MicroRNA在強(qiáng)直性脊柱炎成骨、破骨機(jī)制中的作用

楊文雪 夏啟勝 陶慶文 周童亮 張?zhí)m 陳志華 閻小萍 孔維萍*

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029 2. 中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029 3. 中日友好醫(yī)院中醫(yī)風(fēng)濕病科，免疫炎性疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種以骶髂關(guān)節(jié)及脊柱中軸關(guān)節(jié)為主要病變的慢性進(jìn)行性炎癥性疾病[1]。尤其以骶髂關(guān)節(jié)、脊柱及外周關(guān)節(jié)(尤其是髖關(guān)節(jié)) 骨化強(qiáng)直和外周附著點(diǎn)病理性成骨為特點(diǎn)，脊柱和關(guān)節(jié)骨化強(qiáng)直是AS患者致殘的主要原因。目前，AS病因尚不明確，大多研究認(rèn)為與遺傳、感染、免疫、環(huán)境因素等有關(guān)。

微小RNA(Micro RNA，miRNA)是近年來研究的一個熱點(diǎn)，越來越多的研究表明miRNA調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化與功能，提示miRNA是骨形成、吸收、重塑和修復(fù)過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。而AS的典型病理改變?yōu)檠装Y、骨破壞和新骨形成[1]。本綜述著重介紹與miRNA在強(qiáng)直性脊柱炎的成骨、破骨等過程中的作用相關(guān)的研究進(jìn)展。

miRNA是長度為20～22bp的高度保守的小分子非編碼RNA，最早是1993年Lee等人[2]在秀麗隱桿線蟲的線粒體中發(fā)現(xiàn)的。一般認(rèn)為，miRNA的產(chǎn)生首先是在細(xì)胞核內(nèi)形成初級前體(pri-miRNA)，pri-miRNA在核酸酶和輔助因子的作用下形成miRNA前體(pre-miRNA)。隨后，pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)另一種核酸酶剪切形成miRNA*雙鏈。這種雙鏈結(jié)構(gòu)在解旋酶的作用下解旋成兩條鏈，其中一條鏈被降解，通常5’端堿基配對不穩(wěn)定的另一條鏈則結(jié)合多種蛋白質(zhì)因子形成沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)[3]，與靶mRNA進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對，形成部分配對的miRNA-mRNA雙鏈分子，通過類似RNAi(RNA interference)的機(jī)制，抑制翻譯或降解mRNA，對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控。從1993年首次在線粒體內(nèi)發(fā)現(xiàn) miRNA，到現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)miRNA 28645種，存在于人體內(nèi)的有2661種[4]，它可能調(diào)控著至少 1/3的人類編碼蛋白基因。miRNA的表達(dá)異常或與mRNA結(jié)合力的異常會使基因表達(dá)失控，引起各種疾病。已經(jīng)有較多研究驗(yàn)證 miRNA參與了多個系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展，包括腫瘤、自身免疫性疾病及心功能不全等，且 Mitchell等[5]和Gilad 等[6]的檢測結(jié)果表明血漿中的內(nèi)源 miRNA 分子和血清miRNA不僅為各種常見病種和疑難雜癥的研究開闊了思路和方向，并且其本身就具有極好的生物標(biāo)志物的潛力。

1 miRNA在成骨機(jī)制中的作用

成骨細(xì)胞中的miRNA對成骨細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)骨形成起關(guān)鍵作用，初步研究已經(jīng)證實(shí)了骨組織中許多特定miRNAs的功能活性。AS的成骨過程主要與經(jīng)典wnt通路、BMP通路相關(guān)。

