激光捕獲顯微切割結(jié)合低體積擴增技術(shù)研究*

李 斌 呂 政 曾憲海 戈文東

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激光捕獲顯微切割結(jié)合低體積擴增技術(shù)研究*

李 斌1呂 政2曾憲海1戈文東1

1. 福建省公安廳刑事技術(shù)總隊，福建省刑事科學(xué)技術(shù)重點實驗室 2. 福州市鼓樓區(qū)公安分局刑事技術(shù)大隊

目的：研究激光捕獲顯微切割技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用低體積擴增技術(shù)，建立一套微量混合樣本DNA的檢驗方法。方法：使用PALM系統(tǒng)切割捕獲目標(biāo)細胞，彈射到低體積擴增玻片的反應(yīng)位點上，消化細胞，提取DNA，使用Identifiler?試劑盒在1.5μL體系中進行PCR擴增。結(jié)果：分別捕獲10個口腔上皮細胞、20個精子細胞，成功獲得16個完整的STR 基因座分型譜帶。結(jié)論：激光捕獲顯微切割技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用低體積擴增技術(shù)適用于法醫(yī)學(xué)中微量混合樣本DNA檢驗。

法醫(yī)物證學(xué) 激光捕獲顯微切割 低體積擴增 STR分型

激光捕獲顯微切割（Laser capture microdissection, LCM）技術(shù)主要應(yīng)用于病理學(xué)、腫瘤學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)中，可以從復(fù)雜組織中快速準(zhǔn)確地分離均一性樣品組分[1,3]。因其可在顯微鏡直視下捕獲目標(biāo)細胞，以排除異質(zhì)性細胞的影響，為解決困擾法醫(yī)物證檢驗的難題——混合樣品DNA的檢驗分析提供新的解決方案，受到了法醫(yī)科學(xué)工作者的重視與應(yīng)用。而低體積擴增技術(shù)（如安利快得系統(tǒng)）采用顯微鏡玻片平面印刷技術(shù)，整個PCR反應(yīng)體系為1μL，半球狀的空間構(gòu)象為微量反應(yīng)提供了最佳的環(huán)境，使靈敏度大大提高[4]。本實驗將激光捕獲顯微切割和低體積擴增技術(shù)相結(jié)合，建立微量混合樣本DNA的檢驗方法，探討其在法醫(yī)DNA檢驗中應(yīng)用的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗樣本

樣本一：志愿者口腔拭子。

樣本二：實際強奸案件中的衛(wèi)生紙。

1.2 主要儀器和試劑

PALM激光顯微切割捕獲系統(tǒng)（Carl Zeiss公司，德國)，PEN1.0玻片，AG480F AmpliGrid微量反應(yīng)玻片與密封油，0.04mol/L PK溶液，0.05g/ml龍膽紫染液（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，中國），Identifiler?試劑盒（Life Technologies公司，美國），AmpliSpeed ASN400 PCR擴增儀（Olympus歐洲生命科學(xué)公司，德國），離心機，ABI 3130XL型遺傳分析儀（Life Technologies公司，美國）。

1.3 實驗方法

1.3.1制備細胞懸液

在樣本一放入加有700μL去離子水的EP管內(nèi)，震蕩洗脫5min，使拭子上的細胞充分脫落，棄去拭子。

用剪刀剪取1cm×1cm大小樣本二置于EP管內(nèi)，剪碎，加1mLTNE室溫浸泡30min，期間不斷震蕩，套管離心去除載體。

1.3.2涂片

細胞懸液13000r/min離心3min，吸取上清液，保留約30μL，加入適量的龍膽紫染液，混勻染色5min。吸取5μL，輕輕涂鋪在PEN1.0玻片上，用熱快37℃烘干10～15min。

1.3.3切割

將玻片放置在PALM激光顯微切割捕獲系統(tǒng)的載物臺上，顯微鏡下查找選擇結(jié)構(gòu)清晰、完整的單個細胞（樣本一為口腔上皮細胞，樣本二為精子細胞），用繪制工具，通過軟件依次選定標(biāo)記需要分離的目標(biāo)細胞，切割細胞。切割的激光束能量要適中，以切割后膜面在視野中稍變模糊為宜。

1.3.4收集

切割下的口腔上皮細胞彈射到加0.75μL PK溶液的AG480F AmpliGrid微量反應(yīng)玻片位點上。切割下的精子細胞彈射到加0.75μL含有PK和DTT的裂解液（0.1mg/mL PK，5mmol/L DTT）的AG480F AmpliGrid微量反應(yīng)玻片位點上。分別捕獲5、10、15、20、30個細胞，每個細胞數(shù)重復(fù)3次。

