臨床分離黏質(zhì)沙雷菌的耐藥性及對(duì)亞胺培南耐藥機(jī)制

郭 普， 喬 艷， 張海濤， 李 竟

·論著·

臨床分離黏質(zhì)沙雷菌的耐藥性及對(duì)亞胺培南耐藥機(jī)制

郭 普， 喬 艷*， 張海濤， 李 竟

目的了解黏質(zhì)沙雷菌耐藥性及對(duì)亞胺培南耐藥機(jī)制。方法收集安徽省蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2013年1月－2014年12月臨床分離的152株黏質(zhì)沙雷菌，紙片擴(kuò)散法和儀器法測定菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥性。對(duì)篩選出的亞胺培南耐藥黏質(zhì)沙雷菌，采用改良Hodge試驗(yàn)和EDTA協(xié)同試驗(yàn)進(jìn)行碳青霉烯酶表型檢測，瓊脂稀釋法檢測加入外排泵抑制劑MC207110前后亞胺培南MIC值的變化。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測碳青霉烯酶、AmpC酶及外膜蛋白基因的攜帶情況。結(jié)果152株黏質(zhì)沙雷菌中87株對(duì)亞胺培南耐藥，亞胺培南耐藥菌株中12株改良Hodge試驗(yàn)陽性，9株EDTA協(xié)同試驗(yàn)陽性。46株加入外排泵抑制劑MC207110后亞胺培南MIC降低為原來的1/4～1/64；檢出KPC耐藥基因5株，IMP耐藥基因8株，DHA耐藥基因6株，外膜蛋白缺失16株。結(jié)論該院臨床分離的黏質(zhì)沙雷菌耐藥情況嚴(yán)重，主要耐藥基因型為KPC、IMP和DHA型。外膜蛋白缺失以及外排泵可能也是介導(dǎo)耐藥的主要原因。

黏質(zhì)沙雷菌； 亞胺培南； 耐藥

黏質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens）屬腸桿菌科，在自然界分布廣泛，已成為醫(yī)院感染重要的條件致病菌[1]。碳青霉烯類是一類廣譜、快速殺菌的β內(nèi)酰胺類抗生素（包括亞胺培南、美羅培南和厄他培南等），是目前治療產(chǎn)酶的腸桿菌重癥感染最有效的藥物之一。但近年來對(duì)該類藥物耐藥的腸桿菌檢出率有上升的趨勢，使臨床抗感染治療面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，引起了臨床的高度關(guān)注[2]。為了解蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院黏質(zhì)沙雷菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥情況，本研究對(duì)我院臨床分離的黏質(zhì)沙雷菌耐藥性及亞胺培南耐藥基因進(jìn)行檢測分析?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 收集2013年1月－2014年12月我院臨床分離的黏質(zhì)沙雷菌152株（去除重復(fù)菌株），其中來自痰標(biāo)本129株（84.9%）、創(chuàng)面分泌物18株（11.8%）、尿液3株（2.0%）、血液2株（1.3%）。標(biāo)本的采集、送檢、處理依據(jù)第三版《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》。

1.1.2 儀器與試劑 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏系統(tǒng)（法國梅里埃公司）；PCR儀（德國Biomera公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）。外排泵抑制劑MC207110（美國Sigma公司）；亞胺培南（杭州默沙東制藥有限公司）。

1.1.3 質(zhì)控菌株 大腸埃希菌 ATCC25922購自國家衛(wèi)生計(jì)生委臨床檢驗(yàn)中心。陽性對(duì)照的產(chǎn)酶菌株由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院沈繼錄博士惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn) 細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)采用VITEK 2-compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析儀或紙片擴(kuò)散法，藥敏卡片使用GN13。采用2014版CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏結(jié)果判斷。