1.1 miRNA在經(jīng)典wnt通路中的作用

Wnt蛋白及其受體、調(diào)節(jié)蛋白等組成的復(fù)雜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括Wnt/β-catenin經(jīng)典信號通路、Wnt/平行極性、Wnt/Ca2+、調(diào)節(jié)紡錘體定向和不對稱細(xì)胞分類信號的非經(jīng)典通路。其中經(jīng)典通路是介導(dǎo)成骨過程的關(guān)鍵[7]。在經(jīng)典Wnt信號通路中Wnt蛋白(Wnt1、Wnt3a、Wnt8a、Wnt10b)等與細(xì)胞跨膜特異性受體卷曲蛋白(frizzled，F(xiàn)rz)及輔助受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LDL-receptor-related protein5/6，LRP5/6)結(jié)合后，從而抑制β-catenin降解復(fù)合物的活性，使細(xì)胞內(nèi)β-catenin水平升高，啟動下游靶基因轉(zhuǎn)錄。Dickkopf1(DKK1)是經(jīng)典Wnt信號通路的抑制因子，其能夠鈍化LRP5/6，減弱Wnt蛋白與LRP5/6的結(jié)合，從而抑制經(jīng)典Wnt信號通路的激活[8]。

大量研究表明miR-29a在成骨分化過程中起關(guān)鍵作用，與強(qiáng)直性脊柱炎密切相關(guān)。研究證實(shí)miR-29a在成骨細(xì)胞分化過程中表達(dá)上調(diào)，其激活位點(diǎn)為經(jīng)典Wnt通路中信號分子T細(xì)胞因子/淋巴樣增強(qiáng)因子-1；增強(qiáng)miR-29a表達(dá)后能有效下調(diào)經(jīng)典Wnt信號通路的抑制劑DKK1，進(jìn)而強(qiáng)化Wnt信號通路。提示DKK1是miR-29a的作用靶點(diǎn)，miR-29a通過下調(diào)DKK1從而激活經(jīng)典Wnt信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[9]。Huang等[10]研究發(fā)現(xiàn)AS患者miR-29a表達(dá)較類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者及健康對照組顯著增高，并與AS新骨形成放射學(xué)評分(the modified stoke ankylosing spondylitis spine score，mSASSS)成正相關(guān)，但與疾病活動性無關(guān)。扶忠超等[11]發(fā)現(xiàn)miR-29a在AS患者PMBC中高表達(dá)，與Wnt/β-catenin通路中Dkk-1、GSK-3β的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與β-catenin表達(dá)呈正相關(guān)，伴隨著成骨相關(guān)基因Runx2的高表達(dá)，miR-29a可能通過下調(diào)Dkk-1調(diào)控Wnt/β-catenin通路參與AS新骨形成。AS患者的PBMCs中miR-29a相對表達(dá)量與β-catenin、Runx2、病程、mSASSS呈正相關(guān)，與Dkk-1、GSK-3β呈負(fù)相關(guān)；病程與mSASSS亦呈正相關(guān)，miR-29a與血清中CRP、ESR均無相關(guān)性。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)miR-29a下調(diào)，如Li等[12]發(fā)現(xiàn)miR-29a在AS患者中顯著下調(diào)，miR-29a主要以DKK1和GSK3β為靶點(diǎn)調(diào)節(jié)TNF-α介導(dǎo)的骨丟失，從而激活wnt/β-catenin信號通路。另有研究發(fā)現(xiàn)[13]未經(jīng)依那西普治療的活動期AS患者中的miR-29a較對照組顯著降低，但經(jīng)過12w依那西普治療后miR-29a顯著上調(diào)。研究結(jié)果的差異可能和種族、生活方式、樣本量大小等因素有關(guān)。

Zhang等[14]研究證實(shí)miR-335-5p通過作用于DKK1的3’UTR端來下調(diào)DKK1，導(dǎo)致wnt通路增強(qiáng)，GSK3β磷酸化作用和β-catenin轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，從而調(diào)節(jié)成骨分化；而經(jīng)過抗miR-335-5p治療后miR-335-5p的作用被顛倒，并且可以下調(diào)內(nèi)生的miR-335-5p。Lin等[15]發(fā)現(xiàn)miR-335-5p和它的寄主基因(host gene)Mest共表達(dá)，并且在小鼠MSC軟骨生成中顯著上調(diào)。miR-335-5p過表達(dá)導(dǎo)致軟骨生成標(biāo)志基因表達(dá)增加；分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)miR-335-5p的靶基因是Daam1和ROCK1，一組Sox9的負(fù)調(diào)節(jié)因子；Sox9下調(diào)miR-29a和miR-29b的表達(dá)，同時負(fù)調(diào)節(jié)Mest的表達(dá)；因此形成一個從miR-335-5p到Sox9再到Mest/miR-335-5p的正反饋循環(huán)。在mMSC軟骨分化過程中miR-335-5p以DKK1為靶點(diǎn)增加β-catenin/TCF活性，導(dǎo)致Mest轉(zhuǎn)錄水平增加。

