柴胡三參膠囊對(duì)缺血性心律失常大鼠心肌細(xì)胞Cx43的影響

劉建和，王建國(guó)，尹萍，楊成龍，唐銀，周正，劉錦霞

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208）

柴胡三參膠囊對(duì)缺血性心律失常大鼠心肌細(xì)胞Cx43的影響

劉建和1，王建國(guó)2，尹萍2，楊成龍1，唐銀2，周正2，劉錦霞2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208）

目的探討柴胡三參膠囊對(duì)缺血性心律失常大鼠心肌細(xì)胞間縫隙連接蛋白43（connexin 43，Cx43）表達(dá)和分布的影響，為柴胡三參膠囊的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法大鼠隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、柴胡三參膠囊（青蒿組）、柴胡三參膠囊（常山組）、胺碘酮組、穩(wěn)心顆粒組，每組各10只。相應(yīng)干預(yù)10 d后，除空白組和對(duì)照組外，其余各組采取大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支高位結(jié)扎法制作心肌缺血性心律失常模型，再用免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)Cx43蛋白在各組大鼠心肌中的表達(dá)水平及分布情況。結(jié)果柴胡三參膠囊（青蒿組）與柴胡三參膠囊（常山組）Cx43免疫組化灰度值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，柴胡三參膠囊心律失常評(píng)分降低（P＜0.05）、死亡率降低、Cx43平均灰度值增高（P＜0.05）及分布紊亂得到改善。結(jié)論柴胡三參膠囊（青蒿）與柴胡三參膠囊（常山）均能夠改善心肌缺血時(shí)Cx43的表達(dá)及分布，保護(hù)心肌，從而減少缺血性心律失常的發(fā)生，且柴胡三參膠囊（青蒿）臨床安全性更高。

柴胡三參膠囊；缺血性心律失常；縫隙連接蛋白43;常山；青蒿

缺血性心律失常（ischemic arrhythmias）是冠心病的常見(jiàn)并發(fā)癥，是臨床上缺血性心臟病常見(jiàn)的病理生理過(guò)程，發(fā)病率高，是發(fā)生心源性猝死的主要原因，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康。早期人們對(duì)抗心律失常藥物的研究主要集中在膜離子通道上，而其藥物本身又存在致心律失常的風(fēng)險(xiǎn)，且不能有效降低死亡率，致使臨床應(yīng)用受到限制。而近些年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)縫隙連接（gap junction,GJ）的電脫耦聯(lián)與缺血性心律失常密切相關(guān)，構(gòu)成GJ的縫隙連接蛋白43（Cx43）表達(dá)和分布的異常是引發(fā)缺血后及再灌后心律失常的重要機(jī)制。Cx43表達(dá)越弱，心律失常的發(fā)生率則越高[1]。本研究以目前臨床常用抗缺血性心律失常藥物穩(wěn)心顆粒和胺碘酮為陽(yáng)性對(duì)照，旨在觀察柴胡三參膠囊對(duì)缺血性心律失常大鼠心肌細(xì)胞Cx43表達(dá)和分布的影響，進(jìn)一步探討柴胡三參膠囊抗心律失常的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)Wistar大鼠70只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證編號(hào)：SCXK（湘）2012-0001，動(dòng)物合格證號(hào)（11400700061625，11400700070275）。

1.2 藥物與試劑

柴胡三參膠囊（青蒿與常山均是傳統(tǒng)的抗瘧疾中藥，都具有傳統(tǒng)的抗心律失常作[2-3]，柴胡三參膠囊原配方中含常山，后根據(jù)普通高等教育“十一五”國(guó)家級(jí)規(guī)劃教材《中藥學(xué)》第二版，常山有毒，故在原有配方不變的情況下，更改常山為青蒿，特在此實(shí)驗(yàn)中分為兩組對(duì)比觀察），由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)提供。柴胡三參膠囊（青蒿）（批號(hào)：140403）；柴胡三參膠囊（常山）（批號(hào)：140820）；穩(wěn)心顆粒（山東步長(zhǎng)制藥股份有限公司，規(guī)格：9 g/袋；胺碘酮[賽諾菲（杭州）制藥，規(guī)格：0.2 g/粒]；兔抗Cx43多克隆抗體，北京博奧森生物有限公司提供（批號(hào)：K142714C）；抗Gi蛋白抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供（批號(hào)：K142714C）。

1.3 儀器

RWD407型小動(dòng)物呼吸機(jī)（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；RM6280型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)以及圖像識(shí)別分析系統(tǒng)（成都儀器廠）；光學(xué)顯微鏡（上海瀘星光學(xué)儀器有限公司）。

