空腸彎曲桿菌特異性基因研究綜述

王艷波，郭光禮，張?jiān)葡?，王曉穎，莊桂玉，龔振華

（1. 臨朐縣畜牧局，山東臨朐 262600；2.臨朐縣職業(yè)教育中心學(xué)校，山東臨朐 262600；3.青島市黃島區(qū)畜牧局，山東青島 266000；4. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

空腸彎曲桿菌特異性基因研究綜述

王艷波1，郭光禮1，張?jiān)葡?，王曉穎1，莊桂玉3，龔振華4

（1. 臨朐縣畜牧局，山東臨朐 262600；2.臨朐縣職業(yè)教育中心學(xué)校，山東臨朐 262600；3.青島市黃島區(qū)畜牧局，山東青島 266000；4. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

空腸彎曲桿菌是人獸共患病原菌，對(duì)公共衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)，特別是養(yǎng)雞產(chǎn)業(yè)造成一定危害。本文從基因研究的角度出發(fā)，對(duì)空腸彎曲桿菌的病原生長(zhǎng)與流行病學(xué)特征、致病機(jī)理、致病基因、檢測(cè)技術(shù)、耐藥性、防治等方面的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，以期對(duì)我國(guó)空腸彎曲菌腸炎的防治工作提供借鑒。

空腸彎曲桿菌；特異性基因；耐藥性

空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）是彎曲桿菌屬的一種，屬革蘭氏陰性菌，呈弧形、螺旋形、海鷗展翅形或S型。空腸彎曲桿菌是人獸共患病原菌，廣泛分布于自然界，可通過(guò)動(dòng)物、水、禽肉制品及蛋、牛奶等傳播。空腸彎曲桿菌可引起人體急性腸炎、發(fā)燒及Guillain-Barri綜合征，也可引起感染動(dòng)物腹瀉和肝炎等。作為一種食物源性的腸道致病菌，其引起的疾病在世界各國(guó)廣泛存在[1]?？漳c彎曲桿菌主要通過(guò)飲水、飲食等方式傳染給動(dòng)物和人類，其感染病例數(shù)甚至超過(guò)了沙門(mén)氏菌和志賀氏菌[2]。本文從病原生長(zhǎng)與流行病學(xué)特征、致病機(jī)理、致病基因、檢測(cè)技術(shù)、耐藥性、防治等方面，對(duì)空腸彎曲桿菌研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述。

1 病原生長(zhǎng)與流行病學(xué)特征

空腸彎曲桿菌是微需氧菌，在大氣或厭氧的環(huán)境下不能生長(zhǎng)，在5%氧氣、10%二氧化碳、85%氮?dú)獾沫h(huán)境中生長(zhǎng)最為適宜?？漳c彎曲桿菌不能使用糖類作為能量源，但是可以利用富馬酸鹽、硝酸鹽、亞硫酸鹽等化合物作為能量源。在潮濕、少量氧的情況下，空腸彎曲桿菌于4℃可以存活數(shù)周，于-20℃可以存活2~5個(gè)月，但在室溫下僅能存活幾天?？漳c彎曲桿菌對(duì)酸堿度具有較高的耐受力，能夠輕易通過(guò)胃腸道并生存，但對(duì)物理和化學(xué)消毒劑均敏感。

空腸彎曲桿菌屬腸道寄生菌，大量存在于野生動(dòng)物或家養(yǎng)動(dòng)物的腸道內(nèi)。當(dāng)飼養(yǎng)管理不良，尤其是在轉(zhuǎn)群、注射疫苗、氣候突變等應(yīng)激因素刺激時(shí)，該菌可在動(dòng)物體內(nèi)大量繁殖，從而引起發(fā)病?？漳c彎曲桿菌在動(dòng)物體內(nèi)具有較高的分離率。雞是空腸彎曲桿菌的主要宿主，也是空腸彎曲桿菌病的重要傳染源，不良的飼養(yǎng)管理，可致使本菌大量繁殖。此外，消費(fèi)衛(wèi)生狀況與空腸彎曲桿菌的流行緊密相關(guān)。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和集約化程度的不斷提高，抗生素使用越來(lái)越廣泛，空腸彎曲桿菌對(duì)人的感染引起了全世界的關(guān)注。