miR-218也是促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的wnt通路的強(qiáng)大的激活者。miR-218在成骨細(xì)胞和骨的轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞中高表達(dá)，以wnt的3種抑制劑：Sclerostin、DKK1和SFRP2為靶點(diǎn)，通過減少它們的表達(dá)來激活wnt通路，并激活自身放大正調(diào)節(jié)回路[16]。

經(jīng)典wnt在骨形成的不同階段都起作用，miR-27在成骨細(xì)胞分化和骨形成中起關(guān)鍵作用。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-27在hFOB1.19細(xì)胞分化過程中表達(dá)增高，miR-27的異常表達(dá)促進(jìn)hFOB1.19細(xì)胞分化，而抑制miR-27則使細(xì)胞分化受到抑制；miR-27的表達(dá)水平與β-catenin蛋白呈正相關(guān)；miR-27以APC為靶點(diǎn)并抑制其表達(dá)，通過使β-catenin積累來激活wnt通路。而Guo等[18]則發(fā)現(xiàn)在hPOB1.19細(xì)胞增殖和成骨分化過程中外源的miR-27a可以顯著抑制sFRP1的mRNA和蛋白水平；miR-27過表達(dá)或者敲除sFRP1可以顯著增加hFOB的凋亡率、細(xì)胞周期在G2-M期的百分率、關(guān)鍵成骨分化標(biāo)志(ALP、SPP1、Runx2、ALP活性)的表達(dá)，并使hFOB中的β-catenin積累。證明miR-27通過抑制sFRP1的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)來促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。

1.2 miRNA在BMP通路中的作用

骨形態(tài)生成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)/Smads信號傳導(dǎo)通路目前被認(rèn)為是強(qiáng)直性脊柱炎病理成骨的一條重要途徑。BMP是轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的一員[19]，通過激活Smads蛋白將TGF-β信號由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)至細(xì)胞核，誘導(dǎo)核內(nèi)成骨基因表達(dá)，使組織纖維化、骨化。迄今發(fā)現(xiàn)的約20 多種BMP 成員中，以BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7和BMP-9在成骨作用方面尤為重要。Runx是調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，包括Runx1、2和3，特別是Runx2是BMP-2的靶基因，是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)分化、骨發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子[20]。近年來，多種與 BMP信號通路相關(guān)的小RNA被報(bào)道，它們或積極或消極的調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化[21]。

Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)了一系列調(diào)控Runx2成骨活性和影響成骨細(xì)胞成熟的miRNAs，包括miR-23a、miR-30c、miR-34c、miR-133a、miR-135a、miR-137、miR-204、miR-205、miR-217和miR-338，證實(shí)這些miRNA與Runx2表達(dá)量相反，可直接減少Runx2的蛋白積聚。

Chen等[23]研究發(fā)現(xiàn)miR-23b在BMP9誘導(dǎo)的C2C12成肌細(xì)胞中顯著下調(diào)。在C2C12成肌細(xì)胞中miR-23b過表達(dá)能夠顯著抑制成骨分化；另外，研究發(fā)現(xiàn)miR-23b通過作用于Runx2 3′UTR的特定位點(diǎn)來負(fù)調(diào)節(jié)Runx2的轉(zhuǎn)錄后水平。敲除C2C12成肌細(xì)胞中的Runx2能促進(jìn)miR-23b誘導(dǎo)的成骨分化抑制。在成骨細(xì)胞系中Runx2通常是上調(diào)的，與miR-23b的表達(dá)剛好相反。因此認(rèn)為miR-23b以Runx2基因?yàn)榘悬c(diǎn)抑制BMP9誘導(dǎo)的C2C12成肌細(xì)胞成骨分化。在BMP2介導(dǎo)的C2C12成骨分化過程中與成骨分化相關(guān)的miRNAs被下調(diào)[24]，其中miR-133、miR-135分別以Runx2和Smad5為靶點(diǎn)調(diào)節(jié)成骨分化(Runx2是骨形成過程中早期必需的BMP反應(yīng)基因，Smad5是BMP2成骨信號的關(guān)鍵傳感器)。

