷完善，MALDI-TOF MS用于臨床念珠菌分型成為可能。

MALDI-TOF MS最突出的優(yōu)勢是簡易快速、重復性較好，并且具有高通量、所需材料少等特點，尤其適合于臨床病原微生物暴發(fā)的相關研究[3]。MALDI-TOF MS可以通過建立蛋白質譜數據庫以用于不同臨床分離株的對比和不同實驗室的交流，但是目前單一念珠菌物種的蛋白質譜數據庫并不完善，一些罕見念珠菌的蛋白圖譜尚未被現有數據庫收錄。2014年，De Carolis等[4]利用MALDITOF MS和擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）分別對近平滑念珠菌復合體進行了鑒定和分型，結果證明，兩種方法對于近平滑念珠菌復合體的鑒定與核糖體DNA測序結果一致；MALDI-TOF MS分型結果與AFLP相似，但作為真菌分型工具，其利用價值需要進一步評估。目前，MALDI-TOF MS在微生物分型方面尚未普及，且沒有規(guī)范化的操作或標準，因此具有很大的研發(fā)空間和潛能。

1.2 多位點酶電泳（MLEE）

MLEE的理論依據是“一基因一酶”學說，它是基于菌株同工酶（isoenzymes）或異型酶（allozymes）（主要為代謝酶，代謝酶基因在環(huán)境選擇壓力下比較穩(wěn)定）多態(tài)性的一種分型方法。2012年，Santos等[5]利用MLEE對分離于陰道念珠菌病患者的28株白念珠菌進行了分型，其中16株白念珠菌為高度相關，證明MLEE具有強大的菌株區(qū)分能力和很好的重復性。然而，至少需要檢測10種以上的酶才能使菌株之間具備足夠的可變性，這無疑增加了實驗成本。另外，由于所檢測的代謝酶基因變異緩慢以及密碼子的兼并性等因素，導致MLEE并沒有足夠的靈敏度以檢測出念珠菌亞種的快速而細微的變化[6]。最后，MLEE分型不便于不同實驗室之間的數據交流和對比研究。盡管如此，在評價菌株遺傳相關性時，這種分型方法優(yōu)于其他一些流行的DNA印記的方法。

2 基于精準DNA序列的分型方法

2.1 重復序列依賴PCR（REP-PCR）

REP-PCR是目前較為常用的分型方法之一，該方法使用特異引物擴增貫穿于真菌基因組的非編碼短重復序列，擴增片段經瓊脂糖凝膠電泳分離后染色，即可顯示出不同的帶型。目前，REPPCR因其快速、經濟而被廣泛用于多種臨床病原微生物的流行病學研究中，如白念珠菌及其他念珠菌等[7-8]。

REP-PCR分型技術不僅可以很好地區(qū)分種間差異，同時能夠揭示種內差異。它具有與隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）類似的優(yōu)點：簡單快捷、經濟方便。相對于RAPD分型，REP-PCR使用特異引物，圖譜條帶更加清晰，而且重復性更好。2014年，Tamai等[7]對分離于HIV陽性患者口腔的100株白念珠菌進行了25S rDNA分型，結果分為3個基因型（A型、B型和C型）；隨后利用靶向PRS基因ALT重復序列的特異引物分別對3種基因型的菌株進行REP-PCR分型，將每種基因型的菌株進一步分為4個亞型，證明REA-PCR是一種快速簡單的基因分型技術，不僅可以從近緣種中區(qū)分出白念珠菌，并且對于念珠菌感染皮膚病學分子水平上的管理和控制非常有用。然而，與RAPD一樣，REP-PCR分型技術同樣也受實驗條件的影響，PCR所用的Mg2+濃度、Taq酶來源、模板完整性以及PCR儀自身的不穩(wěn)定因素等都可能影響最終的帶型。目前市場上已有商品化REPPCR分析系統，可實現REP-PCR的半自動化和規(guī)?；⑶揖哂懈啽?、標準化、高重復性的特點。

2.2 微衛(wèi)星長度多態(tài)性（MLP）

MLP基于基因組中由2～6 bp短重復序列組成的微衛(wèi)星序列拷貝數的高度變異性。MLP根據特定微衛(wèi)星序列設計引物，PCR擴增該微衛(wèi)星位點的核心序列和部分側翼序列，擴增產物經凝膠電泳分離形成不同大小的條帶。Li等[9]對白念珠菌的微衛(wèi)星分析分型系統作了改進并廣泛用于白念珠菌及其他念珠菌[10]的基因分型。

