環(huán)孢素A脂質(zhì)體的制備及穩(wěn)定性考察

徐小超，羅 肖，趙慧雯，王永軍

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環(huán)孢素A脂質(zhì)體的制備及穩(wěn)定性考察

徐小超，羅 肖，趙慧雯，王永軍*

（沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽，110016）

目的以薄膜分散法制備環(huán)孢素A脂質(zhì)體，并對其穩(wěn)定性進(jìn)行考察。方法以微柱離心法測定環(huán)孢素A脂質(zhì)體的包封率，以包封率為主要考察指標(biāo)，采用單因素考察與正交設(shè)計優(yōu)化處方工藝。通過對影響因素的研究及進(jìn)行的常溫、低溫實驗，考察液態(tài)脂質(zhì)體與脂質(zhì)體凍干粉的穩(wěn)定性。結(jié)果環(huán)孢素A脂質(zhì)體凍干前平均粒徑為80.1 nm，凍干后平均粒徑為82.2 nm，凍干前后的包封率分別為90.2%與88.9%，液態(tài)脂質(zhì)體對高溫、強(qiáng)光穩(wěn)定性較差，脂質(zhì)體凍干粉對高溫、強(qiáng)光穩(wěn)定性較好。結(jié)論經(jīng)凍干后的環(huán)孢素A脂質(zhì)體包封率較高，穩(wěn)定性提高。

藥劑學(xué)；脂質(zhì)體；凍干；環(huán)孢素A；包封率；穩(wěn)定性

環(huán)孢素A（cyclosporine A，CyA）是一種強(qiáng)效免疫抑制劑，近年來其在眼科多種疾病的治療如干眼癥[1]、春季卡他性結(jié)膜炎、葡萄膜炎和抑制角膜移植排斥反應(yīng)等方面已有廣泛應(yīng)用并取得較好療效。

環(huán)孢素A具有強(qiáng)親脂性，臨床上常用來治療干眼癥的環(huán)孢素A眼用制劑主要有兩種：一種為花生油、蓖麻油等植物油制劑[2]，該制劑眼部刺激大，患者通常不能耐受，并且由于血-眼房水屏障，吸收進(jìn)入眼部組織的藥物濃度低，生物利用度較低；另一種為由美國Allergan公司生產(chǎn)的眼用乳劑，商品名為RESTASIS?的環(huán)孢素A[3]，已上市，該乳劑對眼睛刺激性很小，病人有較好的耐受性。但是，RESTASIS?的眼部灼燒感、結(jié)膜充血、分泌物增加等不良反應(yīng)較為常見，且價格昂貴，購買不便。脂質(zhì)體作為一種優(yōu)良的給藥系統(tǒng)，目前正成為環(huán)孢素A眼用制劑的研究熱點(diǎn)。

脂質(zhì)體由磷脂和膽固醇組成，結(jié)構(gòu)與生物膜的雙分子層類似，具有良好的生物相容性與親和性[4]，能夠較快透過血-眼屏障，提高角膜穿透能力[5]，從而能夠提高環(huán)孢素A的生物利用度。脂質(zhì)材料本身無毒、無刺激性、無免疫原性、可生物降解，且與眼部組織的相容性好[6]，適合作為眼用制劑的載體材料。但部分液態(tài)脂質(zhì)體制劑易發(fā)生磷脂氧化分解、聚集沉降及藥物滲漏等問題，導(dǎo)致脂質(zhì)體不穩(wěn)定，冷凍干燥法所得脂質(zhì)體為固體制劑，能夠提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。本文作者應(yīng)用薄膜分散法制備環(huán)孢素A脂質(zhì)體，應(yīng)用冷凍干燥技術(shù)制備環(huán)孢素A凍干脂質(zhì)體，提高了脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

1 儀器與材料

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，79HW-1恒溫磁力攪拌器(浙江樂清樂成電器廠)，JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝科器研究所)，UV-1801紫外-可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司），ZetaSizer Nano ZEN1600粒徑測定儀 (英國Malvern儀器有限公司)，HITACHI 高效液相色譜儀（日本Hitachi公司），DZ5-2低速自動平衡離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠），F(xiàn)DU-1100冷凍干燥機(jī)（東京理化器械株式會社）。

