小反芻獸疫流行狀態(tài)及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

向 蓉，黃 勉，向 華，王曉虎

（1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640；2.廣州動(dòng)物園，廣東廣州 510070）

小反芻獸疫流行狀態(tài)及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

向 蓉1，黃 勉2，向 華1，王曉虎1

（1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640；2.廣州動(dòng)物園，廣東廣州 510070）

小反芻獸疫（PPR）是由小反芻獸疫病毒（PPRV）引起小反芻動(dòng)物的一種急性接觸性傳染病。近年來(lái)，我國(guó)西藏、遼寧等地陸續(xù)暴發(fā)該病，給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)羊業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。本文介紹了PPR的流行現(xiàn)狀、傳播途徑、易感動(dòng)物，闡述了PPRV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，包括常規(guī)診斷、核酸檢測(cè)方法（cDNA探針雜交、RT-PCR方法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)）、血清學(xué)診斷（競(jìng)爭(zhēng) ELISA、間接ELISA、夾心ELISA 方法）等，以期對(duì)該病的防控提供借鑒。

小反芻獸疫；流行現(xiàn)狀；檢測(cè)方法

Abstract：Peste des petits ruminants（PPR）is an acute contagious infectious disease，caused by Des Petits Ruminants Virus（PPRV）. In recent years，PPR outbreaks occured in Tibet，Liaoning and other provinces of China and caused severe economic losses. The epidemic status，route of transmission and susceptible animals of PPR were introduced in this paper. The laboratory detection methods，including routine diagnosis，nucleic acid detection method（cDNA probe hybridization，RT-PCR，RT-qPCR，RT-LAMP）and serological diagnosis method（cELISA，iELISA and sELISA）were analyzed，in order to provide reference for the disease prevention and control .

Key words：Peste des petits ruminants（PPR）；epidemic status；detection methods

小反芻獸疫（PPR）是由副粘病毒科、麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒（PPRV）感染引起的一種烈性、接觸性傳染病，以山羊和綿羊最為易感。臨床上以高熱、壞死性胃炎、胃腸炎和肺炎為主要特征，發(fā)病率和病死率分別高達(dá)100%和90%，對(duì)反芻動(dòng)物危害極大[1-2]。近年來(lái)，PPR的發(fā)生呈上升趨勢(shì)，在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)不斷蔓延。2007年，我國(guó)西藏地區(qū)首次發(fā)生PPR疫情之后，許多地方陸續(xù)有發(fā)現(xiàn)該病的報(bào)道。了解該病的國(guó)內(nèi)外流行狀態(tài)，掌握PPRV快速檢測(cè)技術(shù)，對(duì)該病的防治工作意義重大。

1 PPR的流行狀態(tài)

1.1疫情史

1942年P(guān)PR首次發(fā)現(xiàn)于西非的科特迪瓦[3]，距今已有73年的歷史。1983年該病首次出現(xiàn)于阿拉伯半島，1987年又傳入印度。2007年7月，我國(guó)西藏地區(qū)的革吉縣、日土縣、札達(dá)縣相繼發(fā)生了牛PPR疫情。這是我國(guó)首次報(bào)道發(fā)生PPR疫情。其后該病陸續(xù)出現(xiàn)在我國(guó)遼寧、黑龍江、江蘇、四川等地[4]。至今，我國(guó)新疆和西藏地區(qū)至少暴發(fā)5起PPR疫情。

1.2空間分布

2014年，我國(guó)陸續(xù)有7個(gè)省市出現(xiàn)PPR疫情，總體趨勢(shì)是自西部地區(qū)向東部地區(qū)流行[5]。近年來(lái)，PPR逐漸跨越地理屏障，擴(kuò)散趨勢(shì)不斷持續(xù)。我國(guó)周邊國(guó)家，如印度、阿富汗、尼泊爾、塔吉克斯坦等地也都有PPR流行的報(bào)道[6]。目前，該病已經(jīng)擴(kuò)散到亞洲、非洲地區(qū)的40余個(gè)國(guó)家。撒哈拉以南的非洲地區(qū)、阿拉伯半島、中東和南亞都是該病的主要流行地區(qū)，而且流行形勢(shì)日趨愈嚴(yán)峻[7]。

1.3種間分布

PPRV主要感染綿羊和山羊，但山羊比綿羊更為易感，且癥狀也更加嚴(yán)重。不同品種、不同年齡的羊?qū)PRV的敏感性有顯著差別。例如，歐洲品系的羊易感性較高，幼齡羊比成年羊更為易感，但在哺乳期的幼仔具有較強(qiáng)的抵抗力。有報(bào)道稱，豬也可能感染PPRV，但表現(xiàn)為隱性感染，并不表現(xiàn)臨床癥狀，也不會(huì)成為傳染源而向外界排毒[3，8]。牛也有發(fā)生該病的可能。目前，尚無(wú)人感染PPRV的報(bào)道[9-10]。該病的野生動(dòng)物流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，野生小反芻動(dòng)物也對(duì)PPRV敏感。我國(guó)西藏地區(qū)曾發(fā)生2起野生小反芻動(dòng)物感染PPR而死亡的疫情。此外，野生動(dòng)物的活動(dòng)可能會(huì)加大PPRV的擴(kuò)散速度和范圍。有關(guān)野生小反芻動(dòng)物和PPR感染的關(guān)系仍需進(jìn)一步深入的研究[11-12]。