MLP是一種新型有效的分型方法，其突出的優(yōu)勢在于高分辨率、高通量、自動化，甚至可以建立數據庫用于不同實驗室交流或數據的比較研究。然而，MLP分辨力依賴于所用的微衛(wèi)星標記，不同實驗室難以實現標準化程序。此外MLP重復性不高，容易受實驗條件影響。Li等[11]建立了一項基于單鏈構造多態(tài)性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）技術的PCR-SSCP方法，使用CAI引物進行微衛(wèi)星多態(tài)性分析，不僅可以獲得較高的分辨力，而且該方法同時檢測3個不同水平的微衛(wèi)星多態(tài)性，已成為臨床實驗室白念珠菌快速分型和微進化檢測有力的、經濟的分型方法。

2.3 多位點序列分型（MLST）

MLST是由MLEE衍化而來的一項基于測序技術的基因分型技術。MLST基于6～11個管家基因（500 bp左右）的內部片段核苷酸序列中的多態(tài)性位點（SNP），每一個管家基因片段所有SNP的排列組合形式按照發(fā)現的先后順序分配一個等位基因號（allele number），所有等位基因號組成菌株的等位基因圖譜，每一個不同的基因圖譜分配一個序列號，即為該菌株的序列型（sequence type， ST）。遺傳相關的菌株等位基因號的排列組合相似，反之，不相關菌株的親緣關系較遠。2003－2004年，Bougnoux等[12]評估了MLST在白念珠菌分型中的價值，并確定了白念珠菌MLST分型的國際金標準。

MLST突出表現是擁有標準化策略、數字化數據、高分辨力、高重復性和高準確性的特點。2015年，Wu等[13]利用MLST對62株白念珠菌進行分型，共得到50個ST，其中新發(fā)現41個ST，證明MLST是研究白念珠菌流行病學和進化的有用工具。MLST分型是目前唯一建立了數據庫的基因分型方法，目前已建立了MLST數據庫的念珠菌包括白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌和熱帶念珠菌等4種臨床常見念珠菌。MLST分型標準化的策略和數據庫的建立使其可以在全球范圍內各國家或地區(qū)的不同實驗室之間，通過互聯網進行交流、比較以及數據更新。因此，MLST分型是念珠菌群體遺傳、分子系統發(fā)生學和流行病學研究的最佳手段之一。

然而，MLST分型的成本較高，對于一些地區(qū)或實驗室并非能首選。MLST分析的管家基因片段大小在300～500 bp，并且分布于特定的幾條染色體上，因此，相同序列號的菌株之間實際上在待測片段以外的其他區(qū)域序列可能并不相同；不同SNP排列組合可能因念珠菌的二倍體性質而分配到同樣的序列號；此外，一些念珠菌如近平滑念珠菌的管家基因序列差異較小，這些物種并不適合使用MLST分型[14]。

3 無需精準DNA序列的分型方法

3.1 脈沖場凝膠電泳（PFGE）

PFGE技術利用規(guī)律變化的電場來促使染色體片段在凝膠中迂回遷移而達到分離染色體片段的目的。相對于染色體大小為1～4 Mb的念珠菌而言，PFGE是一種分離染色體DNA分子、分析染色體帶型以及檢測染色體組型變化的理想方法。目前基于PFGE技術的分型方法包括核型分析（electrophoretic karyotyping，EK）和染色體限制酶片段模型（chromosomal restriction fragment pattern）等。EK被廣泛地運用于白念珠菌及其他念珠菌分型中。其優(yōu)點是重復性好，對帶型的解釋明確。然而，受念珠菌染色體數目以及單個染色體大分子量的限制，EK并沒有足夠的能力區(qū)分中度相關的分離株，也不能檢測出同一菌株微進化。另一方面，EK操作復雜枯燥，所需設備成本高，并且耗時費力。

3.2 RAPD

RAPD分型技術使用1條含8～10個堿基的隨機引物，以基因組DNA為模板，在較低嚴格條件下（如退火溫度為35 ～40 ℃，Mg2+濃度為2.5 mmol/L）進行PCR擴增，并產生許多未知大小的DNA片段；PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離組成RAPD帶型。RAPD帶型的區(qū)分依賴于電泳條帶的數量和大小，遺傳上不相關的菌株帶型差異較大。

