二溴海因復(fù)合消毒劑的研制與機(jī)理研究

易佳琳，李 健，胡培龍，李小林，陳 沁

（1. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；2. 上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135）

二溴海因復(fù)合消毒劑的研制與機(jī)理研究

易佳琳1，李 健2，胡培龍2，李小林2，陳 沁1

（1. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；2. 上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135）

目的研究二溴海因復(fù)合消毒劑（主要成分為二溴海因（DBDMH）和鄰苯二甲醛（OPA））的消毒性能及殺菌機(jī)理，開(kāi)發(fā)適合口岸使用的廣譜高效消毒劑。方法用懸液定量殺菌實(shí)驗(yàn)，評(píng)估二溴海因復(fù)合消毒劑的殺菌效果；利用傅里葉紅外光譜法和流式細(xì)胞法，研究消毒劑的殺菌機(jī)理。結(jié)果復(fù)合消毒劑對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌的作用濃度（殺滅對(duì)數(shù)值大于5）分別為：100 mg/L DBDMH + 50 mg/L OPA、60 mg/L DBDMH + 210 mg/L OPA、200 mg/L DBDMH + 50 mg/L OPA。復(fù)合消毒劑能引起大腸桿菌外部形態(tài)變化，導(dǎo)致生物大分子上的羰基、亞氨基、磷酸二酯鍵和糖苷鍵不同程度斷裂，使得ATP含量迅速下降，膜電位變化。結(jié)論復(fù)合消毒劑對(duì)細(xì)菌的殺滅效果較好。

二溴海因；大腸桿菌；消毒劑；ATP；金屬腐蝕性

Abstract：[Objective]To investigate the disinfection performance and mechanism of Dibromohydantin combination disinfectant（Dibromo-5，5-dimethylhydantoin，DBDMH，Ortho-phthalaldehyde，OPA），and to develop a broad spectrum and high efficiency disinfectant suitable for port use. [Methods] Suspension quantitative sterilization test was used to examine the germicidal efficacy of the combination Dibromohydantin disinfectant，and the bactericidal mechanism of E. coli was investigated after treating by the disinfectant through Fourier Transform Infrared Spectrometer and Flow cytometer. [Results] The average killing logarithm was above 5 when E. coli，p. aeruginosa，S. aureu were exposed in 100 mg/L DBDMH+50 mg/L OPA，60 mg/L DBDMH+210 mg/L OPA，200 mg/L DBDMH+50 mg/L OPA separately. The external morphological of E.coli changed，which caused the carbonyl group，the imino group，the phosphate two ester bond and the glycosidic bond of the biological macromolecule were broken in different degrees. The content of ATP decreased rapidly and the membrane potential changed. [Conclusions] Dibromohydantin combination disinfectant has better effect on bacteria.

Key words：1，3-dibromo-5，5-dimethylhydantoin；Escherichia coli；disinfectant；ATP；metal corrosion

二溴海因是一種鹵化衍生物，屬于鹵素類消毒劑，在溶解狀態(tài)下釋放活性Br-形成次溴酸。次溴酸可與含氮物質(zhì)反應(yīng)形成鹵胺類物質(zhì)干擾細(xì)菌代謝。次溴酸分解形成的新生態(tài)氧可以增加細(xì)胞膜的通透性[1-2]，從而對(duì)細(xì)菌、真菌、藻類起到廣譜殺菌作用。二溴海因氣味輕，刺激性小，是一種環(huán)境友好型消毒劑[3-4]，但在水中溶解度很小，只能以固體形式儲(chǔ)存和使用[5]。鄰苯二甲醛是一種重要的醫(yī)藥化工中間體，具有高效、低腐蝕、刺激性小及使用濃度低等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)破壞細(xì)菌胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞核起到殺菌的作用[6-7]。二者協(xié)同使用，可以增強(qiáng)二溴海因?qū)?xì)菌細(xì)胞內(nèi)官能團(tuán)的作用能力。

鑒于此，本研究以二溴海因?yàn)橹饕煞荩尤豚彵蕉兹┬纬蓮?fù)合消毒劑，選取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌為試驗(yàn)菌株，采用懸液定量殺菌和金屬腐蝕性試驗(yàn)，制備二溴海因復(fù)合消毒劑，同時(shí)研究該復(fù)合消毒劑的殺菌機(jī)理，為其應(yīng)用推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

