兩種鼠血清與兩種培養(yǎng)基對PK15細胞培養(yǎng)的比較

肖兵南，高中文，李劍鋒，蔣小文

（1湖南民康生物技術研究所，湖南長沙410022；2.湖南省寧鄉(xiāng)縣畜產(chǎn)品檢測中心，湖南寧鄉(xiāng)410600）

兩種鼠血清與兩種培養(yǎng)基對PK15細胞培養(yǎng)的比較

肖兵南1，高中文1，李劍鋒2，蔣小文1

（1湖南民康生物技術研究所，湖南長沙410022；2.湖南省寧鄉(xiāng)縣畜產(chǎn)品檢測中心，湖南寧鄉(xiāng)410600）

為比較研究DMEM培養(yǎng)基和RPM I-1640培養(yǎng)基對PK15細胞的培養(yǎng)效果，選擇效果好的作為基礎培養(yǎng)基，用大鼠血清和小鼠血清分別以不同量添加進行培養(yǎng)，用細胞顯微病變（CPE）觀察法和四甲基偶氮唑鹽(MTT)測定法測定其對細胞生長的影響，為血藥試驗選擇試驗動物提供依據(jù)。結果表明：DMEM培養(yǎng)基較RPM I-1640培養(yǎng)基對PK15細胞的培養(yǎng)效果好，加5％大鼠血清或2.5％小鼠血清配制DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)，對PK15細胞的培養(yǎng)生長無副作用，即兩種血清的無毒安全濃度分別為5％和2.5％。

鼠血清；培養(yǎng)基；DMEM；RPM I-1640；PK15細胞；培養(yǎng)

用含藥血清進行體外試驗時,經(jīng)常會遇到選擇何種試驗動物的問題，原則上首先要使體外培養(yǎng)細胞在該種動物血清中生長良好、形態(tài)正常,對照組血清質量穩(wěn)定,并且血清添加量能夠比較高[1]。豬腎上皮細胞PK15，來源于豬腎，正常的細胞形態(tài)為上皮樣，貼壁生長。PK15細胞對多種病毒比較敏感，如豬圓環(huán)病毒（PCV）、豬細小病毒（PPV）、豬瘟病毒（CSFV）等，可應用于豬圓環(huán)病毒疫苗、豬細小病毒疫苗、豬瘟病毒疫苗等的制備，在科研中被廣泛使用，其優(yōu)點是它的遺傳穩(wěn)定，營養(yǎng)要求較低，可使用多種培養(yǎng)基，易培養(yǎng)、易保存[2,3]。為此，本試驗選用無血清培養(yǎng)基DMEM和RPMI-1640對PK15細胞作比較培養(yǎng)試驗，篩選出效果好的作基礎培養(yǎng)基，再添加大鼠和小鼠兩種常用試驗動物的血清，配制不同濃度的鼠血清培養(yǎng)基對PK15進行培養(yǎng)試驗，測定其對PK15細胞生長的影響，為血藥試驗選擇試驗動物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豬傳代腎細胞PK15（湖南農(nóng)大動醫(yī)院提供）；0.25％胰蛋白酶、RPMI-1640細胞培養(yǎng)基、DMEM細胞培養(yǎng)基、犢牛血清均為GIBCO公司生產(chǎn)；青霉素-鏈霉素，兩性霉素，PBS緩沖液，均為細胞培養(yǎng)用。

1.2 主要試驗儀器

10L-CO2培養(yǎng)箱（長沙市長錦科技有限公司）；倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；純水儀（艾柯試驗設備有限公司）；低速離心機（XYJ-801型，江蘇醫(yī)療儀器廠）；塑料培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、凍存管（美國COSTAR公司產(chǎn)品）；25mm濾器和0.22μm的微孔濾膜（上海興亞醫(yī)用凈化器材廠）。

