牛副流感病毒3型實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國，張 穎，莫 玲，劉吉山

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

綜述與專論

牛副流感病毒3型實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國，張 穎，莫 玲，劉吉山

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

牛呼吸道疾病綜合征是引起世界范圍內(nèi)飼養(yǎng)牛發(fā)病和死亡的主要原因，嚴(yán)重危害著世界養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。牛副流感病毒3型是引起牛呼吸道疾病綜合征的主要病原之一，主要引起成年牛和犢牛的肺炎、支氣管肺炎等。文章綜述了近年來牛副流感病毒3型的最新實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究進(jìn)展，以期為預(yù)防和控制疾病提供參考。

牛副流感病毒3型；牛呼吸道疾病綜合征；檢測(cè)；研究進(jìn)展

牛呼吸道疾病綜合征（bovine respiratory disease complex，BRDC）是引起世界范圍內(nèi)飼養(yǎng)牛發(fā)病和死亡的主要原因，嚴(yán)重危害著世界養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。牛副流感病毒3型（bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）與牛呼吸道合胞體病毒（bovine respiratorysyncytialvirus，BRSV）、牛病毒性腹瀉病毒（bovine viraldiarrhea virus，BVDV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）一起構(gòu)成了BRDC的主要病原。BPIV3通常被稱為“運(yùn)輸熱”病毒，為副黏病毒科呼吸道病毒屬的成員。BPIV3感染主要引起成年牛和犢牛的肺炎、支氣管肺炎和被感染肺葉的實(shí)質(zhì)性病變。此病在臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)熱、流淚、流鼻涕和呼吸加快等癥狀。BPIV3最早分離于美國，目前在牛群中的感染已呈世界性分布。BPIV3有3個(gè)基因型，分別為A型、B型和C型，國內(nèi)分離株主要為A型和C型。BPIV3本身致病力不強(qiáng)，但在其他繼發(fā)性細(xì)菌（特別是多殺性巴氏桿菌或溶血性巴氏桿菌）及外界誘因（特別是長(zhǎng)途運(yùn)輸中受寒、饑餓、擁擠、氣候惡劣等）的聯(lián)合作用下，則可產(chǎn)生嚴(yán)重呼吸道癥狀，甚至可引起病牛的死亡。目前我國對(duì)BPIV3的研究尚處于起步階段，在臨床預(yù)防和治療中還沒有安全、高效的疫苗和藥物。本文綜述了近年來BPIV3的最新實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究進(jìn)展，以期為預(yù)防和控制疾病提供參考。

1 病原學(xué)檢測(cè)方法

病原學(xué)檢測(cè)方法最常用的為病毒的分離與鑒定，采集病牛的鼻拭子擦拭液或病變組織，經(jīng)處理后接種牛腎傳代細(xì)胞（MDBK）培養(yǎng)。BPIV3在細(xì)胞上通常會(huì)產(chǎn)生典型的細(xì)胞病變（CPE），如細(xì)胞融合和蝕斑等。有一些毒株不會(huì)產(chǎn)生明顯的CPE，可以通過使用紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)來確認(rèn)是否有病毒的存在，常用的方法有牛紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)法和豚鼠紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)法，但有些毒株要在體外適應(yīng)一段時(shí)間后才能出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。電鏡觀察BPIV3是具有囊膜的病毒，并且大小在150～250 nm。劉鵬［1］利用MDBK細(xì)胞從黑龍江某牛場(chǎng)病牛鼻液中分離到1株可產(chǎn)生特定的CPE，經(jīng)過理化特性和核酸序列測(cè)定分析后確定為A型BPIV3。呂闖等［2］在我國山東省首次分離到基因C型的BPIV3。