1.2.2 碳青霉烯酶表型檢測

1.2.2.1 改良Hodge試驗(yàn) 參照 CLSI 2014版方法，配制0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝淮竽c埃希菌ATCC25922菌液，再用生理鹽水1∶10稀釋，用無菌棉簽均勻涂布MH平皿。在平皿中間貼厄他培南（10 μg）紙片，用無菌接種環(huán)取少量待檢菌，自紙片外緣向平皿邊緣劃線。待平皿干燥后放35 ℃孵箱，16～20 h培養(yǎng)。以產(chǎn)KPC陽性菌作對(duì)照，抗菌藥物抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)矢狀生長者為產(chǎn)碳青霉烯酶菌株。

1.2.2.2 EDTA協(xié)同試驗(yàn) 將待測菌株轉(zhuǎn)至血平皿孵育過夜，挑取單個(gè)生長的菌落配制濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木海脽o菌拭子將菌液均勻涂抹在MH瓊脂平皿上，在平皿中間相距約5 cm處貼加2張亞胺培南紙片，并用加樣槍在其中1張上滴加已配制好的0.5 mol/L的EDTA 4 μL，孵育過夜，以2張紙片抑菌圈大小相差7 mm以上為產(chǎn)酶菌株。

1.2.2.3 外排泵機(jī)制檢測 在采用瓊脂稀釋法測定亞胺培南單藥MIC的同時(shí)另設(shè)一組加入外排泵抑制劑MC207110（終濃度為20 mg/L）的亞胺培南的試驗(yàn)組。亞胺培南的濃度范圍為128～0.06 mg/L。外排泵表型檢測結(jié)果的判斷以添加和不添加MC207110時(shí)MIC值降低為原來的1/4或更低者可推斷認(rèn)為該菌耐藥性有外排泵機(jī)制參與。

1.2.3 PCR擴(kuò)增和序列分析

1.2.3.1 試驗(yàn)引物 本試驗(yàn)中所使用的引物參照參考文獻(xiàn)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物相關(guān)信息見表1[3-5]。

1.2.3.2 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體積為50 μL，反應(yīng)體系：EX Taq酶0.5 μL、10×PCR buffer （Mg2+plus） 5 μL、dNTP Mixture 4 μL、模板DNA 3 μL、引物F（10 μmol/L） 1 μL、 引 物R（10 μmol/L） 1 μL、H2O 35.5 μL。循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃解鏈30 s、退火（溫度見表1）30 s、72?℃延伸60 s、30個(gè)循環(huán)、72?℃延伸10 min、4?℃保溫停止。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳、成像及結(jié)果分析，同時(shí)設(shè)空白為陰性對(duì)照，產(chǎn)酶株為陽性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 菌株來源和科室分布

152株黏質(zhì)沙雷菌主要來自呼吸道標(biāo)本，占84.9%。該菌在ICU占比率最高，其次為老年病科，分別為32.9%和19.1%，其在不同科室分布見表2。

2.2 黏質(zhì)沙雷菌的藥敏分析

152株黏質(zhì)沙雷菌對(duì)14種抗菌藥物存在不同程度耐藥，對(duì)頭孢唑林、氨芐西林、氨曲南和頭孢曲松耐藥率較高，分別為100%、90.8%、90.8%和82.2%；對(duì)亞胺培南耐藥率為57.2%，對(duì)阿米卡星較為敏感，耐藥率為34.2%。見表3。

2.3 黏質(zhì)沙雷菌耐藥表型及基因檢測結(jié)果

87株對(duì)亞胺培南耐藥菌株中12株改良Hodge試驗(yàn)陽性，9株EDTA協(xié)同試驗(yàn)陽性。檢出耐藥基因KPC 5株，IMP 8株，DHA 6株，外膜蛋白缺失16株，未檢出其他耐藥基因，耐藥基因檢測結(jié)果見表4。部分菌株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