1.3 試驗試劑配制方法

1.3.1 細胞生長液（培養(yǎng)液）：在DMEM/RPMI-1640培養(yǎng)液中加入10％的小牛血清和1mL雙抗，4℃保存；

1.3.2 細胞維持液（營養(yǎng)液）：在DMEM/RPMI-1640培養(yǎng)液中加入2％的小牛血清，4℃保存；

1.3.3 大鼠血清和小鼠血清：由湖南斯萊克景達試驗動物有限公司提供，56℃滅活30min，0.22μm微孔濾膜過濾滅菌分裝-20℃保存；

1.4 兩種培養(yǎng)基對PK15細胞培養(yǎng)的比較[4]

1.4.1 細胞復蘇培養(yǎng)：取細胞凍存管置37℃水浴搖動解凍，用移液槍吸入2個培養(yǎng)瓶中，加入適量DMEM細胞生長液，于37℃、5％CO2培養(yǎng)；4 h后細胞貼壁，換新的培養(yǎng)液至單層細胞形成。

1.4.2 接種與培養(yǎng)：復蘇細胞長成單層時，及時取出，在無菌條件下小心吸出舊培養(yǎng)液，用37℃預熱的PBS清洗（沖洗）后，加入適量預熱的胰蛋白酶消化液1mL消化3～5min，倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，90％細胞脫落，為消化適度。然后離心棄去胰蛋白酶液，加入DMEM細胞營養(yǎng)液10mL，用吸管輕輕吹打數(shù)十次，打散細胞，取少量均勻細胞懸液鏡下觀察，用白細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)。將細胞懸液平均分為2份，分別離心，再加入不同的培養(yǎng)液，混合均勻后接種6孔板上，每孔加入懸液1mL（細胞數(shù)量為6.2×104）。將細胞板置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。1.4.3試驗分組：試驗I組：RPMI-1640培養(yǎng)液；試驗Ⅱ組：DMEM培養(yǎng)液；每組設6個重復。

1.4.4 細胞觀察計數(shù)：觀察細胞生長情形，并分別于培養(yǎng)后10 h、15 h、20 h、25 h、30 h用胰酶消化5～7 min，加入1mL營養(yǎng)液，快速吹打分散，用白細胞計數(shù)板計數(shù)。

1.5 兩種鼠血清對PK15細胞生存影響的測定

1.5.1 血清處理：取滅活大鼠血清和小鼠血清，用維持液倍比稀釋稀釋成不同的濃度:80％、40％、20％、10％、5％、2.5％、1.25％、0.625％，置37℃預熱備用。

1.5.2 鼠血清對PK15細胞的培養(yǎng)：按1.4方法用96孔板以DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)PK15細胞約24 h至單層貼壁后，棄去上清液；從高濃度到低濃度分別加入含不同稀釋度鼠血清的DMEM培養(yǎng)液，每孔100 μL，每個濃度重復8孔，設10％犢牛血清培養(yǎng)液作對照，37℃,5％CO2培養(yǎng)48 h。

1.5.3 鼠血清對細胞生存影響的測定

（1）細胞毒性作用的測定：對含鼠血清培養(yǎng)細胞，定時于倒置顯微鏡下觀察細胞病變率（CPE）并記錄結果，以最后的記錄結果為最終結果。

（2）細胞增殖作用的測定：細胞培養(yǎng)48 h后，棄去上清液，用預熱至37℃的PBS溶液漂洗2次；每孔加入10μL的MTT（5mg/mL溶于PBS），37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入DMSO 100μL，在微量振蕩器上振蕩10min，以溶解細胞中的紫色結晶物；然后在酶標儀570 nm處測定光吸收值，計算活細胞率：活細胞率（％）=（加鼠血清孔OD值/犢牛血清對照孔OD值）×100％

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

用Exce1和Spss11.5對數(shù)據(jù)進行分析，各組數(shù)據(jù)均以x±SD表示，并用Spss11.5軟件的ANOVA進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 兩種培養(yǎng)液對PK15細胞生長的影響