2 血清學(xué)檢測(cè)方法

2.1 血凝和血凝抑制試驗(yàn)（HA和HI）

副黏病毒為主要的紅細(xì)胞凝集性病毒，BPIV3可以凝集雞、豚鼠和人的“O”型紅細(xì)胞，根據(jù)這一特性可以鑒定BPIV3。由于牛血清具有非特異性的血凝抑制活性，在進(jìn)行HI試驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行預(yù)處理，以消除非特異性反應(yīng)。BPIV3感染程度較輕的牛不出現(xiàn)臨床癥狀，但HI效價(jià)一般可達(dá)1∶40；感染后出現(xiàn)臨床癥狀的牛血清的HI效價(jià)則可達(dá)1∶640，甚至更高。在檢測(cè)時(shí)最好有急性期和康復(fù)期的雙份血清的結(jié)果才有說服力。HA和HI試驗(yàn)因成本低、操作方便、能在短時(shí)間內(nèi)獲得結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)而成為該病毒常用的檢測(cè)方法，但BPIV3在保存和運(yùn)輸過程中均存在很大的變異性，試驗(yàn)往往會(huì)導(dǎo)致假陰性的誤判。

2.2 免疫熒光試驗(yàn)

王海勇［3］初步建立了檢測(cè)BPIV3的直接免疫熒光方法，具有良好的敏感性和特異性，檢測(cè)到BPIV3的最小劑量為10 TCID50/mL，為BPIV3抗原的檢測(cè)提供了重要的手段。

2.3 中和試驗(yàn)

中和試驗(yàn)是經(jīng)典的鑒定BPIV3的血清學(xué)檢測(cè)方法?；糁驹频龋?］為了解我國北方3省（區(qū)）牛副流感病毒3型的感染狀況，從內(nèi)蒙古、吉林、山西3個(gè)省采集牛血清樣品482份，采用病毒中和試驗(yàn)方法進(jìn)行BPIV3抗體檢測(cè)。結(jié)果482份血清中BPIV3陽性共439份，陽性率為91.08%，表明這3?。▍^(qū)）牛群中普遍存在BPIV3的感染。王海勇等［5］從黑龍江、遼寧、新疆、云南、貴州、廣西、河北、山東、河南、江西、湖南和福建12個(gè)省份采集牛血清樣品2 489份，采用血清中和試驗(yàn)進(jìn)行BPIV3抗體檢測(cè)，結(jié)果除江西省血清樣品陽性率為27.8%之外，其他省份陽性率均高于50%；2 489份血清樣品中陽性樣品數(shù)為1 932份，總體陽性率為77.6%。表明BPIV3在我國流行比較廣泛，迫切需要對(duì)該病毒進(jìn)行深入研究以有效防控BPIV3感染。中和試驗(yàn)準(zhǔn)確性高，許多新建立的方法必須都以該方法作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。但是，該方法操作復(fù)雜，試驗(yàn)周期長(zhǎng)，限制了其在臨床上的快速診斷。

2.4 ELISA

吳海濤［6］和史鴻飛［7］分別用原核表達(dá)的BPIV3 HN蛋白和N蛋白作為包被抗原初步建立了檢測(cè)BPIV3抗體的間接ELISA方法。劉鵬［1］利用純化后的重組N蛋白作為包被抗原，建立了間接ELISA方法。應(yīng)用該法對(duì)黑龍江省部分地區(qū)的603份牛血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，BPIV3的抗體陽性率為78.44%。周玉龍等［8］以原核表達(dá)的BPIV3 HJ-1株重組HN蛋白為包被抗原，建立了間接ELISA方法，與病毒中和試驗(yàn)符合率高達(dá)96%。呂闖［9］用碳酸鹽緩沖液（CBS）將BPIV3粗分離病毒液作200倍稀釋包被ELISA板，以制備的BPIV3核衣殼蛋白的5E5單抗為待阻斷抗體，通過方陣滴定試驗(yàn)確定最佳反應(yīng)條件，初步建立了固相阻斷ELISA（SPB-ELISA），對(duì)231份免疫牛血清及54份來自哈爾濱周邊地區(qū)的牛血清進(jìn)行抗體檢測(cè)，結(jié)果免疫牛血清中陽性血清樣品數(shù)為220份，陽性率為95.2%；哈爾濱周邊地區(qū)牛血清中陽性血清樣品數(shù)為34份，陽性率為62.9%。任建樂［10］成功制備了7株針對(duì)NP蛋白的單克隆抗體，并對(duì)其中效價(jià)高的5株單克隆抗體進(jìn)行了表位鑒定，鑒定出兩個(gè)抗原表位。用針對(duì)上述兩個(gè)不同抗原表位的單抗6F8和7G9建立了雙抗體夾心ELISA（DAS-ELISA）方法。李麗陽等［11］以純化的兔抗BPIV3多克隆抗體（PAb）作為包被抗體，鼠抗BPIV3單克隆抗體（MAb）作為檢測(cè)抗體，采用棋盤滴定法確定DAS-ELISA的最適工作條件，建立了BPIV3雙抗體夾心ELISA方法。利用該方法和RT-PCR法對(duì)75份牛鼻拭子臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，兩者符合率為94.6%。楊建樂等［12］通過分析NP和HN蛋白主要抗原表位區(qū)并對(duì)其串聯(lián)后原核表達(dá)，以純化的重組蛋白為包被抗原建立了間接ELISA方法，對(duì)采自山東、遼寧和天津的270份臨床血清樣本檢測(cè)后總的陽性率為82.59%（223/270）。ELISA方法適用于獸醫(yī)基層臨床樣品的大規(guī)模檢測(cè)。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