空腸彎曲桿菌對(duì)人的感染率不亞于沙門(mén)氏桿菌和志賀氏桿菌，引發(fā)的食品安全和食源性疾病問(wèn)題日益突出。食入被污染的食物和水以及與動(dòng)物的直接接觸，都是空腸彎曲桿菌的主要傳播途徑。空腸彎曲桿菌通過(guò)動(dòng)物帶菌者或者患者的糞便進(jìn)入水環(huán)境中后，可以進(jìn)入一種被稱為“活的非可培養(yǎng)”（VBNC）狀態(tài)的休眠期。處于VBNC狀態(tài)的細(xì)菌在特定條件下可以復(fù)蘇并具有致病性。龔筱麗[3]研究發(fā)現(xiàn)糞便及臟器中的空腸彎曲桿菌會(huì)在短時(shí)間內(nèi)崩解，因此從臟器中分離本菌首選肝臟及膽汁。

2 致病基因

以前人們對(duì)空腸彎曲桿菌的發(fā)病機(jī)制還不完全明確。研究發(fā)現(xiàn)，空腸彎曲桿菌可引起牛和綿羊流產(chǎn)，引起家禽患肝炎，剖檢變化主要以肝臟出血和壞死為特征。當(dāng)飼養(yǎng)管理不良或機(jī)體受到應(yīng)激因素刺激時(shí)，空腸彎曲桿菌可在動(dòng)物體內(nèi)大量繁殖，并通過(guò)粘附、趨化、定植和侵襲等方式，產(chǎn)生毒素并分泌致病蛋白。

研究證實(shí)空腸彎曲桿菌的毒力基因是主要的致病因素?？漳c彎曲桿菌的鞭毛也是一種毒力因子，并且是該菌能夠粘附到腸道上皮細(xì)胞的關(guān)鍵所在?？漳c彎曲桿菌鞭毛的調(diào)節(jié)中心包含傳感器FlgS，反應(yīng)調(diào)節(jié)器FlgR，空腸彎曲桿菌的調(diào)節(jié)器f l iA、 rpoN，以及持家基因rpoD，通過(guò)這些調(diào)節(jié)中心共同協(xié)作表達(dá)大量與運(yùn)動(dòng)性、蛋白分泌和侵入相關(guān)的基因。

空腸彎曲桿菌主要的結(jié)合因子是纖連蛋白結(jié)合外膜蛋白CadF、自動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CapA、胞質(zhì)結(jié)合蛋白PEB1和表面暴露脂蛋白JlpA。其中，CadF不僅可以通過(guò)特異結(jié)合腸細(xì)胞分離的纖維連接蛋白從而激發(fā)對(duì)宿主細(xì)胞的粘附，而且可以通過(guò)激發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，引起小GTP酶類Rac1和Cdc42的活化。

彎曲桿菌毒素CDT能引起許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞膨脹、延伸、溶脹以及死亡；CdtA和CdtC對(duì)于結(jié)合宿主細(xì)胞至關(guān)重要，而CdtB是復(fù)合體的活化部分。CDT能誘導(dǎo)人產(chǎn)生趨化性細(xì)胞因子IL-8。IL-8能誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞向感染部位趨化，引起腸道炎癥。

近年來(lái)的遺傳學(xué)和生物化學(xué)研究表明，空腸彎曲桿菌菌體表面脂寡糖（LOS）的核心寡糖末端或者側(cè)鏈糖基與哺乳動(dòng)物的某些神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)構(gòu)相似，感染后刺激機(jī)體產(chǎn)生LOS抗體，其與神經(jīng)節(jié)苷脂產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)，導(dǎo)致周圍神經(jīng)損傷。Nguyen等[4]證實(shí)LOS抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體不僅沒(méi)有免疫保護(hù)性，而且可能介導(dǎo)了神經(jīng)軸索的傷害，臨床上引起軟癱。唾液酸（SA）是脂多糖的組成部分。Xiang等[5]證實(shí)了SA是誘導(dǎo)引發(fā)格林巴利綜合征（Guillain-Barri）的主要抗原表位。唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因（cst II）是空腸彎曲桿菌合成神經(jīng)節(jié)苷脂樣的LOS必需的基因，改變?cè)摶虻幕钚詴?huì)影響其攜帶唾液酸分子的數(shù)量及轉(zhuǎn)移的位置。呂嘉敏等[6]研究證實(shí)，含唾液酸化LOS的空腸彎曲桿菌入侵細(xì)胞的能力顯著強(qiáng)于含非唾液酸化LOS的空腸彎曲桿菌。