二溴海因、鄰苯二甲醛，由上海晶純生化科技股份有限公司提供；大腸桿菌（ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、銅綠假單胞菌（ATCC 15442），由上海出入境檢驗(yàn)檢疫局提供；金屬片銅（GB2060）、鋁（GB1173）、不銹鋼（GB1220），購(gòu)自金壇市振興實(shí)驗(yàn)器材廠。

BacTiter-Glo微生物檢測(cè)試劑盒，美國(guó)Promega公司生產(chǎn)；快速TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)；DiBAC4（3），西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司生產(chǎn)；傅里葉紅外光譜儀 VERTEX70，德國(guó)Brckergongsi產(chǎn)品；LB、TSA培養(yǎng)基，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1菌懸液制備。取待培養(yǎng)菌劃線接種于TSA斜面，37 ℃培養(yǎng)18～24 h；用胰蛋白胨生理鹽水溶液（TPS）水洗后，轉(zhuǎn)移到無(wú)菌試管中，加入等體積的3%牛血清白蛋白（BSA），用電動(dòng)混勻器混合20 s，制成菌懸液。

1.2.2懸液定量殺菌試驗(yàn)。用無(wú)菌硬水配制消毒劑；無(wú)菌試管內(nèi)加入1.0 mL菌懸液和4.0 mL消毒液（對(duì)照組加等量無(wú)菌硬水），迅速混勻并立即計(jì)時(shí)；作用10 min后，分別吸取0.5 mL菌藥混合液，加入裝有4.5 mL中和劑的試管中混勻；10 min 后取1 mL樣液，用無(wú)菌水稀釋后接種至無(wú)菌培養(yǎng)皿；倒入TSA培養(yǎng)基并搖勻，待培養(yǎng)基凝固后置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值（KL）。

1.2.3溫度、作用時(shí)間、pH等對(duì)復(fù)合消毒劑作用效果的影響。作用環(huán)境溫度設(shè)為0、10、20、30、40 ℃，作用時(shí)間設(shè)為10、20、30、40、50、60、70 min。用NaOH或HCl將復(fù)合消毒劑溶液pH分別調(diào)節(jié)至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0；設(shè)置牛血清白蛋白（BSA）的濃度為25%、50%，分別進(jìn)行懸液定量殺菌試驗(yàn)。

1.2.4金屬腐蝕性試驗(yàn)。根據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行[8]。取不銹鋼、銅和鋁金屬片，經(jīng)打磨、洗凈、干燥后稱量，按每片200 mL用量，浸泡72 h（以蒸餾水中浸泡作為對(duì)照），取出金屬片，洗凈，去腐蝕物，干燥后稱重。每種金屬取3次試驗(yàn)平均值，計(jì)算金屬腐蝕率，判斷腐蝕級(jí)別。

1.2.5電鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。將復(fù)合消毒劑處理過(guò)的大腸桿菌及對(duì)照，在特制玻璃片上，用pH=6.8的戊二醛置于4 ℃冰箱中固定1.5 h；用pH=6.8的0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗3次，每次10 min；將材料放置于比例為100%的乙醇：叔丁醇=1:1的混合液和純叔丁醇中，各浸泡1次，每次15 min；用冷凍干燥儀對(duì)樣品進(jìn)行干燥處理4 h；將樣品觀察面朝上，用導(dǎo)電膠帶粘在掃描電鏡樣品臺(tái)上，用離子濺射鍍膜儀在樣品表面鍍一層金屬銀膜，電鏡下觀察菌落形態(tài)。

1.2.6傅里葉紅外光譜。采用傅里葉紅外光譜儀VERTEX70進(jìn)行掃描[9]；儀器預(yù)熱后，使用ZnSe液體池加樣，掃描紅外吸收光譜，掃描范圍800～2 800 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)34，保存圖譜分析生物大分子重要基團(tuán)。

1.2.7細(xì)菌ATP含量。采用BacTiter-Glomicrobial viabilityassay檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)ATP含量[10]；將復(fù)方消毒劑處理過(guò)的細(xì)菌菌液轉(zhuǎn)移到96孔板中，每孔添加500 μL的LB培養(yǎng)基，并加入等體積的BacTiter-Glo試劑，孵化5 min；取混合液至不透光96孔板中，每個(gè)樣品重復(fù)3次，用多功能酶標(biāo)儀讀取數(shù)值。