3.1 RT-PCR

Vaucher等［13］根據(jù)BPIV3的HN基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物建立了RT-PCR方法，在所有的檢測(cè)樣品中都能夠檢測(cè)到大小為1 009 bp的目的條帶。國內(nèi)劉鵬［1］根據(jù)BPIV3HN基因序列設(shè)計(jì)引物，建立了RT-PCR方法。劉曉樂等［14］分別針對(duì)BPIV3NP蛋白和BVDV E2基因設(shè)計(jì)2對(duì)引物，經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)條件建立了快速鑒別BPIV3和BVDV的雙重RT-PCR方法，BPIV3的敏感度可達(dá)10-3TCID50/0.1mL。Thonur等［15］針對(duì)IBRV的糖蛋白B基因、BRSV核衣殼基因、BPIV3的核蛋白基因設(shè)計(jì)的多重反轉(zhuǎn)錄定量PCR（mRT-qPCR），通過對(duì)臨床541份樣品檢測(cè)與傳統(tǒng)的病毒分離和間接免疫熒光抗體試驗(yàn)技術(shù)比較，證明了該方法更快速，特異性高，并且比病毒分離和間接免疫熒光抗體技術(shù)更加敏感。索陽等［16］選擇BVDV的5′UTR序列附近保守核苷酸序列，BRSV的F基因的保守區(qū)及BPIV3高度保守性NP蛋白基因設(shè)計(jì)引物，建立了可用于檢測(cè)上述3種病毒的三重RT-PCR方法。該三重RT-PCR技術(shù)能檢出10 pg的BVDV、1pg的BPIV3和10 pg的BRSV。倪宏斌等［17］從新疆石河子、奎屯、庫爾勒、沙灣、阿克蘇地區(qū)的5個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)采集1月齡以內(nèi)犢牛鼻液206份，其中發(fā)病犢牛180份，相同日齡健康犢牛46份，通過采用雙抗體夾心ELISA的方法檢測(cè)BPIV3抗原，RT-PCR方法檢測(cè)BPIV3M基因，并挑選不同地區(qū)的8株病毒進(jìn)行序列分析比較其同源性，進(jìn)行基因分型。結(jié)果ELISA方法檢測(cè)的感染率僅為2.43%，PCR方法檢測(cè)的感染率為35.44%。擴(kuò)增的M基因序列同源性為97.90%，與參考的BPIV3 A亞型毒株的同源性為96.4%～99.6%，將其劃分為BPIV3 A亞型。

3.2 熒光定量RT-PCR

董秀梅等［18］基于BPIV3M基因設(shè)計(jì)引物及探針，建立了Taq Man實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，用于快速定量檢測(cè)BPIV3。