3 特異性基因及檢測(cè)方法

常規(guī)PCR選用的靶基因有16S rDNA、23S rDNA、鞭毛蛋白基因（f l a A 或f l a B）、含鐵細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白基因（ceu E）以及細(xì)胞致死性膨脹毒素基因（CTD）等。

王振國(guó)等[7]通過(guò)對(duì)空腸彎曲桿菌基因組的保守序列分析，設(shè)計(jì)引物及Taqman探針，建立了一種針對(duì)空腸彎曲桿菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)法。該法對(duì)空腸彎曲桿菌增菌液的最低檢出限為5 CFU/mL，對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)限為10 CFU/mL。張康等[8]采用Nested-PCR法，對(duì)臨床采集的空腸彎曲菌感染雞樣品進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)第1次PCR反應(yīng)，擴(kuò)增了長(zhǎng)度為1 719 bp的特異DNA條帶；進(jìn)一步取第1次PCR反應(yīng)產(chǎn)物作為模板，擴(kuò)增了長(zhǎng)度為640 bp的特異DNA條帶，從而確保了該P(yáng)CR診斷空腸彎曲菌感染的特異性和靈敏性，24 h內(nèi)即可獲得檢測(cè)結(jié)果。翟海華等[9]選取空腸彎曲桿菌特異性的外膜蛋白A基因（maqA）和馬尿酸基因（hipO）為靶基因，采用雙重PCR法，擴(kuò)增出2個(gè)特異片段，大小分別為1 028bp和589 bp。該方法對(duì)空腸彎曲桿菌具有特異性。張騰飛等[10]根據(jù)彎曲桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞致死性膨脹毒素cdtABC操縱的子核酸序列，針對(duì)cdtA、cdtB和cdtC 設(shè)計(jì)并合成了3對(duì)特異性引物，用于建立空腸彎曲桿菌、結(jié)腸彎曲桿菌和彎曲桿菌屬細(xì)菌的多重PCR 檢測(cè)方法。結(jié)果表明，擴(kuò)增cdtB的引物為檢測(cè)彎曲桿菌屬通用，可鑒定彎曲桿菌屬細(xì)菌，而擴(kuò)增cdtA和cdtC的引物分別為空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌特異性的，能夠區(qū)分兩者的最低檢測(cè)限分別是120 CFU和100 CFU。孫久鶴等[11]設(shè)計(jì)并合成了空腸彎曲桿菌馬尿酸酶基因（hipO）和結(jié)腸彎曲桿菌致死性膨脹毒素基因（cdtC）2對(duì)特異性引物，建立并優(yōu)化了快速檢測(cè)空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌的雙重PCR方法，對(duì)空腸彎曲桿菌hipO基因和結(jié)腸彎曲桿菌cdtC基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小分別為653 bp和313 bp，靈敏度可達(dá)到6.68×10-2μg/mL。該P(yáng)CR方法1次能夠檢測(cè)出2種彎曲桿菌，且特異性和敏感性均高。

4 耐藥性及相關(guān)基因

在人類使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療疾病期間，發(fā)現(xiàn)了耐紅霉素空腸彎曲桿菌。Kittl等[12]研究發(fā)現(xiàn)，大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物在獸藥中的廣泛應(yīng)用加速了這一趨勢(shì)。Gibreel等[13]、Caldwell等[14]研究發(fā)現(xiàn)，大環(huán)內(nèi)酯高水平耐藥空腸彎曲桿菌，主要是由于23rRNAV域的A2074C 和A2075G堿基突變所致。由于空腸彎曲桿菌至少含有1個(gè)或2個(gè)耐甲氧芐啶基因，因此它對(duì)甲氧芐啶類藥物具有天然的耐藥性。

導(dǎo)致空腸彎曲桿菌喹諾酮藥物耐藥的基因突變大多發(fā)生在編碼DNA解旋酶的gyrA基因和編碼DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的parC基因上。在以上2個(gè)基因內(nèi)均有1個(gè)喹諾酮耐藥決定區(qū)（QRDR），被稱為“熱點(diǎn)”。在這段區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生的DNA突變是導(dǎo)致喹諾酮藥物耐藥的主要原因。目前研究已經(jīng)證實(shí)的突變部位主要是gyrA第125位，86位堿基發(fā)生由C→U的突變，90位堿基發(fā)生由G→A的突變，以及70位的堿基發(fā)生由G→A的突變。