1.3.5 DNA提取

5 μL密封油密封玻片位點，靜置5min，待反應(yīng)液沉到玻片上后，口腔上皮細胞56℃消化1h，95℃變性15min；精子細胞56℃消化2h，99℃變性10min。

1.3.6擴增

加入0.75μL PCR反應(yīng)液（Identifiler?試劑盒，配比為：Mix 4μL；Primer 2μL；Golden酶1μL），置于AmpliSpeed ASN400 PCR擴增儀上擴增。擴增體系為1.5μL，擴增程序為95℃ 11min、94℃ 1min、59℃ 1min、72℃ 1min、30個循環(huán)[5]；60℃延伸1h；4℃保存。

擴增產(chǎn)物全部上樣，經(jīng)ABI 3130XL型遺傳分析儀檢測，GeneMapper ID v3.2分析檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

捕獲5、10、15、20、30個細胞，重復(fù)實驗3次，所獲圖譜峰高高于100RFU為標(biāo)準(zhǔn)，DNA檢測結(jié)果見表1。其中等位基因丟失率=等位基因丟失條帶總數(shù)/預(yù)計等位基因總條帶×3次實驗；位點丟失率=出現(xiàn)等位基因丟失的位點數(shù)/16個位點×3次實驗；完整檢出率=有效分型次數(shù)/3次實驗。經(jīng)χ2檢驗，P<0.05，不同細胞數(shù)量實驗組檢出率的差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 捕獲不同數(shù)量細胞的實驗結(jié)果（n=3）

結(jié)果顯示，對志愿者口腔上皮細胞，采用PALM激光顯微切割捕獲系統(tǒng)捕獲目標(biāo)細胞，結(jié)合低體積擴增技術(shù)，捕獲5個口腔上皮細胞，有1次擴增在D18S51基因座上雜合子13/17變成純合子13，等位基因丟失率為1.23%。捕獲10個以上的口腔上皮細胞，3次平行擴增，均穩(wěn)定獲得Identifiler?試劑盒所包含的15個STR與Amelogenin基因座的基因分型，完整檢出率為100%（見圖1、圖2）。隨著細胞數(shù)目的增多，擴增產(chǎn)物的檢驗峰值提高。

圖1 5個口腔上皮細胞的STR分型結(jié)果

圖2 10個口腔上皮細胞的STR分型結(jié)果

對于強奸案件中的衛(wèi)生紙，采用PALM激光顯微切割捕獲系統(tǒng)捕獲目標(biāo)細胞，結(jié)合低體積擴增技術(shù)，捕獲5個精子細胞，僅5～6個基因座檢測出條帶，等位基因丟失嚴重，達79.01%。捕獲10個細胞，大部分基因座出現(xiàn)等位基因丟失，且每次都在不同的基因座上出現(xiàn)等位基因丟失，無法獲得完整的STR分型圖譜，等位基因丟失率為49.85%。隨著捕獲細胞數(shù)目的增多，完整檢出率逐漸提高，而等位基因丟失率逐漸降低。捕獲15個精子細胞，2次擴增出現(xiàn)2～3個基因座等位基因丟失現(xiàn)象，雜合子變成純合子，等位基因丟失率為6.17%。捕獲20個以上的精子細胞3次平行擴增，才可獲得完整的STR分型結(jié)果圖，如圖3～圖6所示。

圖3 5個精子細胞的STR分型結(jié)果

圖4 10個精子細胞的STR分型結(jié)果

圖5 15個精子細胞的STR分型結(jié)果

圖6 20個精子細胞的STR分型結(jié)果

3 討論

微量混合樣品DNA的檢驗和分析一直是法醫(yī)物證檢驗的難題。在微量混合樣品中，有時犯罪嫌疑人的信息為被 害人的信息所掩蓋，無法獲得犯罪嫌疑人的基因型，有時得到的DNA分型結(jié)果為混合基因型，不能達到認定水平。而PALM激光顯微切割捕獲系統(tǒng)與低體積擴增技術(shù)聯(lián)合，能從微量混合樣品中收集單一種類細胞，使常規(guī)方法難以成功分型的樣本也能獲得單一樣本的STR分型結(jié)果，對案件的認定意義重大[6]。