3.3 RT-LAMP

師新川等［19］依據(jù)BPIV3NP基因保守序列設(shè)計(jì)4條特異性引物，建立了RT-LAMP方法，整個(gè)反應(yīng)過程只需60min，檢測(cè)最低限達(dá)0.069 fg/μL，為普通RT-PCR靈敏度的1 000倍。在反應(yīng)體系中添加熒光染料后，可通過肉眼直接判斷有無擴(kuò)增產(chǎn)物而不需要凝膠電泳，在基層的快速檢測(cè)中具有較好的應(yīng)用前景。

3.4 液相芯片技術(shù)

Anderson等［20］用美國Luminex公司研制的液相芯片技術(shù)設(shè)計(jì)了多重檢測(cè)牛血清抗體技術(shù)，可以在一個(gè)血清樣本中同時(shí)檢測(cè)病原BVDV、IBRV、BPIV3、BRSV相應(yīng)的抗體，并與ELISA相比較，其敏感度、特異性基本一致，實(shí)現(xiàn)了一個(gè)液相反應(yīng)體系下檢測(cè)多種病原抗體的技術(shù)，該技術(shù)最高可同時(shí)檢測(cè)多達(dá)100種病原，在未來傳染病診斷技術(shù)中有很好的應(yīng)用前景。

4 小結(jié)

目前我國牛群中已經(jīng)普遍存在BPIV3的感染，嚴(yán)重危害著養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展。由于此病尚無特效治療藥物和方法，且隨著我國養(yǎng)牛業(yè)的集約化發(fā)展，不少牛舍養(yǎng)殖密度大、空氣質(zhì)量差，這些因素的存在為該病的傳播和流行提供了可能。本文所述的檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中可以根據(jù)具體情況及對(duì)檢測(cè)結(jié)果的要求來選擇合適的檢測(cè)方法，也可以將多種方法結(jié)合使用。隨著檢測(cè)方法的不斷改進(jìn)以及新技術(shù)的不斷創(chuàng)新，BPIV3的檢測(cè)方法也將日趨發(fā)展完善，相信研制更加靈敏、特異、方便、適用于基層的檢測(cè)技術(shù)指日可待，這必將為預(yù)防牛呼吸道疾病的發(fā)生具有重要意義。

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［6］ 吳海濤.牛副流感病毒3型的分離鑒定和間接ELISA方法建立及初步應(yīng)用［D］.黑龍江大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，2010.

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［9］ 呂闖.牛副流感病毒3型NP單抗制備及固相阻斷ELISA的建立和應(yīng)用［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2012.

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［17］倪宏斌，剡根強(qiáng)，張坤，等.新疆部分地區(qū)牛副流感病毒3型的檢測(cè)與基因分型［J］.畜牧與獸醫(yī)，2016，48（12）：72-75.

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［20］Anderson S，Wakeley P，Wibberley G，etal.Developmentand evaluation ofa Luminexmultiplex serologyassay todetectantibodies tobovine herpes virus 1，parainfluenza 3 virus，bovine viral diarrhoea virus，and bovine respiratory syncytial virus,with comparison to existing ELISA detection methods［J］.Journal of Immunological Methods，2011，366（1-2）：79-88.

Progress in the Detection Methodsof the Bovine Parainfluenza Virus Type 3

Zhuang Jinqiu，Mei Jianguo，Zhang Ying，etal
（Binzhou AcademyofAnimalScience&VeterinaryMedicine，Binzhou 256600，Shandong，China）

Bovine respiratory disease complex is themain causeof themorbidity andmortalityof feeding cattle in theworld,which seriously endangers the developmentof theworld's cattle industry.Bovine parainfluenza virus type 3 isoneof themajor causesof bovine respiratory disease complex,whichmainly causes pneumonia and bronchopneumonia in adultcattle and calves.This paper reviewed the latest laboratory detectionmethodsofbovine parainfluenza virus type 3 in recentyears,so as to provide reference for prevention and controlofdisease.

bovineparainfluenzavirus type3；bovine respiratory disease complex；detection；progress

S858.23

A

2095-3887（2017）04-0046-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.04.013

2017-06-01

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2015GSF121027）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系牛產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-09-12）

莊金秋（1978-），女，副研究員，碩士，主要從事細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物用病毒疫苗研制。