不同來(lái)源空腸彎曲桿菌的分離率和耐藥性都有不同程度的差異。潘劍平等[15]研究發(fā)現(xiàn)，雞源空腸彎曲桿菌對(duì)各種常用藥物存在不同程度的耐藥性，但其耐藥性存在著明顯的地域性差異。同樣，各地分離的豬源空腸彎曲桿菌對(duì)各種常用藥物也不同程度地顯示出耐藥性且存在明顯的地域性差異。楊勝男等[16]研究發(fā)現(xiàn)，雞源和豬源的空腸彎曲桿菌的分離率分別為18.33%和32%；采用E-test藥敏試紙條法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞源和豬源空腸彎曲桿菌對(duì)紅霉素的耐藥性較高，均超過(guò)了80%；對(duì)萘啶酸和四環(huán)素的耐藥性超過(guò)了50%；雞源空腸彎曲桿菌對(duì)慶大霉素較為敏感，敏感度達(dá)到了86%；而豬源空腸彎曲桿菌對(duì)阿奇霉素和克林霉素較為敏感，敏感度分別達(dá)到81.2%和87.5%。龔振華等[17]研究表明，目前肉雞空腸彎曲桿菌的流行具有廣泛而多樣化的特點(diǎn)，紅霉素等3種抗菌藥對(duì)分離的空腸彎曲桿菌表現(xiàn)出較好的敏感性，其他抗菌藥對(duì)分離的空腸彎曲桿菌則表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性，特別是目前經(jīng)常使用的藥物，如環(huán)丙沙星等均對(duì)分離的空腸彎曲桿菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性；過(guò)多地使用氟喹諾酮類抗菌藥，可能是引起耐藥性的重要原因之一；同時(shí)發(fā)現(xiàn)多數(shù)分離株的耐藥性表現(xiàn)為8耐至10耐。

空腸彎曲桿菌耐藥性存在地域差異，原因可能是不同地區(qū)對(duì)動(dòng)物治療使用或飼料中添加的抗生素藥物的種類以及使用方法不同，或?qū)λ幬锏挠昧繕?biāo)準(zhǔn)有所不同；另外與不同地域的飼養(yǎng)條件和水平也有著密切關(guān)系。潘洪濤[18]研究表明，大蒜素抑菌作用強(qiáng)于環(huán)丙沙星和紅霉素。陳振華等[19]研究表明，大蒜素的抗菌活性主要在于其能夠與含有巰基的酶相互作用，不可逆地抑制巰基蛋白酶的活性。

5 防治

空腸彎曲桿菌在家禽特別是雞群中廣泛存在。自然條件下雞群母源抗體的存在大大減少了該菌的感染，證明了疫苗是控制該菌的重要手段，但商品化疫苗尚未出現(xiàn)。目前應(yīng)用于商品化肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)的主要防治手段主要有以下幾個(gè)方面：一是飼喂彎曲桿菌高免的軟黃抗體；二是特殊的飼料添加劑（益生菌，細(xì)菌素，噬菌體，植物源性飼料添加劑等），可以競(jìng)爭(zhēng)性排斥或者直接殺死家禽腸道內(nèi)目標(biāo)彎曲桿菌；三是做好飼養(yǎng)管理的各項(xiàng)細(xì)節(jié)，給提供雞群清潔飲水，對(duì)病死雞及時(shí)適當(dāng)處理；四是采取全進(jìn)全出制，每批飼養(yǎng)完畢徹底消毒。

[1] LIN J，YAN M，SAHIN O，et al. Effect of Macrolide Usage on Emergence of Erythromycin-Resistant Campylobacter Isolates in Chickens[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2007，51：1678-1686.

[2] CHAO H C，CHEN C C，CHEN S Y，et al. Bacterial enteric infections in children：etiology，clinical manifestations and antimicrobial therapy[J]. Expert Rev Anti Infect Ther，2006，4（4）：629-638.

[3] 龔筱麗. 七彩山雞彎曲桿菌性肝炎的診治[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志，2015，51（1）：47-49.