RAPD的缺點是重復性不高，難以實現結果比較。然而RAPD分型技術不需要獲知待測物種準確的基因組序列信息，具有較高的靈敏度和特異度[15]，并且該方法簡單快速、成本較低，因此被廣泛應用于念珠菌及其他真菌的基因分型中[16-17]。Wu等[16]利用25S rDNA和RAPD分別對分離于牙齒的40株白念珠菌進行了分型，結果顯示，25S rDNA將40株分離株分為3個基因型，而RAPD分為5個基因型，證明RAPD是可靠全面的分型方法。此外，有研究者認為分別使用不同隨機引物進行RAPD分型，并組成復合圖譜，可以提高RAPD的分辨力。

3.3 PCR解鏈曲線圖形（PCR melting profle，PCR MP）

DNA測序表明：在GC含量上，基因組DNA片段表現出大量的異質性。限制性內切酶消化后的基因組DNA片段的解鏈溫度依賴于這些片段的長度和GC含量。也就是說，消化后的基因組DNA熱穩(wěn)定性是存在差異的。PCR MP最初用于大腸埃希菌的臨床菌種分型，2009年首次用于白念珠菌的基因分型。

PCR MP是一種新型基因分型方法，目前在念珠菌中應用不多[18-19]。2014年，Golas等[18]利用PCR MP將115株光滑念珠菌分為52個不同帶型，確認了PCR MP對于區(qū)分光滑念珠菌種內遺傳關聯的有用性。PCR MP分型的優(yōu)點是DNA用量少，操作簡易，重復性好，結果簡單易于分析，并且對DNA完整性和實驗設備要求不高，是一種快速、經濟的分型方法，尤其適合于臨床重要真菌短期流行病學研究。然而，PCR MP的分辨力與選用的限制酶和Taq酶有關，同時對PCR擴增的變性溫度和退火溫度較為敏感，因而對反應條件的優(yōu)化必不可少，選擇合適的限制酶和Taq酶尤為重要。

4 小結與展望

念珠菌分型是念珠菌流行病學和種群結構研究的有用工具，種群結構的研究有利于抗真菌藥和治療方案的選擇。MLP和MLST作為準確DNA依賴的分型方法，產生的結果精確、分辨力高、重復性好，并且可建立數據庫。相對于其他分型方法，MLP和MLST更適合于全球范圍內的流行病學研究。新興分型方法MALDI-TOF MS雖然需要質譜儀，但其通量大，結果簡單，耗時短；PCR MP分辨力中等，介于RAPD和MLST之間，是一種新興的、快速簡易、結果簡單、經濟靈敏的中通量分型方法。這兩種分型方法更適合于臨床實驗室已知菌株臨床流行病學的大規(guī)模調查研究。PFGE、RFLP和RAPD等分型方法不需要獲知待測菌株的具體遺傳信息，對于臨床上未知菌株的分類鑒定和種群結構研究較為適合。因此，合適的分型方法應根據實際情況（如研究目的、實驗條件等）進行選擇。

目前，相關研究者常常結合多種分型方法進行對比研究，如將基因分型方法和表型分型方法（如耐藥性、毒性等）結合，研究不同表型菌株的種群結構和微進化關系等。在念珠菌分型研究中，未來的10年內這種結合多種分型方法對比研究的趨勢可能將更加明顯；另外，先使用一種分辨力較低或中等的分型方法（如RAPD、ABC分型、PCR 25S rDNA和PCR MP等）進行粗略分型，然后使用準確性更高的分型方法（如MLP和MLST等）對前者難以區(qū)分的遺傳密切相關菌株進行精確分型。這樣結合不同分型方法，不但可以減少工作量和實驗費用，而且同樣可以達到較為理想的菌株分型目的。此外，隨著測序技術的不斷發(fā)展，未來測序費用降低，屆時基于完整基因組比對的基因分型或將成為臨床念珠菌分型的常規(guī)方法。

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Research updates on the typing of Candida

XIANG Guoshi, CHENG Xi, HUANG Xiaotian. （Department of Medical Microbiology, Medical College, Nanchang University, Nanchang 330006, China）

R379.4

A

1009-7708 ( 2017 ) 02-0215-04

10.16718/j.1009-7708.2017.02.020

2016-02-23

2016-03-16

國家自然科學基金（81160196, 8460300），江西省青年科學家培養(yǎng)項目（20133BCB23005），江西省科學技術項目（20142BAB215053）聯合資助。

南昌大學醫(yī)學部微生物學教研室，南昌 330006。

項國仕（1990—），男，碩士研究生，主要從事病原微生物研究。

黃孝天，E-mail：xthuang@ncu.edu.cn。