1.4 分組與給藥

將大鼠隨機(jī)分為7組：空白組、假手術(shù)組、模型組、柴胡三參膠囊（青蒿組）（簡(jiǎn)稱(chēng)：柴三青蒿組）、柴胡三參膠囊（常山組）（簡(jiǎn)稱(chēng)：柴三常山組）、穩(wěn)心顆粒組、胺碘酮組，每組10只?？瞻捉M、假手術(shù)組、模型組、柴三青蒿、柴三常山組、穩(wěn)心顆粒組、胺碘酮組，分別予以生理鹽水（同等容量1 mL）、生理鹽水（同等容量1 mL）、生理鹽水（同等容量1 mL）、柴胡三參膠囊（青蒿）內(nèi)容物溶液[以70 kg成人劑量4.8 g/（kg·d）換算，大鼠劑量0.014 g/（kg·d）]、柴胡三參膠囊（常山）內(nèi)容物溶液[以70kg成人劑量4.8 g/（kg·d）換算，大鼠劑量0.014 g/（kg·d）]、穩(wěn)心顆粒溶液[以70 kg成人劑量27 g/（kg·d）換算，大鼠劑量0.077/（kg·d）]、胺碘酮溶液[以70 kg成人劑量0.6 g/（kg·d）換算，大鼠劑量0.002 g/（kg·d）]灌胃。各組均在結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支前10 d預(yù)先給藥，連續(xù)灌胃10 d。

1.5 動(dòng)物模型制備

根據(jù)文獻(xiàn)[4-6]的Wistar大鼠冠心病氣虛痰瘀模型造模方法稍作改進(jìn)。末次給藥30 min后，用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉老鼠，生物信號(hào)采集器全程記錄II導(dǎo)聯(lián)心電圖，切開(kāi)氣管，連接呼吸機(jī)。在胸骨左緣縱行切開(kāi)皮膚，依次分離組織，暴露心臟，分離心包膜，從左心耳下緣處進(jìn)針，肺動(dòng)脈旁出針，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。以II導(dǎo)聯(lián)ST段明顯抬高或T波高聳，結(jié)扎線以下心臟表面區(qū)域顏色變暗為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)扎30 min后再灌注40 min。（空白組只麻醉不開(kāi)胸不結(jié)扎，假手術(shù)組只開(kāi)胸不結(jié)扎。）

1.6 Cx43免疫組化染色與分析

灌注結(jié)束后直接摘取心臟（空白組直接開(kāi)胸摘取心臟，假手術(shù)組則直接摘取心臟，經(jīng)PBS緩沖液沖洗），選取部分左心室心肌組織，用多聚甲醛溶液固定，采取免疫組化染色SP法對(duì)取材的左心室組織進(jìn)行染色（嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作），在光學(xué)顯微鏡下觀察Cx43的表達(dá)及分布情況。每張切片隨機(jī)選5個(gè)高倍視野，以心肌胞漿中棕黃色顆粒狀及位于心肌細(xì)胞之間閏盤(pán)連接處為Cx43陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞核為淡藍(lán)色。最后采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件對(duì)上述切片在顯微鏡下的視野進(jìn)行陽(yáng)性染色的平均灰度值測(cè)定，進(jìn)而對(duì)心肌Cx43的表達(dá)進(jìn)行半定量分析。灰度值越大，Cx43表達(dá)越弱，灰度值越小，Cx43表達(dá)越強(qiáng)。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，所有數(shù)據(jù)均采用“±s”表示。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，方差不齊者換用校正t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠死亡情況

在喂養(yǎng)及手術(shù)期間，因意外原因死亡（麻醉意外、多次結(jié)扎致大出血等）大鼠剔除心電圖統(tǒng)計(jì)分析及最后數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；因惡性心律失常而死亡的大鼠進(jìn)入心電圖統(tǒng)計(jì)分析，但不進(jìn)入最后的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，因室顫死亡的缺血再灌注模型組4只，死亡率40%；柴三青蒿組2只，死亡率20%；柴三常山組2只，死亡率20%；穩(wěn)心顆粒組1只，死亡率10%；胺碘酮組4只，死亡率40%。

2.2 每組大鼠室性心律失常評(píng)分

采用Curtis和Walker（1988）心律失常評(píng)分法對(duì)心律失常嚴(yán)重程度進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)缺血再灌注期間，除假手術(shù)組因機(jī)械性心肌損傷出現(xiàn)短暫室速外，模型組及柴三青蒿組、柴三常山組均有發(fā)生多種室性心律失常。與模型組比較，柴三青蒿組、柴三常山組VP、VF發(fā)生次數(shù)及心律失常評(píng)分明顯降低（P＜0.01）（詳見(jiàn)表1）。

表1 缺血再灌注期間各組大鼠心律失常情況及評(píng)分（±s）

表1 缺血再灌注期間各組大鼠心律失常情況及評(píng)分（±s）

注：與模型組比較，##P＜0.01；與胺碘酮組比較：*P＜0.05。

組別模型組柴三青蒿組柴三常山組穩(wěn)心顆粒組胺碘酮組F值P值n68896 VP（次）29.20±5.25 4.00±1.69##* 3.11±2.03##* 2.56±2.13##15.60±3.69##4.206＜0.01 VF（次）14.5±3.03 2.63±1.60##* 2.00±1.66##* 1.22±0.97##6.80±1.93##3.257＜0.01 VT（次）41214評(píng)分（分）5.40±0.52 1.13±0.03##* 1.67±0.50##* 1.00±0.93##3.60±2.17##0.786 0.638