1.2.8細(xì)菌膜電位。將復(fù)合消毒劑處理過(guò)的細(xì)菌用DiBAC4（3）染料染色[11]；用MoFlo XDP流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為（520±10）nm，將水90 ℃孵化3 min作為陽(yáng)性對(duì)照；通過(guò)流式細(xì)胞儀的電子門(mén)，確定經(jīng)熱處理的菌液（陽(yáng)性對(duì)照）與水樣（陰性對(duì)照）的細(xì)菌染色數(shù)量；通過(guò)與陽(yáng)性樣品及陰性樣品檢測(cè)結(jié)果在圖中特定位置的比較，確定經(jīng)不同消毒劑處理后細(xì)菌膜電位的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 二溴海因復(fù)合消毒劑的研制

2.1.1消毒劑殺滅大腸桿菌濃度的篩選。取不同濃度二溴海因與鄰苯二甲醛進(jìn)行復(fù)配，測(cè)定不同配伍濃度下的殺滅大腸桿菌效果（表1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同配伍濃度的消毒劑對(duì)大腸桿菌均有一定的殺滅作用，但存在差異。200 mg/L的OPA、300 mg/L的DBDMH對(duì)大腸桿菌的殺滅對(duì)數(shù)值均大于5，20 mg/L DBDMH與90 mg/L OPA、54 mg/L DBDMH與63 mg/L OPA、100 mg/L DBDMH與50mg/L OPA復(fù)配使用，對(duì)大腸桿菌的殺滅對(duì)數(shù)值也均大于5?？梢?jiàn)2種消毒劑配伍后使用濃度均較低，說(shuō)明消毒劑復(fù)配使用更有效。選取其中殺滅大腸桿菌對(duì)數(shù)值最高的配伍濃度，即100 mg/L DBDMH與50 mg/L OPA作為后續(xù)試驗(yàn)的使用濃度，用不同配比的二溴海因和鄰苯二甲醛作用于銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)合消毒劑對(duì)金黃色葡萄球菌以及銅綠假單胞菌的殺滅效果也均優(yōu)于單方消毒劑（表2）。

表1 不同配比消毒劑對(duì)大腸桿菌的殺滅效果

表2 不同配比消毒劑對(duì)銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的殺滅效果

2.1.2溫度、pH等因素對(duì)復(fù)合消毒劑殺滅大腸桿菌效果的影響。分別在不同溫度、pH、時(shí)間和不同有機(jī)物濃度下，進(jìn)行復(fù)合消毒劑懸液定量殺菌試驗(yàn)。結(jié)果顯示：在0～40 ℃范圍時(shí)，隨著溫度的升高，復(fù)合消毒劑對(duì)大腸桿菌的殺滅效果不斷增強(qiáng)，40 ℃時(shí)的KL值約為0 ℃的1.5倍（圖1-A）；消毒劑處理50 min內(nèi)，隨著殺菌時(shí)間的增加，殺菌效果逐漸上升，50 min后殺菌效果保持相對(duì)穩(wěn)定（圖1-B）。復(fù)合消毒劑在不同pH下對(duì)大腸桿菌的殺滅效果略有不同，在堿性條件下的殺菌效果優(yōu)于酸性條件，當(dāng)pH為9.0時(shí)，復(fù)合消毒劑殺滅大腸桿菌的效果最佳（圖1-C）。參考2008版消毒規(guī)范[8]，用牛血清白蛋白（BSA）作為有機(jī)物進(jìn)行試驗(yàn)，分別加入25%和50%的BSA后，消毒劑的殺菌效果受到影響，殺滅對(duì)數(shù)值只有3.06和2.28（圖1-D）。

圖1 溫度、PH等因素對(duì)復(fù)合消毒劑殺滅大腸桿菌效果的影響

2.1.3復(fù)合消毒劑的金屬腐蝕性。分別用200 mg/L DBDMH + 100 mg/L OPA（2倍大腸桿菌篩選濃度）和400 mg/L DBDMH + 200 mg/L OPA（4倍大腸桿菌篩選濃度）浸泡銅、不銹鋼和鋁，計(jì)算金屬腐蝕速率。結(jié)果顯示：200 mg/L DBDMH與100 mg/L OPA對(duì)銅和鋁有輕度腐蝕，對(duì)不銹鋼基本無(wú)腐蝕；加大處理濃度后，腐蝕性增加，尤其是銅片最為明顯（表3）。故用復(fù)合消毒劑對(duì)銅制品消毒處理時(shí)，濃度不宜過(guò)高。