環(huán)孢素A(福建科瑞藥業(yè)有限公司，批號130202N)，大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司)，膽固醇、麥芽糖(天津博迪化工有限公司)，維生素E（德國BASF公司），葡聚糖凝膠G-50（北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司），甲醇和乙腈（色譜純，天津康科德科技有限公司），其余試劑（分析純，市售）。

2 方法與結(jié)果

2.1 環(huán)孢素A脂質(zhì)體的含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：ACCHROM CBB18BB柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-甲醇-水（體積比60∶20∶20）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：210 nm；柱溫：60 ℃。

2.1.2 含量測定方法

量取環(huán)孢素A脂質(zhì)體適量，精密稱定。置于5 mL量瓶中，加甲醇破乳，用甲醇定容至刻度，取20 μL注入高效液相色譜儀中，通過外標(biāo)法計算其含量。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取環(huán)孢素A適量，精密稱定。以甲醇溶解并稀釋至質(zhì)量濃度分別約為2.5、5、10、20、30、40和50 mg·L-1的溶液，各進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。以溶液質(zhì)量濃度（）對峰面積（）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為= 3.774 5?104-1.130 6?104，= 0.999 9。環(huán)孢素A質(zhì)量濃度在2.5～50 mg·L-1內(nèi)與峰面積呈良好的線性相關(guān)性。

2.1.4 回收率與精密度試驗

分別取環(huán)孢素A約10、12.5和15 mg各3份，精密稱定。置于25 mL量瓶中，分別加入處方量的空白脂質(zhì)體，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成低、中、高3種質(zhì)量濃度的溶液；另取環(huán)孢素A適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中約含環(huán)孢素A 20 μg的溶液，作為對照溶液。按“2.1.1”條色譜條件測定，得環(huán)孢素A的平均回收率分別為(100.8士1.0)%、(100.4士0.3)%和(100.7士0.9)%。低、中、高3種質(zhì)量濃度的日內(nèi)RSD分別為1.5%、0.6%和0.9%，日間RSD分別為1.6%、0.6%和0.6%，各項指標(biāo)均符合測定要求。

2.2 環(huán)孢素A脂質(zhì)體包封率的測定

2.2.1 葡聚糖凝膠柱的制備

取葡聚糖凝膠顆粒（Sephadex G-50）適量，浸泡在蒸餾水中使其充分溶脹，加熱煮沸除盡氣泡，裝入底部墊有濾紙片的2 mL注射器中。待水分自然流下，將其置于離心機(jī)中，2 000 r·min-1離心2 min，使凝膠柱失水皺縮，凝膠部分高約2.0 cm，待用。

2.2.2 微型凝膠柱對空白脂質(zhì)體的吸附作用考察

精密量取0.2 mL空白脂質(zhì)體置于葡聚糖凝膠柱頂端，將其放于離心機(jī)中，1 800 r·min-1離心1 min，收集接受液，移取水化介質(zhì)0.2 mL，置于葡聚糖凝膠柱頂端，2 000 r·min-1離心3 min，連續(xù)操作3次，收集4次的接受液。上述操作平行操作2份并合并2次的接受液，置于2 mL量瓶中，用水化介質(zhì)定容至刻度，于波長500 nm處測定吸光度（BBtBB）；另取空白脂質(zhì)體0.4 mL置于2 mL量瓶中，用水化介質(zhì)定容至刻度，于波長500 nm處測定吸光度（BB0BB）；以上平行操作6份。根據(jù)公式（%）=（BBtBB/BB0BB）×100%，計算空白脂質(zhì)體的回收率，結(jié)果見表1。由表1可知，空白脂質(zhì)體的平均回收率為95.8%，表明微型凝膠柱對空白脂質(zhì)體幾乎無吸附。

Table 1 Recovery of blank liposome through mini-column (n=6)

2.2.3 微型凝膠柱對游離藥物吸附作用的考察

稱取環(huán)孢素A約5 mg加至10 mL空白脂質(zhì)體中，混合均勻，移取0.2 mL置于葡聚糖凝膠柱頂端，將其放入離心機(jī)中，1 800 r·min-1離心1 min，收集接受液；取水化介質(zhì)0.2 mL置于葡聚糖凝膠柱頂端，2 000 r·min-1離心3 min，連續(xù)操作3次，收集4次的接受液。按“2.1.2”條的方法測定被洗脫藥物的量）(BBtBB)；另取上述空白脂質(zhì)體與環(huán)孢素A混合物0.2 mL，置于5 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，按“2.1.2”條方法檢測藥物的總量(BB0BB)。以上平行操作6份，根據(jù)公式：(%)=（BB0BB-BBtBB）/BB0BB×100%，計算被吸附藥物含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，凝膠柱對游離藥物的吸附≥95%，平均值為95.8%，說明微型凝膠柱基本能將游離藥物與脂質(zhì)體分離。

