水貂阿留申病毒實驗室檢測方法研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國，王玉茂，姚春陽，莫 玲，沈志強(qiáng)

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

水貂阿留申病毒實驗室檢測方法研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國，王玉茂，姚春陽，莫 玲，沈志強(qiáng)

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

水貂阿留申病是一種在世界范圍內(nèi)廣泛流行的、嚴(yán)重危害水貂養(yǎng)殖業(yè)的病毒性免疫抑制性傳染病。本文介紹了水貂阿留申病毒的分離與鑒定、血清學(xué)和分子生物學(xué)最新實驗室檢測方法研究進(jìn)展，以期為防控本病提供參考。

水貂阿留申?。粰z測；研究進(jìn)展

Abstract：Aleutian disease of mink（AD）is a viral and immunosuppressive infectious disease，which is widely popular around the world and could cause serious harm to mink breeding industry. The latest research progress on laboratory detection methods of Aleutian mink disease virus was analyzed in this paper，including isolation and identification，serological and molecular biology，in order to provide reference for the prevention and control of the disease.

Key words：Aleutian disease of mink；detection；research advance

水貂阿留申?。ˋD）是由細(xì)小病毒科、阿留申病毒屬的水貂阿留申病毒（ADV）引起水貂的一種慢性、進(jìn)行性、免疫抑制性傳染病，少數(shù)呈急性經(jīng)過，多數(shù)呈慢性或隱性感染，不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。該病一方面引起成年貂繁殖能力減弱、皮張質(zhì)量和健康狀況下降以及死亡率增加；另一方面常造成新生幼貂的急性間質(zhì)性肺炎甚至死亡[1]。AD是危害世界養(yǎng)貂業(yè)的三大疫病之一，給我國水貂養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害我國毛皮產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。截至目前，該病尚無有效的疫苗進(jìn)行預(yù)防，也無特效治療方法，主要防治方法是檢測和淘汰陽性貂，逐步凈化貂群。本文綜述了水貂阿留申病毒最新實驗室檢測方法研究進(jìn)展，以期為防控本病提供參考。

1 病毒分離與鑒定

采集患病水貂脾臟、淋巴結(jié)、腎臟等實質(zhì)器官進(jìn)行研磨、除菌處理后，接種貓腎傳代細(xì)胞（CRFK）。在33 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)5～7 d，每天觀察細(xì)胞病變，如出現(xiàn)細(xì)胞變圓、脫落、變成網(wǎng)狀等病變時，需對分離病毒負(fù)染后進(jìn)行電鏡觀察鑒定。電鏡下ADV病毒粒子呈球形，直徑22～25 nm，正二十面體對稱結(jié)構(gòu)。如果細(xì)胞沒有出現(xiàn)病變，盲傳5代后對細(xì)胞分離液進(jìn)行PCR鑒定。常國權(quán)等[2]用直接電鏡（DTEM）、膠體金免疫電鏡（IEM-G）建立了對ADV的快速檢測方法，發(fā)現(xiàn)膠體金免疫電鏡的檢測效果優(yōu)于直接電鏡，能對病毒在細(xì)胞中進(jìn)行定位。病原分離鑒定是最直觀、最準(zhǔn)確的觀測病原的方法，但由于耗時久、成本高、實驗操作復(fù)雜且對人員和設(shè)備要求都較高，所以一般只用于實驗室研究，不適合臨床檢測及大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查。

2 血清學(xué)檢測方法

2.1 碘凝集試驗（IAT）

IAT是最簡單，也是最早被用于檢測ADV的非特異性檢測方法。Henson等[3]將該方法首次用于檢測AD。IAT操作簡單，方便觀察，適用于養(yǎng)殖場基層的大群檢測，此方法至今仍被我國的許多貂場及科研院所的實驗室所使用。但該法只能在水貂感染該病的3周后才能檢測到。另外所有能引起血清γ-球蛋白增高的疾病，如結(jié)核病、肝病、腎病、肺病等，均會出現(xiàn)IAT的陽性反應(yīng)。該法的檢測會有假陰性、假陽性的出現(xiàn)，因此只能作為檢測該病的一種輔助方法。