2.4 黏質(zhì)沙雷菌主動(dòng)外排泵篩選檢測結(jié)果

87株對(duì)亞胺培南耐藥菌株中46株加入MC207110前后亞胺培南的MIC值由32～128 mg/ L降低至2～16 mg/L。

表1 各基因型片段引物序列、退火溫度及產(chǎn)物長度Table 1 The primer sequences， annealing temperature used in this study and the expected product size

表2 152株黏質(zhì)沙雷菌臨床科室分布Table 2 Source of 152 Serratia marcescens strains by clinical department

3 討論

黏質(zhì)沙雷菌屬腸桿菌科，是醫(yī)院感染重要的條件致病菌，在患者機(jī)體免疫力低下時(shí)常引起尿路感染、呼吸道感染、血流感染和全身性感染等[6]。黏質(zhì)沙雷菌對(duì)多種抗菌藥物存在不同程度的耐藥，特別是碳青霉烯類抗生素耐藥菌株多為多重耐藥菌株，其耐藥機(jī)制復(fù)雜[5]。因此，研究黏質(zhì)沙雷菌的耐藥機(jī)制，指導(dǎo)臨床合理用藥，減少耐藥發(fā)生成為迫切需要解決的問題。

表3 152株黏質(zhì)沙雷菌對(duì)14種抗菌藥物耐藥率和敏感率Table 3 Susceptibility of 152 strains of Serratia marcescens to 14 antimicrobial agent（%）

2013－2014年，我院共分離出152株黏質(zhì)沙雷菌，主要分離自ICU、老年病科及外科等科室的患者；主要來源于痰和創(chuàng)面分泌物標(biāo)本。ICU、老年病科患者往往基礎(chǔ)病嚴(yán)重，免疫力低下，住院時(shí)間長，使用呼吸機(jī)等侵襲性操作，長期大劑量抗生素的使用等因素易引起感染[7]。外科手術(shù)也增加了感染的機(jī)會(huì)。152株黏質(zhì)沙雷菌對(duì)多數(shù)常用抗菌藥物耐藥率較高，對(duì)氨芐西林、頭孢唑林、頭孢曲松等β內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥率都高于60%。對(duì)碳青霉烯類抗生素亞胺培南的耐藥率也高達(dá)57.2%，顯著高于2014年CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測結(jié)果6.7%[8]和全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)Mohnarin 2011－2012年細(xì)菌耐藥監(jiān)測結(jié)果6.7%[9]。

表4 87株亞胺培南耐藥黏質(zhì)沙雷菌耐藥基因陽性率Table 4 The resistance genes identifed in 87 strains of imipenem-resistant Serratia marcescens