Table 2 The adsorption of free drug on mini-column (n=6)

2.2.4 包封率的測定

移取環(huán)孢素A脂質(zhì)體0.2 mL置于葡聚糖凝膠柱頂端，將其放入離心機(jī)中，1 800 r·min-1離心1 min，收集接受液，移取水化介質(zhì)0.2 mL置于葡聚糖凝膠柱頂端，2 000 r·min-1離心3 min，連續(xù)操作3次，收集4次的接受液，置于5 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，按“2.1.2”條方法測定被包封藥物的量(BBinBB)；另取環(huán)孢素A脂質(zhì)體0.2 mL，置于5 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，按“2.1.2”條方法測定藥物的總量(BB0BB)。根據(jù)公式BBEEBB（%）=BBinBB/BB0BB×100%，計算環(huán)孢素A脂質(zhì)體的包封率。

2.3 環(huán)孢素A脂質(zhì)體處方與工藝的優(yōu)化

2.3.1 單因素考察

2.3.1.1 藥脂質(zhì)量比對包封率的影響

固定其他因素不變，改變藥脂質(zhì)量比為1∶3、1∶5、1∶10、1∶20、1∶30和1∶40，考察不同藥脂質(zhì)量比對環(huán)孢素A脂質(zhì)體包封率的影響，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，隨著藥脂質(zhì)量比的減小，脂質(zhì)體包封率升高，當(dāng)藥脂質(zhì)量比達(dá)1∶30以上時，脂質(zhì)體包封率不再升高，所以作者選擇藥脂質(zhì)量比1∶30作為藥脂比例。

Fig. 1 The influence of the ratio of CyA to C on entrapment efficiency of CyA-liposome

2.3.1.2 磷脂與膽固醇的質(zhì)量比對包封率的影響

膽固醇是脂質(zhì)體的“流動性緩沖劑”，可以調(diào)節(jié)磷脂的流動性。固定其他因素不變，改變磷脂與膽固醇的質(zhì)量比，使其分別為3∶1、6∶1、8∶1、12∶1和20∶1，考察其對環(huán)孢素A脂質(zhì)體包封率的影響，結(jié)果見圖2。

m(C)∶m(CH)

由圖2可以得出，隨著磷脂-膽固醇質(zhì)量比的升高，包封率先上升后下降。當(dāng)磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為8∶1時，包封率較高，膽固醇比例繼續(xù)增加時，包封率沒有明顯升高，所以作者選擇磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為8∶1。

2.3.1.3 水化溫度對包封率的影響

作者考察水化溫度為40、45、50和55 ℃時脂質(zhì)體包封率的變化，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著水化溫度的升高，包封率呈上升趨勢。但是溫度過高時，磷脂易降解，所以選擇50 ℃為水化溫度。

Fig. 3 The influence of hydration temperature on entrapment efficiency of CyA-liposome

2.3.1.4 水化介質(zhì)濃度對包封率的影響

水化介質(zhì)中離子強(qiáng)度會顯著影響脂質(zhì)體的形成，實驗中考察磷酸鹽濃度為0.1、0.5、1.0、10和50 mmol·L-1時脂質(zhì)體的外觀、粒徑與包封率，結(jié)果見圖4。

Fig. 4 The influence of hydration medium concentration on entrapment efficiency of CyA-liposome

其中10與50 mmol·L-1BS作為水化介質(zhì)所得脂質(zhì)體均為渾濁狀不均勻體系，在制備幾小時后即沉降分層。由圖4可以看出，隨著磷酸鹽濃度的增大，脂質(zhì)體包封率降低，當(dāng)磷酸鹽濃度過大時，脂質(zhì)體放置幾小時后沉降，不穩(wěn)定，而磷酸鹽濃度過小時緩沖能力較弱，不易維持脂質(zhì)體系統(tǒng)pH值穩(wěn)定。綜合考慮包封率與穩(wěn)定性，選擇0.5 mmol·L-1作為水化介質(zhì)濃度。