培養(yǎng)結果顯示：DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)明顯優(yōu)于RPMI-1640培養(yǎng)液，細胞密度大，生長快，長勢好。統(tǒng)計分析計算二者差異顯著（P＜0.05）,結果見表1。

表1 不同培養(yǎng)基對p k-1 5生長的影響(×1 0 4)(x±s,n=6)

2.2 兩種鼠血清對PK15細胞生存的影響

2.2.1 細胞病變率（CPE）測定：PK15細胞用含不同濃度大鼠血清和小鼠血清的DMEM培養(yǎng)液分別進行培養(yǎng)(48h)，鏡檢顯示：大鼠血清和小鼠血清對PK15細胞均呈現(xiàn)一定的毒副作用，高濃度時導致細胞病變:細胞圓縮、堆積、脫落。這種病變隨著血清濃度的降低而下降，至含2.5％小鼠血清和5％大鼠血清時無CPE出現(xiàn)（見表2），由表2可見，2.5％小鼠血清和5％大鼠血清為最大的無毒濃度。

表2 不同濃度鼠血清導致的CPE情況（4 8 h）

2.2.2 細胞生長存活率測定：用MTT法測定OD值，計算細胞生長存活率（與犢牛血清比較），結果見表3：高濃度時大鼠血清對PK15細胞的副作用較小鼠血清小，同濃度血清活細胞多；低濃度時，大鼠血清5％及其以下保持細胞生長增殖，小鼠血清2.5％及其以下保持細胞生長增殖。

表3 不同濃度鼠血清作用P K 1 5細胞的生存率

3 結論與討論

3.1 DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)液對PK15細胞的比較培養(yǎng)，從細胞生長速度、細胞密度等生長情況顯示，DMEM培養(yǎng)液比RPMI-1640培養(yǎng)液更適合PK15細胞的生長，與付世新2004年的報道[5]相似。

3.2 小鼠和大鼠血清對PK15細胞的最大無毒分別為2.5％和5％。這一結果與趙秀梅等報道的用異種動物血清對培養(yǎng)人腫瘤細胞生長的影響[6]結果相似。

3.3 吳健宇等用MTT法檢測不同種屬的動物血清和人血清對3T3細胞增殖的影響，結果顯示不同種屬動物血清對細胞的毒性作用與其種屬親源有關[7]。所以，在選擇含藥血清的供體動物時，應盡量選擇與培養(yǎng)細胞親緣關系較近者。本試驗在某種意義上支持這一結論。

[1]汪鴻宇,俞仲毅,符勝光,等.血清藥理實驗中不同動物種屬血清對脾臟淋巴細胞的影響[J].中國中醫(yī)藥科技,2001,(3): 185-186.

[2]陳丹英,高云飛,李麗霞,等.PK15細胞凋亡過程中角蛋白中間纖維的變化[J].動物學報，2002，48(1)：58-63.

[3]董關木,鄭海發(fā),劉發(fā)順,等.精致Vero細胞狂犬病疫苗的臨床觀察及免疫學效果的研究[J].中華試驗和臨床病毒學雜志,2000,14（1）:356-359.

[4]于麗華，崔洪新.不同種類血清對新生大鼠大腦皮層神經(jīng)細胞培養(yǎng)的影響[J].實用醫(yī)藥雜志,2002,(3):

[5]付世新，李曉龍，王長遠，等.不同培養(yǎng)基對PK15細胞增殖影響的研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2004,(1):62-64.

[6]趙秀梅，馮文茹，胡人杰.異種動物血清對體外培養(yǎng)人腫瘤細胞生長的影響[J].中國比較醫(yī)學雜志,2010,(6):190-192.

[7]吳健宇，穆靜，李儀奎.血清藥理試驗中異種動物血清對細胞的毒性作用和滅活后的減毒作用[J].中國藥理學通報，2000,16(1):118-119.

Q253

A

1006-4907（2016）02-0044-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2016.02.021

2015-12-23