2.2 對流免疫電泳（CIEP）

對流免疫電泳（CIEP）是國際上公認(rèn)的ADV檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”。該方法操作簡單，在水貂感染ADV 7～9 d即可檢出AD抗體的存在，這一點明顯優(yōu)于IAT。同時，該方法特異性高達(dá)97%，極少出現(xiàn)假陽性結(jié)果。Cho等[4]首次報道了通過CIEP法成功根除ADV，他們用了4年時間，利用該法在加拿大的3個水貂農(nóng)場成功根除了ADV。隨后該法很快在美國、加拿大、丹麥和前蘇聯(lián)等國被廣泛采用。我國于20世紀(jì)80年代初開始應(yīng)用并逐漸全面掌握此技術(shù)，在黑龍江、吉林、遼寧、山東等地對AD進(jìn)行凈化。CIEP法最初使用的抗原多是細(xì)胞抗原或臟器抗原，這有可能增加在環(huán)境中散毒的危險。應(yīng)用重組ADV結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行CIEP檢測，可避免散毒并污染健康水貂群的危險。Clemens等[5]用重組牛痘病毒對ADV蛋白進(jìn)行表達(dá)，Christensen等[6]用腺病毒進(jìn)行表達(dá)，Knuuttila等[7]利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)在SF9細(xì)胞中表達(dá)ADV野毒株的VP2蛋白獲得抗原，均取得了成功。近年來，我國學(xué)者也開展了對重組表達(dá)蛋白的研究，曾祥偉等[8]用大腸桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)對ADV的VP2片段進(jìn)行了成功表達(dá)；張蕾等[9]將ADV VP2基因在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)。雖然CIEP法操作簡便，且具有特異性強(qiáng)、敏感性高等特點，但當(dāng)貂群中陽性率在5%以下時，應(yīng)用本法檢測發(fā)現(xiàn)每年陽性率不僅下降緩慢，有時還會發(fā)生反彈現(xiàn)象，很難徹底消滅本病。邵西群等[10]認(rèn)為CIEP檢測血液中的病毒抗體主要用于區(qū)分貂的病毒感染與未感染狀態(tài)，不能鑒別是否為AD病貂，因此用單純的CIEP檢測方法淘汰陽性貂對貂群的抗病性不利，不適用我國ADV高感染率的防制。

2.3 火箭電泳

火箭電泳又稱電泳免疫擴(kuò)散、抗原-抗體電泳或單向定量電泳。這種定量免疫電泳是對 CIEP（定性免疫電泳）的重要突破，可用于精確計算免疫球蛋白的含量。但由于這一新技術(shù)需要精密儀器、操作復(fù)雜、檢測成本高，不適用于實際應(yīng)用。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

Wright等[11]首次建立了ADVELISA檢測方法。但因當(dāng)時的假陰性率很高，限制了該法的應(yīng)用。Knuuttila等[7]通過昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組VP2蛋白病毒樣顆粒（VLPs）作為包被抗原建立了檢測ADV血清抗體的間接ELISA，以HRP標(biāo)記的山羊抗貓抗體作為二抗，檢測316份水貂血清，并與傳統(tǒng)的、以含有VP1和VP2的全病毒粒子作抗原的CIEP進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者具有較好的一致性。Andersson等[12]將此VP2-ELISA和以ADV-G細(xì)胞純化抗原為檢測抗原的間接ELISA試劑盒（ADV-G-ELISA）與傳統(tǒng)的CIEP進(jìn)行了比較研究，均以CIEP為金標(biāo)準(zhǔn)，檢測364份水貂血清，發(fā)現(xiàn)VP2-ELISA的敏感性和特異性分別為99.7%和98.3%；檢測359份水貂血清，ADV-GELISA的敏感性僅為54.3%，特異性為93.2%。目前該VP2-ELISA已發(fā)展成為一種可自動化操作的商品化ELISA試劑盒在北歐地區(qū)得到廣泛應(yīng)用。Rebekka等[13]建立了以含有整個ADV-G病毒粒子的ELISA Danad抗原為包被抗原的全自動化ELISA法，并與CIEP法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其敏感性高但特異性低。該法的優(yōu)勢在于它的全自動化，每天可處理大批量的樣本，不需要太多的人力操作。目前該ELISA法已被丹麥當(dāng)局批準(zhǔn)用于AD的診斷。

