牛腸道病毒的病原學(xué)特征及檢測技術(shù)研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國，劉吉山，張 穎，楊麗梅，沈志強(qiáng)

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

牛腸道病毒的病原學(xué)特征及檢測技術(shù)研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國，劉吉山，張 穎，楊麗梅，沈志強(qiáng)

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

牛腸道病毒（BEV）感染是我國近年來的新發(fā)傳染病，在牛群中普遍存在，且常與其他病原體發(fā)生混合感染和繼發(fā)感染。本文介紹了牛腸道病毒的發(fā)現(xiàn)、形態(tài)及分類、流行病學(xué)特點等，闡述了該病毒檢測技術(shù)的研究進(jìn)展，如病毒的分離培養(yǎng)技術(shù)、血清學(xué)檢測技術(shù)、分子生物學(xué)檢測技術(shù)（RT-PCR技術(shù)和實時熒光定量RTPCR技術(shù)）等，以期為預(yù)防和控制該病提供參考。

牛腸道病毒；病原學(xué)；檢測；研究進(jìn)展

Abstract：Bovine Enteroviruses（BEV）is a new infectious disease in China，prevalent in cattle and usually mixed with other pathogens and secondary infection. The discovery，morphology，classification and epidemiological characteristics of BEV were introduced in this paper. The research progress of detection technology，such as virus isolation and culture，serological and molecular biology detection technique（RT-PCR technology and real-time fluorescence quantitative RT-PCR technology）were described，so as to provide reference for the prevention and control of the disease.

Key words：Bovine enterovirus；etiology；detection；research progress

牛腸道病毒（Bovine enterovirus，BEV）為小RNA病毒科、腸道病毒屬，BEV感染臨床上以發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、腹瀉和繁殖障礙為主要特征。BEV感染在我國為新發(fā)傳染病，在牛群中非常普遍，且常與其他病原體發(fā)生混合感染或繼發(fā)感染，導(dǎo)致牛群出現(xiàn)較高的死亡率，對養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，采取有效措施預(yù)防和控制BEV感染，對于確保養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展非常重要。本文概述了BEV的病原學(xué)特征及檢測技術(shù)研究進(jìn)展，以期為預(yù)防和控制該病病提供參考。

1 病毒的由來和發(fā)現(xiàn)

BEV于1959年首次由Moll等[1]報道，之后也有在許多國家暴發(fā)與流行的報道。李英利等[2]從內(nèi)蒙古發(fā)生腹瀉的犢牛體內(nèi)分離出1株BEV，分析發(fā)現(xiàn)該毒株為F種BEV，進(jìn)而首次確認(rèn)我國存在F種BEV感染。彭曉薇等[3]從北京市發(fā)生嚴(yán)重腹瀉的泌乳奶牛中，分離獲得F型BEV。侯佩莉等[4]經(jīng)過一系列病毒鑒定，最終從泌乳奶牛的糞便中分離出1株F型BEV。邢澤黎等[5]從發(fā)病致死的肉牛體內(nèi)分離得到E型BEV；張海麗等[6]從山西省發(fā)生嚴(yán)重腹瀉的泌乳奶牛中，分離獲得E型BEV。BEV多從發(fā)生嚴(yán)重呼吸道癥狀、消化道癥狀和繁殖系統(tǒng)障礙的病牛體內(nèi)分離。BEV在世界各國的牛群常見，感染率為17.6%～80%[7]。牛群感染后可引起下痢和呼吸道癥狀、食欲下降，嚴(yán)重的還會出現(xiàn)便血、產(chǎn)奶量大幅下降等癥狀。

2 病毒的形態(tài)及分類

BEV的病毒粒子外觀呈球形、正二十面體，無包膜，大小為25～30 nm；病毒的基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，全長7.5 kb。根據(jù)最新病毒分類，BEV與人脊髓灰質(zhì)炎病毒、人柯薩奇病毒和豬腸道病毒等同屬小RNA病毒科、腸道病毒屬的成員。該屬病毒包括A、B、C、D、E、F、G、H、J等9個腸道病毒種及A、B、C等3個鼻病毒種，其中腸道病毒E和F種屬于BEV。E種包括E1～E4，F(xiàn) 種包括 F1～F6。