[4] NGUYEN V T，BARLOW R S，F(xiàn)EGAN N，et al. Role of capsular polysaccharides and lipooligosaccharides in Campylobacter surface properties，autoagglutination，and attachment to abiotic surface[J]. Foodborne Pathog Dis，2013，10（6）：506-513.

[5] XIANG S I，CAI F C，ZHANG X P，et al. Immunopathological evidence of terminal residues containing sialic acid in Campylobacter jejuni lipopolysaccharide as the critical antigen to induce peripheral neuropathy[J]. Zhonghua Er Ke Za Zhi，2005，43（9）：665-670.

[6] 呂嘉敏，張宗堯，萬(wàn)紅，等. 禽源空腸彎曲桿菌LOS基因簇多態(tài)性及其cstⅡ基因功能[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016， 36（9）：1516-1522.

[7] 王振國(guó)，劉金華，等. 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)空腸彎曲菌[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2005，21（12）：1097-1099.

[8] 張 康，龔振華，李蕾，等. 用Nested-PCR 診斷雞彎曲菌病的研究[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫，2012，29 （11）：44-46.

[9] 翟海華，王娟，蓋文燕，等. 膠東半島地區(qū)雞源空腸彎曲桿菌毒力基因攜帶狀況調(diào)查[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志，2015，51（5）：15-18.

[10] 張騰飛，詹麗超，羅玲，等. 彎曲桿菌多重PCR 檢測(cè)方法的建立[J]. 湖北畜牧獸醫(yī)，2013，34（9）：8-10.

[11] 孫久鶴，郭東春，李安，等. 空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌雙重PCR鑒別檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2016，46（1）：64-68.

[12] KITTL S，KUHNERT P，HCHLER H，et al. Comparison of genotypes and antibiotic resistance of Coampylobacter jejuni isolated from hunmans and slaughtered chikens in Switzerland[J]. J Appl Microbiol，2011，110（2）：513-520.

[13] GIBREEL A，KOS V N，KEELAN M，et al. Macrolide resistance in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli：molecular mechanism and stability of the resistance phenoty[J]. Antimicrobial Agentsand Chemotherapy，2005，49：2753-2759.

[14] CALDWELL D B，WANG Y，LIN J. Development，Stability，and Molecular Mechanisms of Macrolide Resistance in Campylobacter jejuni[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2008，52：3947-3954.

[15] 潘劍平，朱建國(guó)，華修國(guó)，等. 空腸彎曲桿菌對(duì)喹諾酮類藥物耐藥性研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2008，35（4）：73-76.

[16] 楊勝男，王娟，鄭增忍，等. 動(dòng)物源空腸彎曲桿菌的分離機(jī)耐藥性試驗(yàn)[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（8）：116-119.

[17] 龔振華，張康，王麗萍，等. 肉雞空腸彎曲桿菌的監(jiān)測(cè)與分析[J]. 中國(guó)家禽，2014，36（10）：59-62.

[18] 潘洪濤，楊宗興， 趙文萃，等. 大蒜素對(duì)空腸彎曲桿菌抑菌作用的研究[J]. 藥學(xué)實(shí)踐雜志，2015，33（12）：147-149.

[19] 陳振華，劉文恩. 碳青霉烯酶研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，31（6）：848.

（責(zé)任編輯：杜憲）

Review on Progress of Specif i c Genes Studies of Campylobacter Jejuni

Wang Yanbo1，Guo Guangli1，Zhang Yunxiang2，Wang Xiaoying1，Zhuang Guiyu3，Gong Zhenhua4
（1. Linqu Animal Husbandry Bureau，Linqu，Shandong 262600；2. Linqu Vocational School，Linqu，Shandong 262600；3. Huangdao Animal Husbandry Bureau，Qingdao，Shandong 266000；4. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Campylobacter jejuniis a zoonotic pathogen，causing a certain degree of hazards to public health and animal husbandry，especially for chicken industry. In this article，the research status ofCampylobacter jejuniwas reviewed on specific genes from the aspects of pathogen growth and epidemiological characteristics pathogenic mechanism，pathogenic gene，detection technology，antimicrobial resistance，and disease control，in order to provide reference for the prevention and control work in China.

Campylobacter jejuni；specif i c gene；antimicrobial resistance

S855.1

B

1005-944X（2017）07-0088-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.07.025

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201303044）

龔振華