我國的學(xué)者在ELISA方法方面也進(jìn)行了大量的研究。吳威等[14]建立了PPA-ELISA方法檢測水貂血清中ADV抗體，證明該法快速準(zhǔn)確，且敏感性高于CIEP法。但由于需要在細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)病毒等操作相對復(fù)雜，未被推廣應(yīng)用。徐磊等[15]用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的VP2重組蛋白作為包被抗原建立了ELISA，檢測不同地區(qū)水貂血清，發(fā)現(xiàn)與CIEP的符合率達(dá)93%。王振軍[16]也建立了ADV VP2蛋白的ELISA方法，檢測血清樣品420份，發(fā)現(xiàn)與CIEP的符合率為89.9%。李晶等[17]建立了VP2蛋白Dot-ELISA的方法，發(fā)現(xiàn)敏感性要高于CIEP，并且適用于基層單位對于ADV的快速檢測。黃盼盼[18]將人工抗原SD蛋白和APTES共同包被建立了間接ELISA方法，發(fā)現(xiàn)與CIEP方法比較具有較高的符合率，為93.2%。賈赟[19]基于ADVVP2酵母表達(dá)重組蛋白建立了間接ELISA方法，檢測285份血清樣品，發(fā)現(xiàn)與CIEP的符合率為95.7%。韓鎧懌[20]針對VP2基因的抗原位點進(jìn)行大腸桿菌原核蛋白的表達(dá)，建立了間接ELISA方法，應(yīng)用該法對84份血清進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)檢出率為26.2%。陳小微[21]應(yīng)用大腸桿菌原核表達(dá)并純化出了ADV VP2332-452蛋白建立了ELISA方法，對2014年到2015年間自黑龍江和吉林采集的596份貂血清樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)陽性率為65.9%。楊柳枝[22]以ADV重組蛋白sd作為包被抗原研制出了sd-ELISA抗體檢測試劑盒，對我國山東、大連、吉林、黑龍江、河南等主要養(yǎng)貂區(qū)域的2 190份血清進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)陽性率高達(dá)78%。王元智[23]利用VP2重組蛋白作為抗原制備鼠源單克隆抗體作為包被抗體，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記多抗后作為檢測抗體，從而建立了檢測ADV的雙抗體夾心ELISA方法。ELISA為臨床上提供了一種更加敏感、快捷、特異、穩(wěn)定的ADV檢測方法，近年來該方法正在逐步取代CIEP方法。

2.5 免疫復(fù)合物法（CIC）

AD主要是由抗原抗體結(jié)合形成的免疫復(fù)合物引起的疾病，所以檢測免疫復(fù)合物的含量也是檢測 AD的一種方法。趙元楷等[24]建立了聚乙二醇沉淀比濁法，用于檢測水貂血清中免疫復(fù)合物，并應(yīng)用于實踐。陳德宇等[25]采用兔抗水貂抗體包被ELISA反應(yīng)板，建立了檢測AD病貂血清中特異性IgD及IgE型循環(huán)抗原-抗體免疫復(fù)合物水平的捕獲ELISA法。

2.6 間接免疫熒光試驗（IFA）

Porter等[26]首次利用IFA來檢測AD，人工感染9 d后從血清中檢出抗ADV抗體。該法特異性強(qiáng)，但需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，周期較長，且重復(fù)性差，所以不適合應(yīng)用于臨床診斷。

2.7 補(bǔ)體結(jié)合試驗（CF）

Mcguire等[27]首次應(yīng)用CF法檢測AD，在人工感染水貂3周后，可在被感染貂的血清中檢測出補(bǔ)體結(jié)合抗體。該方法敏感性較高，但操作繁瑣，一直未應(yīng)用于生產(chǎn)實踐。

2.8 膠體金免疫層析技術(shù)（GICA）

GICA是免疫層析技術(shù)、膠體金標(biāo)記技術(shù)及免疫反應(yīng)的結(jié)合體。該技術(shù)具有簡便快速、結(jié)果清晰，可通過肉眼觀察、靈敏度高、無污染和攜帶方便等優(yōu)點，在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用越來越多。徐磊[28]利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)ADV結(jié)構(gòu)蛋白VP2的部分基因片段建立了GICA方法，臨床應(yīng)用效果較好。

3 分子生物學(xué)檢測方法

3.1 PCR

PCR不僅可檢測外周血，還可對CIEP無法檢測的樣品進(jìn)行檢測，如木乃伊胎、死胎或其他組織標(biāo)本等。Jensen等[29]根據(jù)ADV NS1基因序列設(shè)計引物建立PCR，并比較了PCR和CIEP 方法檢測ADV的差異。在55個已知感染ADV和8個未感染ADV的農(nóng)場，共采集299份水貂脾臟和淋巴結(jié)及血清樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR敏感性為94.7%，特異性為97.9%，PCR與CIEP具有較高的一致性。邵西群等[10]用PCR方法檢測ADV，發(fā)現(xiàn)來自不同時期的血樣、不同組織的樣品的檢測結(jié)果不一致，體現(xiàn)了動物感染過程中病毒的不穩(wěn)定性。許秋等[30]根據(jù)ADV的NS1基因設(shè)計引物建立了PCR方法，發(fā)現(xiàn)最低能檢測到的病毒核酸量為2.53 ng/mL，臨床樣品檢測表明PCR檢出率為90%，CIEP檢出率為83%。楊瑞梅等[31]首次應(yīng)用納米PCR技術(shù)對ADV NS1基因進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)敏感性比CIEP大大提高，從而為用糞、尿等低病毒樣品ADV檢測提供了一種新的有效方法。