表3 復(fù)合消毒劑的金屬腐蝕速率

2.2 二溴海因復(fù)合消毒劑殺菌機(jī)理研究

2.2.1復(fù)合消毒劑對(duì)細(xì)菌形態(tài)的影響。采用電鏡掃描，觀察二溴海因復(fù)合消毒劑處理過(guò)的大腸桿菌。結(jié)果顯示：對(duì)照組中的大腸桿菌平均長(zhǎng)度為1.7 μm，寬度為0.6 μm；復(fù)合消毒劑處理組中的大腸桿菌平均長(zhǎng)度為1.2 μm，寬度為0.5 μm；同時(shí)，觀察到復(fù)合消毒劑引起了大腸桿菌皺縮變形并在表面出現(xiàn)凹陷（圖2）。

圖2 大腸桿菌掃描電鏡圖

2.2.2復(fù)合消毒劑對(duì)細(xì)菌生物大分子重要基團(tuán)的影響。用傅里葉紅外掃描檢測(cè)生物大分子中的化學(xué)鍵是否斷裂。掃描發(fā)現(xiàn)，消毒劑處理過(guò)的菌液掃描曲線均在對(duì)照組之上（圖3），說(shuō)明消毒劑對(duì)細(xì)菌內(nèi)各基團(tuán)有破壞作用。在圖3的基礎(chǔ)上分別計(jì)算生物大分子羰基、亞氨基、磷酸二酯鍵和糖苷鍵的紅外透射率差值，結(jié)果可見(jiàn)復(fù)合消毒劑處理過(guò)的大腸桿菌透射率差值均較單方消毒劑高（表4），說(shuō)明復(fù)合消毒劑對(duì)大腸桿菌內(nèi)各重要基團(tuán)的損傷更為嚴(yán)重，推測(cè)這可能是其殺菌效果優(yōu)于單方的原因之一。

圖3 消毒劑對(duì)大腸桿菌紅外吸收光譜的影響

表4 消毒劑處理大腸桿菌紅外透射率差值（單位：%）

2.2.3復(fù)合消毒劑對(duì)細(xì)菌ATP含量的影響。消毒劑處理后，大腸桿菌的ATP含量降低，其中復(fù)合消毒劑處理后的ATP含量下降速度最快，5 min時(shí)的下降率是DBDMH的1.75倍，15 min后大腸桿菌中的ATP幾乎無(wú)法測(cè)到，表明復(fù)合消毒劑對(duì)大腸桿菌中ATP含量的影響很大（圖4）。

圖4 消毒劑對(duì)大腸桿菌ATP含量的影響

2.2.4復(fù)合消毒劑對(duì)細(xì)菌膜電位的影響。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)消毒劑處理過(guò)的DiBAC4（3）熒光染料染色后的大腸桿菌膜電位。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，熱處理的細(xì)菌細(xì)胞膜電位喪失，細(xì)胞聚集于圖中的三角區(qū)域內(nèi)；消毒劑處理后的細(xì)胞也發(fā)生了不同程度的聚集，其中復(fù)合消毒劑處理后的細(xì)胞聚集程度最高，其次是DBDMH，OPA處理后細(xì)胞聚集比對(duì)照強(qiáng)一點(diǎn)（圖5-A）。在圖5-A基礎(chǔ)上，計(jì)算聚集細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：復(fù)合消毒劑處理后細(xì)胞聚集的數(shù)量約為對(duì)照組的2.5倍，說(shuō)明復(fù)合消毒劑對(duì)細(xì)胞膜電位的影響更為顯著（圖5-B）。

3 討論

二溴海因具有穩(wěn)定性好、含溴量高和反應(yīng)活性高等優(yōu)點(diǎn)，不僅能用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中各種疾病的預(yù)防和治療，也可用于游泳池消毒、水果保鮮和工業(yè)用循環(huán)水滅藻，以及日常生活用品消毒等[12]，但因溶解性差限制了其使用。鄰苯二甲醛是近年來(lái)研制的一種新型化學(xué)消毒劑，安全性相對(duì)較高，對(duì)人體刺激較小，殺菌能力強(qiáng)[13]，但價(jià)格較為昂貴?；诖?，將2種消毒劑復(fù)合使用，結(jié)果顯示約1/3劑量的DBDMH和1/4劑量的OPA復(fù)合使用可以達(dá)到高濃度的單方消毒劑對(duì)大腸桿菌同等的殺滅效果，50%劑量的DBDMH和OPA的復(fù)合消毒劑，對(duì)銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的殺滅效果也高于單方，推測(cè)該復(fù)合消毒劑可能存在協(xié)同殺菌作用。