Zeng等[25]的研究顯示miR-100過表達(dá)可以抑制體外人脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells，hASCs)的成骨分化，而miR-100下調(diào)則促進(jìn)此過程。靶點(diǎn)預(yù)測分析和雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因證實(shí)miR-100的直接靶基因?yàn)锽MPⅡ型受體(BMP receptor type Ⅱ，BMPR2)。通過RNA干擾敲除BMPR2抑制hASCs的成骨分化，與miR-100上調(diào)的作用類似。

Pais等[26]在蛋白水平上發(fā)現(xiàn)miR-140通過抑制Smad3來抑制TGFβ通路，而TGFβ可以抑制miR-140的積聚，由此形成一個雙重的負(fù)反饋循環(huán)。

眾多研究表明[27-28]，noggin蛋白為BMP通路的一種拮抗劑，miRNA也通過noggin來調(diào)節(jié)BMP通路。Ning等[29]發(fā)現(xiàn)noggin3是miR-92a的直接作用靶點(diǎn)：mir-92a失活使noggin3水平穩(wěn)定，導(dǎo)致BMP信號通路和軟骨細(xì)胞形成受到抑制；相反，miR-92a異位表達(dá)使noggin3 mRNA的水平加倍降低，結(jié)果抑制BMP通路并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

2 miRNA在破骨機(jī)制中的作用

2.1 miRNA與RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)的關(guān)系

由細(xì)胞核因子KB受體活化因子配體(receptor activator of NF-KB ligand，RANKL)、細(xì)胞核因子KB受體活化因子(receptor activator of NF-KB，RANK)和護(hù)骨素(osteoprotegerin，OPG)組成的RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)近些年來被發(fā)現(xiàn)在AS骨代謝和骨損傷的機(jī)制中起著重要作用。RANKL、RANK、OPG 3者同屬于腫瘤壞死因子超家族。

Shi等[30]發(fā)現(xiàn)miR-17/20a能顯著降低RANKL蛋白水平，并減少成骨細(xì)胞中地塞米松誘導(dǎo)的RANKL表達(dá)，熒光素酶報(bào)告進(jìn)一步證實(shí)了miR-17/20a抑制RANKL蛋白的后期轉(zhuǎn)錄；在破骨細(xì)胞和miR-17/20a過表達(dá)的成骨細(xì)胞共培養(yǎng)的條件下，地塞米松誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化和功能的能力明顯下降。

2.2 miRNA對破骨細(xì)胞的影響

有研究發(fā)現(xiàn)[31]在破骨細(xì)胞分化的各個階段有37種miRNA發(fā)生改變，其中22種上調(diào)，15種下調(diào)。Waki等[32]發(fā)現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)骨折愈合的第14天，5種miRNAs(miR-140-3p、miR-140-5p、miR-181a-5p、miR-181d-5p、miR-451a)與不愈合的骨折相比顯著升高。

Zhao等[33]研究表明miR-214在破骨細(xì)胞分化過程中起關(guān)鍵作用，骨髓單核細(xì)胞(bone marrow monocytes，BMMs)中miR-214過表達(dá)促進(jìn)破骨細(xì)胞生成，反之則抑制。miR-214通過P13K/Akt通路發(fā)揮作用。進(jìn)一步體內(nèi)研究顯示，破骨細(xì)胞特定miR-214轉(zhuǎn)基因小鼠(osteoclast specific miR-214 transgenic mice，OC-TG214)中抑癌基因水平下調(diào)，破骨細(xì)胞活性增加，骨密度降低。