2.3.1.5 水化時間對包封率的影響

實驗中考察了水化時間為15、20、30、45和60 min時，脂質(zhì)體包封率的變化情況，結(jié)果見圖 5。

Fig. 5 The influence of hydration time on entrapment efficiency of CyA-liposome

從圖5可以看出，水化時間對脂質(zhì)體包封率影響不大，故選擇最短的水化時間15 min。

2.3.2 正交設(shè)計試驗

以包封率為主要考察指標(biāo)，通過正交設(shè)計法對環(huán)孢素A眼用脂質(zhì)體進(jìn)行處方工藝優(yōu)化。根椐單因素考察結(jié)果，采用四因素三水平LBB9BB(34)正交試驗，對脂質(zhì)體包封率影響較大的藥脂質(zhì)量比（）、磷脂與膽固醇質(zhì)量比（）、水化溫度（）和水化介質(zhì)濃度（）4個因素進(jìn)行考察。各因素及其水平與正交試驗結(jié)果見表3。

Table 3 The results of the orthogonal design of CyA-liposome preparations

由表3可知，正交設(shè)計與單因素考察的結(jié)果基本一致，處方工藝各因素對脂質(zhì)體包封率影響大小順序為>>>，最佳工藝為BB3BBBB2BBBB2BBBB2BB，即藥脂質(zhì)量比為1∶30、磷脂與膽固醇質(zhì)量比為8∶1、水化溫度為50 ℃、水化介質(zhì)為0.5 mmol·L-1BS。

2.3.3 環(huán)孢素A眼用脂質(zhì)體具體處方與工藝

環(huán)孢素A眼用脂質(zhì)體的具體處方為：環(huán)孢素A 5 mg，大豆磷脂150 mg，膽固醇 18.75 mg，維生素E 1.5 mg，水化介質(zhì)為0.5 mmol·L-1pH值7.4 BS。

采用薄膜分散法制備環(huán)孢素A眼用脂質(zhì)體。將環(huán)孢素A、大豆磷脂、膽固醇、維生素E等溶于適量二氯甲烷并置于圓底燒瓶中，于30 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，使其在瓶壁上形成均勻的脂質(zhì)薄膜，于溫度為50 ℃加入pH值7.4的磷酸鹽緩沖液適量，水化15 min，所得混懸液用探針式細(xì)胞粉碎機(jī)超聲至藍(lán)色半透明，再用已滅菌的0.22 μm的微孔濾膜過濾，即得。

2.4 環(huán)孢素A眼用脂質(zhì)體凍干制劑的制備

以50 g·L-1麥芽糖作為凍干保護(hù)劑，將“2.3.3”條下制備的環(huán)孢素A脂質(zhì)體于NBB2BB保護(hù)下分裝于安瓿瓶中，置于冷凍干燥機(jī)中干燥。凍干程序為-80 ℃預(yù)凍12 h，升溫至-40 ℃維持3 h，再升溫至-20 ℃維持15 h，最后升溫至30 ℃維持3 h。

2.5 環(huán)孢素A脂質(zhì)體性質(zhì)考察

2.5.1 外觀評價

環(huán)孢素A脂質(zhì)體溶液為半澄明的淡藍(lán)色膠體溶液，凍干制劑為白色粉末。

2.5.2 粒徑的測定

用Malvern粒徑測定儀對環(huán)孢素A脂質(zhì)體凍干前后粒徑進(jìn)行測定，環(huán)孢素A脂質(zhì)體凍干前平均粒徑為80.1 nm，凍干后平均粒徑為82.2 nm，凍干前后多分散系數(shù)DI分別為0.267與0.226，粒徑分布均較為均勻。

2.5.3 包封率的測定

按“2.2.4”條方法測定環(huán)孢素A脂質(zhì)體凍干前后的包封率分別為90.2%與88.9%。

2.6 環(huán)孢素A脂質(zhì)體溶液與凍干粉的穩(wěn)定性研究

將環(huán)孢素A脂質(zhì)體溶液與凍干粉進(jìn)行高溫、強(qiáng)光、常溫和低溫實驗，進(jìn)行穩(wěn)定性考察，結(jié)果見表4、5。

