利用mRNA分析技術(shù)鑒別血液與精液研究*

戈文東 林 豪 黃建春 林德勝 練惠輝 李 斌

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利用mRNA分析技術(shù)鑒別血液與精液研究*

戈文東1,2林 豪3黃建春1,2林德勝1,2練惠輝1,2李 斌1,2

1.福建省公安廳物證鑒定中心 2.福建省刑事科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 3.武夷山市公安局

目的：探討鑒別血液與精液的一種新方法。方法：采集月經(jīng)血、外周血和精液樣本，試劑盒提取樣本RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，利用挑選的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)若干個(gè)特定基因mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)月經(jīng)血中可以同時(shí)檢測(cè)到HBB與MMP11基因mRNA；而在外周血中只檢測(cè)到HBB基因mRNA;在精液中可以同時(shí)檢測(cè)到TGM4、PRM2基因mRNA。結(jié)論：檢測(cè)MMP11、TGM4、PRM2基因mRNA表達(dá)可用于鑒別外周血、月經(jīng)血和精液。

mRNA分析 血液鑒別 精液鑒別

血液與精液是法醫(yī)物證檢驗(yàn)最常見(jiàn)的檢材類(lèi)型。在一些案件中，往往需要判定是不是血（或精液），是何種血（月經(jīng)血還是外周血）以明確案件性質(zhì)，給偵查指明方向。但目前一些常用的免疫學(xué)方法，比如抗人HB血斑試紙只能區(qū)分是否是人血，并不能區(qū)分月經(jīng)血與外周血，而臨床上鑒別月經(jīng)血的方法又很難用于法醫(yī)案件的檢驗(yàn)。而無(wú)精子癥患者或者結(jié)扎的男性用PSA試紙檢測(cè)往往是陰性結(jié)果，從而誤導(dǎo)了檢驗(yàn)。本文利用不同組織間RNA因生理功能差異其蛋白表達(dá)譜各不相同的理論基礎(chǔ)，對(duì)法醫(yī)物證檢驗(yàn)中常見(jiàn)的血液與精液鑒別進(jìn)行了初步研究，以期提供一個(gè)新的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1. 1 血痕樣本的采集

采集5名女志愿者指尖血和月經(jīng)血分別制備外周血斑樣本和月經(jīng)血斑樣本各5份，采集5名男志愿者指尖血和精液分別制備外周血斑樣本和精斑樣本各5份，室溫晾干。

1. 2 RNA 提取

按照 DNA/RNA共提取試劑盒 (TIANGEN公司) 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA提取操作。

1.3 RT-PCR擴(kuò)增

使用Quant One Step RT-PCR Kit(TIANGEN公司)，50μL體系進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括：10×RT-PCR Buffer 5μL，Dntp(10Mm each)2μL，5×RT-PCR enhancer 10μL，RNasin 0.5μL，Hot,master Taq polymerase 2.5μL，Quant RTase 0.5μL，Primer 6μL，RNA模板1μL，RNA-Free ddH2O 22.5μL。熱循環(huán)參數(shù)為：50℃ 30min；94℃ 2min；94℃ 30s，57℃ 1min，65℃ 1min，40個(gè)循環(huán)；65℃ 30min。

18SrRNA、GAPDH是目前較常用的管家基因，而HBB、MMP11、TGM4、PRM2是目前常用的鑒別血液與精液的特異性標(biāo)記[2-3]。關(guān)于這些標(biāo)記的研究目前較成熟，已有大量相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，引物序列、片段長(zhǎng)度較明確，故本實(shí)驗(yàn)選擇這5種標(biāo)記來(lái)進(jìn)行研究。引物序列依文獻(xiàn)[2]、[3]報(bào)道設(shè)計(jì)，由三博遠(yuǎn)志公司合成，引物序列及片段長(zhǎng)度如表1所示。

表1 引物序列及片段長(zhǎng)度

1.4 RT-PCR遺傳分析儀檢測(cè)mRNA表達(dá)

取Hi-Di甲酰胺1mL、Liz500分子量?jī)?nèi)標(biāo)20μL，充分混勻后，取10μL與PCR產(chǎn)物1μL震蕩混勻，在ABI3500XL型基因分析儀上進(jìn)行檢測(cè)。用 Gene Mapper ID-X軟件分析電泳檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在ABI3500XL遺傳分析儀上檢測(cè)，結(jié)果如圖1～圖5所示。