圖5 消毒劑對(duì)大腸桿菌膜電位的影響（作用時(shí)間為10 min）

消毒劑的金屬腐蝕性是應(yīng)用時(shí)必須考慮的因素之一。本試驗(yàn)選取了2種高濃度的復(fù)合消毒劑分別對(duì)銅、不銹鋼、鋁進(jìn)行了腐蝕性測(cè)試，結(jié)果均顯示無(wú)強(qiáng)腐蝕性。這一結(jié)果相比當(dāng)前市場(chǎng)上通常采用的2g/L二溴海因單方消毒劑的腐蝕性有所改進(jìn)[14]。復(fù)合消毒劑腐蝕性較小的原因，主要是復(fù)配降低了腐蝕性較大的二溴海因的使用濃度。

殺菌機(jī)理是消毒劑性能研究的一個(gè)重要部分，對(duì)進(jìn)一步提高消毒劑的殺菌效率具有指導(dǎo)意義[15]。二溴海因可以被分解為次溴酸；次溴酸同時(shí)釋放出一定量的單質(zhì)溴，形成一個(gè)動(dòng)態(tài)的殺菌活性體系[16]。鄰苯二甲醛主要作用于核糖體，同時(shí)還與甘氨酸、賴氨酸和組氨酸起交聯(lián)反應(yīng)，造成細(xì)菌多肽鏈或蛋白質(zhì)變性，起到殺菌作用[17]。本研究采用傅里葉紅外掃描的方法分析了復(fù)合消毒劑對(duì)細(xì)菌內(nèi)結(jié)構(gòu)和生物大分子的影響。通常，細(xì)菌內(nèi)蛋白質(zhì)上的羰基和亞氨基的紅外吸收波長(zhǎng)在1 500～1 800 cm-1之間，核酸內(nèi)磷酸二酯鍵的紅外吸收波長(zhǎng)在1 085～1 090 cm-1之間[8，19]，細(xì)菌細(xì)胞膜上糖苷鍵的紅外吸收波長(zhǎng)在1 020～1 050 cm-1之間[21]。這些波長(zhǎng)下紅外透射率的變化可以反映細(xì)菌生物大分子上重要基團(tuán)含量的變化。本研究中復(fù)合消毒劑對(duì)大腸桿菌中主要基團(tuán)的影響均大于單方消毒劑，說(shuō)明復(fù)合消毒劑對(duì)細(xì)菌的破壞作用更強(qiáng)。

ATP含量是細(xì)胞代謝活性的一個(gè)重要指標(biāo)[20]。本試驗(yàn)中的ATP含量測(cè)定結(jié)果表明，復(fù)合消毒劑引起了細(xì)菌內(nèi)ATP含量迅速下降，細(xì)菌生物活性降低。DiBAC4（3）是一種檢測(cè)細(xì)胞膜電位的親脂性陰離子熒光染料。它本身無(wú)熒光，當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞與胞漿內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合后才發(fā)出熒光，若細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加，即膜電位增加，表示細(xì)胞去極化[21]。大腸桿菌經(jīng)復(fù)合消毒劑處理后去極化的細(xì)胞占比明顯增加，和熱處理的細(xì)胞相似，熒光聚集在特定區(qū)域，說(shuō)明消毒劑處理影響了細(xì)菌的膜電位，這一結(jié)果與電鏡下觀察到的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破損一致。

4 結(jié)論

有效殺滅大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的二溴海因復(fù)合消毒劑的濃度分別為“100 mg/L DBDMH+50 mg/L OPA”“60 mg/L DBDMH+210 mg/L OPA”“200 mg/L DBDMH+50 mg/L OPA”。隨著溫度和殺菌時(shí)間的增加，復(fù)合消毒劑對(duì)大腸桿菌的殺滅效果增強(qiáng)，pH為9時(shí)復(fù)合消毒劑殺滅大腸桿菌的效果最好。有機(jī)物的存在會(huì)影響消毒劑的殺菌效果。復(fù)合消毒劑會(huì)引起大腸桿菌外部形態(tài)變化，使其生物大分子的羰基、亞氨基、磷酸二酯鍵和糖苷鍵發(fā)生不同程度斷裂，同時(shí)導(dǎo)致其內(nèi)部的ATP含量迅速下降，并伴隨膜去極化。

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（責(zé)任編輯；朱迪國(guó)）

Development and Mechanism Study on Dibromohydantin Combination Disinfectant

Yi Jialin1，Li Jian2，Hu Peilong2，Li Xiaolin2，Chen Qin1
（1. School of Life Sciences，Shanghai University，Shanghai 200444 ；2. Shanghai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135）

S851.36

B

1005-944X（2017）10-0104-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.10.027

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2013BAD12B06）；國(guó)家重點(diǎn)研究發(fā)展項(xiàng)目（2016YFD0501101）

陳 沁