圖1 OprD2基因型PCR檢測結(jié)果Figure 1 PCR analysis of OprD2 gene

對(duì)碳青霉烯類抗生素的主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)水解碳青霉烯類抗生素的β內(nèi)酰胺酶（碳青霉烯酶）。碳青霉烯酶可分為兩大類，一類為活性中心含有絲氨酸的酶包括A組NmcA、Smel～3、KPC-1～4、GES-2和D組OXA家族的OXA-23～27、40、48等；另一類為金屬酶IMP家族、GIM-1、VIM家族、SPM-1、SIM等酶[10-12]。本研究中87株耐亞胺培南黏質(zhì)沙雷菌12株改良Hodge試驗(yàn)陽性，9株EDTA協(xié)同試驗(yàn)陽性。進(jìn)一步進(jìn)行碳青霉烯酶耐藥基因檢測發(fā)現(xiàn)，檢出5株攜帶KPC基因，8株菌檢出IMP基因，與相關(guān)報(bào)道不一致。孫瑤等[13]報(bào)道，黏質(zhì)沙雷菌碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制主要是產(chǎn)碳青霉烯酶KPC-2、EBC。謝在海等[5]報(bào)道的耐藥基因型主要是KPC和MOX。這可能與各地區(qū)抗生素選擇性壓力及耐藥性的傳播不同有關(guān)。相關(guān)報(bào)道顯示高產(chǎn)染色體介導(dǎo)的AmpC酶和孔蛋白丟失引起通透性下降的協(xié)同作用也可引起碳青霉稀類抗生素耐藥[14]，本組87株耐亞胺培南的黏質(zhì)沙雷菌中介導(dǎo)AmpC酶的DHA基因檢出6株，16株檢出有外膜蛋白缺失，其中DHA基因陽性的菌株中5株伴有外膜蛋白缺失，提示AmpC酶產(chǎn)生合并外膜蛋白缺失也是導(dǎo)致該組菌亞胺培南耐藥的原因之一。另外，相關(guān)報(bào)道AcrAB、SdeXY、SmdAB、SmfY等外排泵系統(tǒng)的高表達(dá)也是引起黏質(zhì)沙雷菌耐碳青霉烯類抗生素的重要耐藥機(jī)制[15]。對(duì)本研究中87株耐亞胺培南的黏質(zhì)沙雷菌用MC207110進(jìn)行外排泵篩選試驗(yàn)，結(jié)果有46株菌亞胺培南的MIC降低為原來的1/4～1/64，提示外排泵的高表達(dá)可能是介導(dǎo)本組菌耐藥的又一重要原因，有待于近一步用RT-PCR對(duì)外排泵的表達(dá)量進(jìn)行檢測，探明外排泵與耐藥之間的關(guān)系。另外，本研究中耐亞胺培南的87株菌中還有25株菌未檢出相關(guān)耐藥基因，外排泵初篩試驗(yàn)也陰性，可能存在少見或者新的耐藥基因，有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，我院黏質(zhì)沙雷菌對(duì)多種抗菌藥物耐藥率高，耐藥機(jī)制復(fù)雜，臨床應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果規(guī)范合理使用抗生素，同時(shí)加強(qiáng)醫(yī)院感染的監(jiān)控，以減少耐藥菌株的產(chǎn)生和播散。

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Profile and mechanism of imipenem resistance in clinical isolates of Serratia marcescens

GUO Pu, QIAO Yan, ZHANG Haitao, LI Jing. （Department of Laboratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu Anhui 233004, China）

ObjectiveTo investigate the profile and mechanism of imipenem resistance in the clinical isolates of Serratia marcescens.MethodsA total of 152 strains of S. marcescens were isolated from January 2013 to December 2014. Disk diffusion method and automated systems were used to determine the susceptibility of the isolates. The modifed Hodge test and EDTA synergy test were employed to test carbapenemase phenotype. Agar dilution method in combination with effux pump inhibitor MC207110 was used to observe the change of imipenem MIC values. The genes encoding carbapenemase, AmpC beta-lactamase and outer membrane protein were detected by polymerase chain reaction.ResultsImipenem resistance was identifed in 87 of the 152 strains of S. marcescens. Modifed Hodge test was positive for 12 of the 87 imipenem-resistant S. marcescens strains. EDTA synergy test was positive for 9 of the strains. Imipenem MIC was reduced to 1/4 to 1/64 in 46 strains by agar dilution method in presence of effux pump inhibitor MC207110. Five strains were positive for KPC genes, 8 strains positive for IMP gene, and 6 strains positive for DHA gene. Loss of outer membrane protein was found in 16 strains by PCR.ConclusionsImipenem-resistant strains of S. marcescens are prevalent in our hospital. KPC, IMP, DHA genes, and loss of outer membrane proteins and effux pumps may all contribute to imipenem resistance in S. marcescens isolates.

Serratia marcescens; imipenem; antimicrobial resistance

R978

A

1009-7708 ( 2017 ) 02-0187-05

10.16718/j.1009-7708.2017.02.013

2016-06-15

2016-09-08

安徽省高校自然科學(xué)研究一般項(xiàng)目（N O. KJ2015B011by）。

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽蚌埠 233004；*感染性疾病科。

郭普（1976—），男，碩士，副主任技師，主要從事微生物感染與耐藥研究。

郭普，E-mail：3504624902@qq.com。