Table 4 Stability of CyA-liposome in stress tests

Table 5 Stability of CyA-liposome freeze-dried powder in stress tests

由表4可知，液態(tài)環(huán)孢素A脂質(zhì)體穩(wěn)定性較差，對高溫、光照等均不穩(wěn)定，放置10 d后，粒徑增大，粒度分布變大，藥物含量與包封率均明顯降低，但在常溫、低溫環(huán)境中較為穩(wěn)定。

由表5可知，環(huán)孢素A脂質(zhì)體凍干粉對高溫、強(qiáng)光照較液態(tài)脂質(zhì)體穩(wěn)定，各項性質(zhì)變化不大，將環(huán)孢素A脂質(zhì)體凍干有利于提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

3 討論

3.1 微柱離心法測包封率

目前常用的脂質(zhì)體包封率測定方法包括微柱離心法、透析法[7]、超速離心法[8]、陽離子交換樹脂法[9]和超濾膜過濾法[10]等。超速離心法重現(xiàn)性較差；陽離子交換樹脂法的機(jī)制是基于離子交換，對藥物有電荷要求；透析法則容易造成藥物的泄漏；超濾膜過濾法耗時較長。作者采用微柱離心法測定環(huán)孢素A脂質(zhì)體的包封率，可將環(huán)孢素A與脂質(zhì)體很好的分離，且所需樣品少，耗時短，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高。

3.2 薄膜分散法制備脂質(zhì)體

環(huán)孢素A為脂溶性藥物，采用被動載藥法將環(huán)孢素A包封于脂質(zhì)雙分子層之間，所得制劑包封率高，且操作方便[11]。

3.3 凍干制劑提高穩(wěn)定性

由于部分液態(tài)脂質(zhì)體在貯藏過程中容易出現(xiàn)聚集、藥物從脂質(zhì)膜中泄漏、磷脂氧化和水解等問題[12]，所以作者采用冷凍干燥法提高脂質(zhì)體的長期貯藏穩(wěn)定性。在凍干過程中，低溫、凍結(jié)、脫水等過程均可導(dǎo)致脂質(zhì)體脂質(zhì)雙分子層的折疊、融合、破裂及藥物滲漏，而在凍干過程中加入適宜的凍干保護(hù)劑，則可大大減輕甚至消除凍干對脂質(zhì)體質(zhì)量的影響。故作者選擇麥芽糖作為凍干保護(hù)劑，脂質(zhì)體凍干前后性質(zhì)變化不大，穩(wěn)定性提高。

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(本篇責(zé)任編輯：趙桂芝)

Preparation of cyclosporine A liposome and the study on its stability

XU Xiaochao, LUO Xiao, ZHAO Huiwen, WANG Yongjun*

(,,110016,)

ObjectiveTo prepare CyA-loaded liposome by thin-film dispersion method and to study the stability of CyA liposome. Method Minicolumn-centrifuge method was employed to determine the encapsulation efficiency of the liposome. Single factor test was performed with entrapment efficiency as the main index and orthogonal design was adopted to optimize the formulation. The influence factors, as room temperature and low temperature, were investigated with regard to the stability of liposome in the form of liquid and freeze-dried powder. Result The particle size of CyA liposome before and after freeze drying were 80.1 nm and 82.2 nm, respectively. The entrapment efficiency was 90.2% and 88.9% , respectively. CyA liposome of liquid state was not stable to heat and light, but CyA-liposome freeze-dried powder only had a little sensitive to heat and light in influence factors test. ConclusionThe entrapment efficiency of CyA-loaded liposome is high after freeze-drying and the stability is improved.

pharmaceutics; liposome; freeze-drying; cyclosporine A; entrapment efficiency; stability

（2016）01–0001–10

10.14146/j.cnki.cjp.2016.01.001

R94

A

2015-04-13

徐小超(1990–), 女(漢族), 湖南長沙人, 碩士研究生, E-mail xuxiaochao8321@163.com;

王永軍(1977–), 男(漢族), 山東榮成人, 副教授, 博士, 碩士生導(dǎo)師, 主要從事新型抗癌藥物納米給藥系統(tǒng)及藥物制劑新劑型新技術(shù)等研究, Tel. 024-23986325,E–mail i_maple@163.com。