本實驗使用的PALM激光顯微切割捕獲系統(tǒng)，其核心功能是激光彈射，激光通過高數(shù)值孔徑的物鏡集中在1μm大小的點上，在1ns內(nèi)激光脈沖釋放出的能量，將細胞切割下來。切割好的細胞彈射收集到AmpliGrid玻片，整個過程由激光完成，無接觸、無污染。AmpliGrid玻片采用平面印刷技術(shù)，表面構(gòu)建48個1μL親水性基因座，使DNA模板、反應(yīng)物錨定在特定位置上，覆蓋4～5μL封閉液體避免液體蒸發(fā)，構(gòu)成最佳的半球狀反應(yīng)空間。同時疏水性基因座使覆蓋在反應(yīng)試劑上的封閉液互相隔離，亦保證無氣溶膠、無交叉污染。再配合專門為AmpliGrid玻片設(shè)計的AmpliSpeed ASN400 PCR擴增儀進行低體積擴增，相較于常規(guī)擴增，節(jié)省了試劑，提高了樣本在擴增體系中的濃度，使得實驗的靈敏度和成功率得到提升。在本實驗中，我們僅需捕獲10個口腔上皮細胞、20個精子細胞數(shù)，就能獲得完整的STR分型圖譜，這是常規(guī)PCR擴增難以實現(xiàn)的。

特別是利用PALM激光顯微切割捕獲系統(tǒng)將精子細胞捕獲到反應(yīng)位點上，直接進行裂解擴增，省去了傳統(tǒng)差異裂解消化女性物質(zhì)的步驟，大大縮短檢驗時間，簡化了操作步驟，避免了污染和精子細胞的損失。同時，該系統(tǒng)準(zhǔn)確捕獲精子細胞，排除了女性物質(zhì)的干擾，使分型結(jié)果由混合型變成單一型，極大提高了現(xiàn)場物證的證據(jù)價值，為強奸案件中女性成分去除不干凈的混合斑提供了一個有效的解決方案。

本文實驗結(jié)果顯示，捕獲精子細胞數(shù)為20個時，才能獲得完整的STR分型圖譜，而口腔上皮細胞僅需10個就可以。亓冰通過顯微操作法，聯(lián)合安利快得系統(tǒng)，使用Identifiler?試劑盒在3個口腔上皮細胞就能獲得完整的STR分型[7]。我們認為，檢材的新鮮程度對結(jié)果有很大的影響。本實驗中，口腔上皮細胞采用的是志愿者口腔拭子，細胞新鮮，是理想狀態(tài)下的細胞。而精子細胞使用的是實際案件中的檢材，由于保存條件、保存時間、載體類型和雜質(zhì)等干擾因素的存在，在顯微鏡下看到部分細胞核破損，不完整，甚至是無細胞核的細胞，這說明樣本不新鮮，細胞已開始部分降解。其次，精子細胞是單倍體，僅含有一半的基因組信息，當(dāng)細胞數(shù)目少時，很難均衡提取到兩種單倍體的細胞，細胞數(shù)目多時，完整分型的可能性就增加[8]。

本實驗室使用的PALM激光顯微切割捕獲系統(tǒng)相較于其它需借助針尖或微細管來分離細胞的顯微分離技術(shù)相比，具有分離細胞速度快、無需精巧的操作技能的優(yōu)點[8]。但筆者在實際操作PALM激光顯微切割捕獲系統(tǒng)時，通過反復(fù)試驗，亦總結(jié)了一些小技巧，如：制備細胞懸液后加龍膽紫染色劑時，染色劑要離心，避免帶入染色劑顆粒，影響制片。制片后宜立即進行激光切割捕獲細胞，否則容易影響細胞捕獲效果。添加擴增液時使用小槍頭，擴增液在槍頭形成小液滴，然后輕觸密封油頂端，使其自行融入樣本溶液中。靜置檢查每個擴增點頂端是否被油膜重新封住，如果沒有封住，則需加少量密封油，可避免擴增過程中出現(xiàn)吹氣泡現(xiàn)象，導(dǎo)致擴增失敗。

通過以上實驗結(jié)果看出，本文構(gòu)建的激光顯微切割捕獲系統(tǒng)聯(lián)合低體積擴增的方法，將前者的精確捕獲細胞功能和后者的高靈敏度擴增特點有機結(jié)合，可解決微量混合檢材DNA檢驗問題。但在實際案件中，由于檢材載體的復(fù)雜性、保存條件的差異性，方法還需進一步摸索和完善。

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福建省自然科學(xué)基金資助項目（2014J01273）；公安部技術(shù)研究計劃項目（2015JSYJB12）。