1.4傳播途徑

PPRV具有高度接觸性，主要通過(guò)呼吸系統(tǒng)傳播。精液和胚胎也是造成動(dòng)物感染的途徑之一[13]。此外，近距離的動(dòng)物間也可以通過(guò)氣溶膠形式傳播。健康動(dòng)物與被病羊污染的飲水、飼料、工具、水槽、圈舍接觸，也有可能被間接感染。但由于PPRV對(duì)外界的抵抗力很弱，病毒在外界存活時(shí)間較短，因此間接傳播不是主要的感染方式。有研究報(bào)道，處于潛伏期和恢復(fù)期的山羊也具有傳染性[14]。

2 PPRV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是PPR診斷和有效防控的依據(jù)。近年來(lái)，PPRV診斷技術(shù)得到很大發(fā)展，各種血清學(xué)及核酸診斷技術(shù)對(duì)于PPRV的防控效果顯著。

2.1常規(guī)診斷

PPR的常規(guī)診斷技術(shù)主要有病毒分離鑒定、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）和膠體金試紙條等。

PPRV 可在非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero 細(xì)胞）、胎綿羊腎細(xì)胞、胎羊及新生羊睪丸細(xì)胞上增殖產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE）并形成合胞體。AGID是一種簡(jiǎn)單廉價(jià)的檢測(cè)方法，但其敏感性相對(duì)較低，因此基本不會(huì)用于標(biāo)準(zhǔn)診斷[15]。何紅菊[16]利用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，利用PPRV小鼠單抗和山羊多抗制備出檢測(cè)PPRV抗原的膠體金層析試紙條，之后又對(duì)試紙條制備程序進(jìn)行了優(yōu)化，成功建立了一種特異、快速檢測(cè)PPRV抗原膠體金免疫層析試紙條。

2.2核酸檢測(cè)方法

2.2.1cDNA探針雜交。隨著對(duì)PPRV 基因組序列的掌握，利用cDNA探針來(lái)對(duì)核酸進(jìn)行標(biāo)記的核酸雜交方法得到建立。cDNA 探針用32P或地高辛等標(biāo)記，以檢測(cè)可與其互補(bǔ)形成雙鏈復(fù)合體的PPRV 基因序列。Diallo等[17]于1995年就將探針雜交廣泛應(yīng)用到PPRV抗原的檢測(cè)。

2.2.2RT-PCR方法。Hymann等建立了檢測(cè)PPRV的兩步法RT-PCR。Balamurugan等[18]又于2006年改進(jìn)建立了一步法RT-PCR，其操作過(guò)程簡(jiǎn)單且不易污染。姚李四等[19]針對(duì)PPRV先用普通RT-PCR進(jìn)行篩選，再用巢式RT-PCR進(jìn)行排除和鑒定，可以提高特異性。2010年，毛立等[20]建立了一種可特異擴(kuò)增PPRV N蛋白異變基因，而不能擴(kuò)增RPV和CDV N基因的檢測(cè)方法。張玲等[21]針對(duì)H基因或全基因序列，建立的區(qū)分PPR疫苗毒與基因Ⅳ系野毒的RT-PCR 檢測(cè)方法，能特異性區(qū)分疫苗株Nigeria 75/1與基因Ⅳ系PPRV，與基因Ⅲ系、牛瘟病毒、犬瘟熱病毒等同屬病毒無(wú)交叉反應(yīng)；最低檢測(cè)濃度為7.7×10-5ng/μL RNA模板。該方法操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，可初步用于臨床鑒別診斷。

2.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)憑借其特異性更強(qiáng)、有效解決PCR 污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等諸多優(yōu)點(diǎn)開(kāi)始應(yīng)用于PPRV 的檢測(cè)，并取得了不錯(cuò)的成果。吳紹強(qiáng)等[22]以N基因序列為靶基因，通過(guò)設(shè)計(jì)引物及TaqMan探針建立了快速檢測(cè)PPRV的熒光PCR方法可區(qū)分PPRV及RPV感染。所建立的方法檢測(cè)線性范圍為1～1×106拷貝質(zhì)粒DNA，靈敏度可達(dá)10拷貝質(zhì)粒DNA，是常規(guī)PCR法的100倍。袁向芬等[23]對(duì)GenBank已公布的PPRV N基因序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)特異性引物與探針，建立了PPRV通用型與Ⅱ系疫苗毒特異型二重實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 方法，同時(shí)建立了針對(duì)PPRV Ⅳ系強(qiáng)毒株的特異型熒光PCR方法。