3 病毒的流行病學(xué)特點

BEV感染符合腸道病毒屬病毒感染的普遍規(guī)律：一種綜合征可由不同腸道病毒所引起，同一種（型）腸道病毒可以導(dǎo)致不同綜合征；單純感染腸道病毒后，多數(shù)為表現(xiàn)亞臨床癥狀（有超過90%的感染牛無癥狀），不易被發(fā)現(xiàn)；普遍分布于世界各地，感染廣泛存在，并且常引起暴發(fā)；在環(huán)境中非常穩(wěn)定，在不同的pH、溫度、鹽度等條件下能穩(wěn)定存在。BEV的病原性并不明顯，但由于其有時會侵犯其他器官，會導(dǎo)致臨床上各種疾病綜合征的出現(xiàn)。BEV的感染宿主較廣，包括牛、羊、馬、犬、羊駝等動物。

4 病毒檢測技術(shù)研究進(jìn)展

4.1 病毒分離培養(yǎng)技術(shù)

病毒分離與鑒定是檢測BEV感染的金標(biāo)準(zhǔn)。實驗室常采用MDBK細(xì)胞進(jìn)行病毒分離試驗。處理采集樣品后，接種MDBK細(xì)胞培養(yǎng)，觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE），并對其核酸進(jìn)行測序比對，確定是否存在BEV感染。病毒分離與鑒定是最可靠的檢測方法，但費時長，操作繁瑣，對技術(shù)人員要求高。

4.2 血清學(xué)檢測技術(shù)

Zhang等[8]建立了捕獲 ELISA方法來檢測血清中的BEV抗體。該方法具有敏感性強(qiáng)、特異性高的特點，更重要的是比血清中和試驗（SN）更經(jīng)濟(jì)。Zhang等[9]還建立了阻斷ELISA方法來檢測牛血清中的BEV抗體。該ELISA方法與傳統(tǒng)SN法相比敏感高性，而且耗時短，可替代傳統(tǒng)SN法用于大規(guī)模牧場的抗體檢測。郭金玉等[10]利用北京市某牛場BEV-2型分離毒株的VP1蛋白，構(gòu)建了檢測BEV抗體的間接ELISA方法。該方法操作比較簡單、快速、使用價值比較高。朱彤等[11]通過擴(kuò)增BEV的VP2基因，對其進(jìn)行了一系列的轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá)，純化出重組蛋白，制備了較高效價的多克隆抗體，為BEV的血清學(xué)診斷方法的建立及亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。周萍萍[12]將純化好的3D蛋白作為包被抗原，建立了BEV-3DELISA方法，應(yīng)用該方法對哈爾濱市送檢的425份奶牛血清進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)陽性率高達(dá)41.41%。蓋小春[13]應(yīng)用表達(dá)純化的E種BEVHY12 VP2重組蛋白作為包被抗原，建立了檢測E種BEV抗體的間接ELISA方法，對實驗感染小鼠抗體消長規(guī)律進(jìn)行了研究，為該病的免疫機(jī)理和疫苗研制打下基礎(chǔ)。邢澤黎等[14]應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)純化的E種BEV HY12的VP1和VP2重組蛋白制備了抗體，并建立了檢測BEV病原的雙抗體夾心ELISA方法，并對吉林省感染BE飛V牛群進(jìn)行了病原流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)牛群的BEV感染率在8.16%～58.7%之間。雙抗體夾心ELISA檢測糞便中的BEV抗原的方法，可以快速、有效地確定牛群是否存在BEV感染，可為新發(fā)BEV感染的防控、牛群的凈化提供有效的技術(shù)手段。

4.3 分子生物學(xué)檢測技術(shù)