圖1 18SrRNA基因mRNA分型結(jié)果

圖2 GAPDH基因mRNA分型結(jié)果

圖3 外周血血斑HBB基因mRNA檢測(cè)結(jié)果

圖4 月經(jīng)血血斑HBB和MMP11基因mRNA檢測(cè)結(jié)果

圖5 精斑TGM4和PRM2基因mRNA檢測(cè)結(jié)果

3 討論

法醫(yī)物證檢驗(yàn)主要包括對(duì)生物檢材的定性分析（預(yù)試驗(yàn)、確證試驗(yàn)、種屬鑒定等）和定型分析（通過(guò)人類(lèi)多態(tài)性遺傳標(biāo)記進(jìn)行個(gè)人識(shí)別和親子鑒定）。定性分析主要解決檢材的種屬及組織來(lái)源等問(wèn)題[1-4]，這一環(huán)節(jié)是法醫(yī)物證檢驗(yàn)的重要步驟，在司法鑒定中具有重要意義。例如，在一些懷疑為性犯罪的案件中，只對(duì)檢材進(jìn)行DNA分型不足以將案件定性為性犯罪，如果能夠確定檢材中含有精液和（或）女性陰道分泌物的成分，則可為案件的定性提供強(qiáng)有力的證據(jù)。由此可見(jiàn)，對(duì)檢材組織來(lái)源的確證對(duì)于確定案件類(lèi)型，證明犯罪事實(shí)，幫助現(xiàn)場(chǎng)重建，指明偵查方向，完善司法鑒定的證據(jù)鏈，具有重要的實(shí)戰(zhàn)意義。目前法醫(yī)學(xué)中DNA分型技術(shù)發(fā)展較為成熟，而對(duì)檢材的定性分析則發(fā)展相對(duì)緩慢。

在法庭科學(xué)實(shí)踐中常見(jiàn)的體液檢材（包括血液、精液、唾液、陰道分泌物、尿液等），傳統(tǒng)的一些定性分析檢驗(yàn)技術(shù)，如利用化學(xué)方法或免疫學(xué)方法、細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法，通過(guò)預(yù)試驗(yàn)、確證試驗(yàn)、種屬檢驗(yàn)對(duì)現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)的檢材進(jìn)行確認(rèn)，往往出現(xiàn)靈敏度低、特異性差、假陰（陽(yáng)）性等情況[4]，而且，隨著犯罪分子反偵查意識(shí)的提高，現(xiàn)場(chǎng)遺留的檢材多數(shù)已遭到破壞；傳統(tǒng)檢驗(yàn)技術(shù)對(duì)檢材要求高、檢材用量大、靈敏度低，往往只給出定性的結(jié)果而沒(méi)有特定的檢出閾值，誤判率高，局限性日益凸顯。

人體不同組織的細(xì)胞含有不同種類(lèi)的基因以及不同種類(lèi)的 mRNA，并擁有特定的基因表達(dá)模式。其產(chǎn)生不同活性的生物大分子執(zhí)行不同的功能，因而每一種細(xì)胞有其特異性的基因表達(dá)。mRNA帶有DNA上得到轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)信息，檢測(cè)斑痕或組織中mRNA的種類(lèi)和峰度就能進(jìn)行組織來(lái)源的判別，這便為法醫(yī)學(xué)組織來(lái)源確證提供了新思路，可解決當(dāng)前法庭科學(xué)檢驗(yàn)的難題，為偵查訴訟提供線索和證據(jù)。關(guān)于可用于人體生物性體液鑒別的mRNA遺傳標(biāo)記已有很多文獻(xiàn)報(bào)道，但不同的遺傳標(biāo)記在不同的體液中有互相干擾的成分，比如SPTB、PBGDmRNA既可在外周血中表達(dá)，也可在月經(jīng)血中表達(dá)[1]，因此在選擇的時(shí)候，本研究舍棄了一些特異性差的標(biāo)記，挑選特異性高的遺傳標(biāo)記。18SrRNA、GAPDH是常用的管家基因，用來(lái)檢測(cè)RNA提取質(zhì)量，β-血紅素（HBB）在所有血液中均有表達(dá)，而月經(jīng)血基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP11）僅在女性月經(jīng)血中表達(dá)，故二者可以用來(lái)鑒別月經(jīng)血與外周血，前列腺轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TGM4）和脯氨酸豐富蛋白基因（PRM2）在精液中是高表達(dá)的，因此可以作為鑒別精液的參考指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)操作不是在理想的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行的，具有一定的局限性。此外，在現(xiàn)實(shí)辦案中的檢材往往是微量、腐敗、降解的，而且極易由于外界環(huán)境因素(如溫度、濕度、pH值等) 的變化而影響到既有的 RNA含量。因此，未來(lái)需要繼續(xù)探索尋找更多可靠的標(biāo)記物，以更快地用于實(shí)際辦案。

[1] 王沖,李萬(wàn)水,徐秀蘭, 等.細(xì)胞mRNA 檢測(cè)鑒別外周血和月經(jīng)血[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志,2013,28（5）:397-399.

[2] Juusola J, Ballantyne J.Multiplex mRNA profiling for the identification of body fluids[J]. Forensic Sci Int,2005,152(1): 1–12.

[3] Yan Xu, Jianhui Xie,Yu Cao,et al. Development of highly sensitive and specific mRNA multiplex system (XCYR1) for forensic human body fluids and tissues identification[J].PLoS ONE, 2014, 9(7) :e100123.

[4] 高林林,李佑英,嚴(yán)江偉,等.RNA 在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2011,27（6）:455-458.

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014J01273和2016J01343）；公安部技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2015JSYJB12）。