2.2.4反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP）。李偉等[24]針對(duì)PPRV-N 基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物，采用一步法RT-LAMP建立了一種檢測(cè)PPRV的方法。該方法從核酸抽提到檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)僅需70 min，具有良好的特異性，與同屬的犬瘟熱病毒無(wú)交叉反應(yīng)，靈敏度是RT-PCR的1 000 倍，是巢式RT-PCR的100倍。李林等[25]建立的PPRV LAMP檢測(cè)體系亦具有較高的特異性和檢測(cè)靈敏度，比普通RT-PCR靈敏性高10倍，與熒光定量RT-PCR的靈敏度相當(dāng)。

2.3血清學(xué)診斷。常規(guī)血清學(xué)試驗(yàn)包括病毒中和試驗(yàn)（VNT）、對(duì)流免疫電泳試驗(yàn)（CIEP）、間接熒光抗體試驗(yàn)（IFAT）和 ELISA 等。其中，ELISA方法相比上述幾種方法更方便、快捷，適用于大量樣品的檢測(cè)診斷[13，18]。

2.3.1競(jìng)爭(zhēng) ELISA（c-ELISA）。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的用于檢測(cè)PPRV抗體的方法是一種用抗PPRV H蛋白的單克隆抗體作為特異性競(jìng)爭(zhēng)單抗建立的c-ELISA。Kang-Seuk等利用重組N 蛋白及其單抗建立了一種快速cELISA（rapid-cELISA）。該方法通過(guò)對(duì)單抗進(jìn)行定量來(lái)檢測(cè)和監(jiān)控PPR，敏感性和特異性分別達(dá)93.4%和98.5%，且可鑒別PPRV和RPV。邱文英等[26]以1D5作為競(jìng)爭(zhēng)抗體、純化后的rpET-PPRN 蛋白作為包被抗原，建立了檢測(cè)PPR血清抗體的單抗c-ELISA方法。該方法能夠特異性區(qū)分牛瘟陽(yáng)性血清和PPR陽(yáng)性血清。應(yīng)用該檢測(cè)方法檢測(cè)129 份山羊（Capra hircus）血清樣品，與標(biāo)準(zhǔn)c-ELISA試劑盒的符合率為96.9%。

2.3.2間接ELISA（i-ELISA）。李偉等[27]建立了基于Bac-to-Bac桿狀病毒-昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的PPRV N蛋白的i-ELISA方法。利用該方法檢測(cè)來(lái)自西藏疫區(qū)的37份山羊血清和青海省非疫區(qū)92份山羊血清，與法國(guó)蒙彼利埃農(nóng)學(xué)發(fā)展研究國(guó)際合作中心（CIRADEMVT）提供的競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒相比，特異性為96.2%，敏感性為100%，二者的符合率達(dá)到96.9%，表明建立的i-ELISA方法可以很好地用于PPR的臨床診斷。曾少靈等[28]預(yù)測(cè)N蛋白的B細(xì)胞抗原表位，設(shè)計(jì)4段多肽并人工合成，作為包被抗原建立的PPR血清抗體間接ELISA檢測(cè)方法，用于檢測(cè)PPR的山羊臨床血清樣品，以對(duì)預(yù)測(cè)的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，建立的間接ELISA敏感性為96.0%，特異性為96.25%，與進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒的符合率為96.15%。

2.3.3夾心ELISA 方法（sELISA）。Singh等針對(duì)PPRV N 蛋白抗原表位單抗4G6建立了夾心ELISA方法。首先使用多抗血清捕獲抗原，然后用單抗進(jìn)行特異性檢測(cè)，其特異性可達(dá)92.8%，敏感性可達(dá)88.9%，能夠有效避免前帶效應(yīng)，適用于野外樣品的檢測(cè)。

3 小結(jié)

長(zhǎng)期以來(lái)，很多國(guó)家和地區(qū)忽略了對(duì)PPR的深入研究。其在世界各地的暴發(fā)和流行，以及近期PPR疫情在我國(guó)部分省份的發(fā)生和流行，提示必須加強(qiáng)對(duì)PPRV 的研究，尤其要加強(qiáng)PPRV分子生物學(xué)方面的研究，盡快建立可快速有效鑒別PPRV、RPV、疫苗毒株與強(qiáng)毒株的快速診斷方法以及安全有效的藥物、疫苗，以達(dá)到防控并最終消滅、凈化PPR。

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（責(zé)任編輯：杜憲）

Research Progress in Epidemiology and Diagnostic Technologies of Peste Des Petits Ruminants

Xiang Rong1，Huang Mian2，Xiang Hua1，Wang Xiaohu1
（1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Livestock Disease Prevention，Institute of Animal Health，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou，Guangdong 510640；2. Guangzhou Zoo，Guangzhou，Guangdong 510070）

S858.26

A

1005-944X（2017）10-0046-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.10.015

廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015A020224018，2015A010107009），廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院“十三五”學(xué)科團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目

王曉虎