4.3.1RT-PCR技術(shù)。Jimenez-Clavero等[15]針對BEV 5′UTR基因建立了RT-PCR方法，并對西班牙的多個地區(qū)的牛、綿羊、山羊、驢、馬以及地表水樣進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了在驢的檢測樣本中未檢測到BEV外，其余均有陽性樣本存在。Nathamon等[16]也根據(jù)5′UTR基因設(shè)計引物，建立了RT-PCR方法，并對泰國部分地區(qū)的本地牛、印度牛及山羊攜帶BEV的感染率進(jìn)行了調(diào)查和分析，發(fā)現(xiàn)以上幾種動物均有BEV的攜帶，其中本地牛的攜帶率最高（76%）。吳丹等[17]根據(jù)口蹄疫病毒（FMDV）和BEV基因的5′UTR保守基因區(qū)域分別設(shè)計引物，首次建立了同時檢測FMDV和BEV的雙重RT-PCR快檢方法，對FMDV的最低檢出限為8 TCID50/0.1 mL，對BEV的最低檢出限為2 TCID50/0.1 mL。采用該方法檢測852份臨床樣品，并與病毒分離方法比較，2種方法檢測結(jié)果完全一致。侯佩莉等[18]針對BEV非結(jié)構(gòu)蛋白3D基因設(shè)計引物，建立了RT-PCR方法，其敏感度高達(dá)10-1TCID50。侯佩莉等[19]根椐牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛冠狀病毒（BCoV）和BEV基因的保守序列，設(shè)計合成引物，在建立單一病毒RT-PCR檢測方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化條件，建立了上述3種病毒的多重RT-PCR方法，對24份臨床腹瀉病料進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與單項RT-PCR的符合率為100%。該多重RT-PCR鑒別診斷方法對牛腹瀉性疾病病因確診、流行病學(xué)調(diào)查和防控具有重要意義。

4.3.2實時熒光定量RT-PCR技術(shù)。吳丹等[20]根據(jù)5′UTR基因設(shè)計引物建立了檢測BEV的TaqMan熒光定量RT-PCR方法，發(fā)現(xiàn)對BEV的最小檢測量為0.1 TCID50/0.1 mL，對采集自北京周邊地區(qū)牛群的852份臨床樣本進(jìn)行了檢測，且與分離病毒法進(jìn)行了敏感性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法檢出陽性樣本與病毒分離法檢出的一致，但敏感性比病毒分離法高10倍。朱彤等[21]根據(jù)BEV 3D基因設(shè)計引物建立了檢測BEV的SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法，發(fā)現(xiàn)其敏感度達(dá)7.13×101拷貝/μL，是常規(guī)RT-PCR檢測值的10倍。應(yīng)用該方法檢測了3個規(guī)模化奶牛場送檢的41份奶牛腹瀉樣本和3份氣溶膠樣本，發(fā)現(xiàn)腹瀉樣品陽性檢出率為39.02%（16/41），3份氣溶膠樣本均為陽性。本研究建立的SYBR Green I實時熒光定量RT-PCR檢測方法具有特異、穩(wěn)定、高效的優(yōu)點，既可以用于臨床檢測，又可對環(huán)境中的BEV進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，為BEV流行病學(xué)調(diào)查、診斷提供了有力的技術(shù)支持。

5 小結(jié)

BEV感染在世界范圍內(nèi)流行。由于其所引起的臨床癥狀與其他病原體（BVDV、BCoV等）所引起的疾病癥狀非常相似，僅從臨床上進(jìn)行診斷很容易造成誤診，致使病情加重，甚至威脅到生命安全。及早確診所感染的病毒及類型，對于及時撲滅疫情，控制疫病的傳播具有重要作用。目前，我國對牛腸道疾病的研究主要集中在診斷方面，而在防治方面還很薄弱，尚無特效治療藥物及疫苗預(yù)防，因此建立完善該病的診斷技術(shù)及研發(fā)疫苗對我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)將具有重大意義。

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（責(zé)任編輯：杜憲）

Research Progress on the Pathogenic Characteristics and Detection Techniques of Bovine Enterovirus

Zhuang Jinqiu，Mei Jianguo，Liu Jishan，Zhang Ying，Yang Limei，Shen Zhiqiang
（Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy，Binzhou，Shandong 256600）

S852.65

A

1005-944X（2017）10-0043-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.10.014

山東省重點研發(fā)計劃項目（2015GSF121027）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系牛產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊項目（SDAIT-09-12）