3.2 熒光定量PCR

熒光定量PCR為ADV的快速檢測及凈群根除提供了有效的技術(shù)手段。張瑞[32]建立了SYBR GreenⅠ實時定量PCR檢測方法，發(fā)現(xiàn)靈敏度可達(dá)7.8 拷貝/反應(yīng)，具有很好的特異性和重復(fù)性。張秀麗等[33]也建立了檢測ADV的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法，利用該法對8份疑似ADV病料進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)陽性率為75%。賈赟[19]成功建立了一種用于檢測ADV的TaqMan-MGB熒光定量PCR方法，應(yīng)用該法檢測了40份臨床樣品，發(fā)現(xiàn)陽性率為52.5%（21/40），較普通PCR的45%（18/40）提高了7.5%的檢出率。

3.3 PCR-DHPLC

變性高效液相色譜分析（DHPLC）是近年來建立并迅速發(fā)展的一種新型基因突變篩查技術(shù)。賈赟[19]根據(jù)ADV VP2基因序列設(shè)計引物，經(jīng)過對DHPLC各種反應(yīng)條件的優(yōu)化，成功建立了PCR-DHPLC方法，發(fā)現(xiàn)最低檢測限為10 拷貝/反應(yīng)。應(yīng)用該法檢測126份臨床樣品，檢出率為48.4%，和熒光定量PCR的檢測限相當(dāng)，比PCR電泳法高10倍。該方法為ADV的檢測提供了新型、簡便、高通量的檢測技術(shù)儲備。

3.4 核酸雜交技術(shù)

該方法最大優(yōu)點是適用于數(shù)量較多的群體篩選。Haas等[34]用該方法對水貂種群感染ADV后的脾、腎、骨髓和淋巴結(jié)等器官中提取的DNA樣品進(jìn)行檢測，只在脾和骨髓內(nèi)檢測到病毒DNA。

3.5 基因芯片技術(shù)

朱善元等[35]根據(jù)ADV序列，針對VP2蛋白設(shè)計引物，在探針反相雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合核酸分子堿基互補(bǔ)配對原則、基因芯片和酶聯(lián)顯色技術(shù)的基本原理制備成基因檢測芯片檢測 ADV。該方法比Dot-ELISA試劑盒高出17%，能克服PCR方法中DNA污染的缺點。基因芯片檢測方法的特點是可以在患病早期、準(zhǔn)確大批量的檢測ADV，這對于預(yù)防和控制疫情的蔓延十分重要。

3.6 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）

LAMP技術(shù)是一種恒溫擴(kuò)增技術(shù)，具有高效率、高特異性及快速反應(yīng)的特點。張卓[36]、田國寧等[37]根據(jù)ADV VP2基因設(shè)計引物建立了LAMP方法，發(fā)現(xiàn)檢測靈敏度是普通PCR方法的10倍。賈赟[19]也根據(jù)ADV VP2基因設(shè)計引物建立了LAMP方法，應(yīng)用該法對126份水貂樣品檢測時，發(fā)現(xiàn)LAMP、熒光定量PCR陽性檢出率為48.4%（61/126），高于普通PCR的44.4%（61/126）。LAMP簡便快速，既能滿足對ADV實驗室檢測，又適合于基層的快速篩查，為AD的臨床診斷與流行病學(xué)調(diào)查提供了新的技術(shù)手段。

4 小結(jié)

近年來，由于我國水貂養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大、養(yǎng)殖密度提高、養(yǎng)殖方式落后及對AD的防范力度不夠等原因，導(dǎo)致AD在我國水貂養(yǎng)殖地區(qū)廣泛流行且有擴(kuò)大的趨勢。水貂感染ADV后，體內(nèi)不產(chǎn)生或只產(chǎn)生少量的中和抗體，而產(chǎn)生的大多抗體，不僅不能中和病毒，反而會介導(dǎo)抗體依賴性增強(qiáng)作用，從而促進(jìn)ADV侵染靶細(xì)胞，最終導(dǎo)致宿主全身免疫功能紊亂及接種疫苗免疫失敗。由于ADV尚無有效的疫苗控制，所以對貂群進(jìn)行凈群、消除帶毒水貂就成了控制該病的有效方法，采用快速、高效、靈敏的檢測方法對控制疾病具有重要意義。近年來，研究者建立的不同檢測方法各有利弊，在應(yīng)用中要結(jié)合實際情況選擇適合的一種或多種檢測方法進(jìn)行疾病監(jiān)測、診斷，從而最終達(dá)到淘汰陽性水貂、逐步凈化種群、建立無疫病養(yǎng)殖場的目的。

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（責(zé)任編輯：杜憲）

Research Progress on the Detection Methods of Aleutian Disease of Mink

Zhuang Jinqiu，Mei Jianguo，Wang Yumao，Yao Chunyang，Mo Ling，Shen Zhiqiang
（Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy，Binzhou，Shandong 256600）

852.65

A

1005-944X（2017）10-0050-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.10.016

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系特種經(jīng)濟(jì)動物創(chuàng)新團(tuán)隊項目（SDAIT-21-15）