Huang 等[34]發(fā)現(xiàn)AS患者中miR-21、程序性細(xì)胞凋亡4(programmed cell death 4，PDCD4)mRNA和膠原交聯(lián)C端肽(collagen cross-linked C-telopeptide，CTX)表達(dá)顯著升高；未服用NSAID和DMARD藥的強(qiáng)直性脊柱炎患者miR-21與PDCD4 mRNA呈負(fù)相關(guān)，而服用柳氮的強(qiáng)直性脊柱炎患者的miR-21與PDCD mRNA和CTX卻呈正相關(guān)；miR-21與CTX的水平與病程和活動性呈正相關(guān)。

3 miRNA與炎癥因子的關(guān)系

let-7i在強(qiáng)直性脊柱炎患者的T細(xì)胞中過表達(dá)，并與腰椎BASRI呈正相關(guān)，其靶基因蛋白TLR-4在強(qiáng)直性脊柱炎患者的T細(xì)胞中減少，而IFN-γ mRNA在AS的T細(xì)胞中升高[35]。Hou等[36]也發(fā)現(xiàn)AS患者T細(xì)胞中l(wèi)et-7i表達(dá)上調(diào)，而胰島素樣生長因子1受體(insulin like growth factor-1 receptor，IGF1R)表達(dá)下調(diào)(IGF1R位于T細(xì)胞表面，決定T細(xì)胞的激活，IGF1R高水平對于維持T細(xì)胞活性至關(guān)重要)，進(jìn)一步研究表明IGF1R是let-7i的直接作用靶點(diǎn)，而let-7i能夠顯著抑制IGF1R的表達(dá)，IGF1R抑制導(dǎo)致細(xì)胞自噬。因此，小RNA let-7i通過IGF1R誘導(dǎo)細(xì)胞自噬來保護(hù)T細(xì)胞免于細(xì)胞凋亡。Niimoto 等[37]研究發(fā)現(xiàn)6種小RNA(let-7a、miR-26、miR-146a/b、miR-150和miR-155)在產(chǎn)生IL-17的T細(xì)胞中顯著升高，其中miR-146a與IL-17的關(guān)系更加密切。K?rner等[38]研究發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)生IL-22的T細(xì)胞中miR-323-3p表達(dá)升高而miR-93、miR-181a、miR-26a和miR-874表達(dá)下調(diào)，分析表明這些不同表達(dá)的小RNA可以影響T細(xì)胞的增長、分化和功能；在IL-22和IL-17雙陽性的T細(xì)胞中miR-323-3p表達(dá)最高，它可以抑制TGF-β通路的多種基因，并抑制T細(xì)胞分泌IL-22。

miR-155通過誘導(dǎo)促炎性因子TNF生成來促進(jìn)炎癥[39]。與此研究一致，miR-155缺陷的小鼠不會得膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎[40]。Li 等[41]研究發(fā)現(xiàn)miR-130a與TNF-α呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)，在軟骨細(xì)胞中，miR-130a功能缺失增加TNF-α的表達(dá)，并促進(jìn)炎癥發(fā)生。

4 小結(jié)

近年來，miRNA在AS發(fā)病機(jī)制中的作用已取得了一定的進(jìn)展，多種miRNA通過影響成骨通路如wnt/β-catenin信號通路及BMP/Smads通路、破骨機(jī)制如RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)及破骨細(xì)胞以及炎性因子等多個方面對強(qiáng)直性脊柱炎成骨、破骨的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用。雖然多篇文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA的表達(dá)譜存在改變，但目前這類結(jié)果仍然缺乏一致性，對于一種miRNA可調(diào)控多少種蛋白的表達(dá)仍不明確。隨著研究的深入，miRNA調(diào)控AS的機(jī)制必將進(jìn)一步得到揭示，miRNA對AS的診斷和治療必將產(chǎn)生重要意義。