2.3 Cx43免疫組化染色結(jié)果及平均灰度值半定量統(tǒng)計(jì)分析

從心肌細(xì)胞的縱切面上看，空白對(duì)照組和假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊，心肌Cx43表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，著色均勻，呈明顯的棕黃色顆粒狀，大小一致，條帶狀分布，密集、規(guī)律，主要位于閏盤(pán)內(nèi)，界限清晰成線狀排列，大多數(shù)位于心肌細(xì)胞長(zhǎng)軸垂直的端-端連接處，少數(shù)位于與長(zhǎng)軸平行的側(cè)-側(cè)相接處以及胞漿內(nèi)。

在模型組中心肌缺血后心肌細(xì)胞呈區(qū)域性變性壞死，分布紊亂，心肌細(xì)胞腫脹斷裂，心肌纖維斷裂，結(jié)構(gòu)破壞，Cx43表達(dá)明顯減弱甚至消失，數(shù)量減少，殘存的Cx43界限不清，成點(diǎn)狀或彌散成片，排列散亂，著色斑點(diǎn)大小不一，分布無(wú)規(guī)律，大部分散亂分布于心肌細(xì)胞的胞漿和心肌側(cè)面，呈端-端連接處向側(cè)-側(cè)連接處轉(zhuǎn)移趨勢(shì)。

柴三青蒿組、柴三常山組、穩(wěn)心顆粒組在心肌缺血后心肌纖維較為整齊，結(jié)構(gòu)破壞較少，Cx43的表達(dá)及分布改善，大部分染色顆粒明顯，界限清晰，閏盤(pán)處表達(dá)多，心肌細(xì)胞側(cè)-側(cè)連接處表達(dá)少，分布較為規(guī)律。

胺碘酮組心肌缺血后心肌細(xì)胞呈大量細(xì)胞肥大水腫變性，心肌纖維排列紊亂，Cx43表達(dá)較模型組增多，閏盤(pán)處可見(jiàn)少量棕黃色顆粒，排列紊亂，分布不規(guī)律，心肌纖維的側(cè)-側(cè)連接處及細(xì)胞漿內(nèi)增多。見(jiàn)圖1。

通過(guò)Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件測(cè)定陽(yáng)性染色的平均灰度值進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)分析可知(如表2)：與空白組及假手術(shù)組比較，模型組、柴三青蒿組、柴三常山組、穩(wěn)心顆粒組、胺碘酮組灰度值增高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明Cx43蛋白在急性心肌缺血心律失常大鼠心肌中表達(dá)減弱。與模型組比較，柴三青蒿組、柴三常山組、穩(wěn)心顆粒組、胺碘酮組灰度值減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明藥物干預(yù)可以使Cx43蛋白表達(dá)增強(qiáng)，從而減少心律失常的發(fā)生。柴三青蒿組、柴三常山組與胺碘酮組比較，其柴胡三參膠囊兩組心肌Cx43免疫組化灰度值減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明在此實(shí)驗(yàn)中，柴胡三參膠囊（青蒿）、柴胡三參膠囊（常山）較胺碘酮能更好的保護(hù)心肌缺血/再灌注大鼠心肌Cx43的表達(dá)和分布。柴三青蒿組、柴三常山組與穩(wěn)心顆粒組比較，其三組的心肌Cx43免疫組化灰度值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。柴三青蒿組與柴三常山組比較，兩組的心肌Cx43免疫組化灰度值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 大鼠缺血區(qū)組織形態(tài)學(xué)變化顯微圖（HE×400）

表2 各組大鼠心肌Cx43灰度值比較（±s）

表2 各組大鼠心肌Cx43灰度值比較（±s）

注：與空白組及假手術(shù)組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01；與胺碘酮組比較：☆P＜0.05。

組別n心肌Cx43灰度值空白組假手術(shù)組模型組柴三青蒿組柴三常山組穩(wěn)心顆粒組胺碘酮組F值P值10 10 68896 65.33±2.79 68.10±3.43 135.06±2.97△△90.76±3.76△△▲▲☆90.67±3.46△△▲▲☆93.63±2.78△△▲▲115.25±2.65△△▲▲14.379＜0.01

3 討論

缺血性心律失常在臨床中多見(jiàn)，在中醫(yī)學(xué)屬于“心悸”、“怔忡”范疇。柴胡三參膠囊是本院根據(jù)少陽(yáng)不和且有宿根（宿痰）的中醫(yī)病機(jī)所制的治療缺血性心律失常的有效驗(yàn)方，原方主要由柴胡、法夏、黨參、丹參、苦參、黃芩、常山、甘草等藥物組成，其中柴胡為君，調(diào)暢氣機(jī)、和解少陽(yáng)之邪，黨參、丹參、黃芩、半夏為臣，以補(bǔ)氣活血以輔正，化痰、活血、清熱、燥濕以驅(qū)邪，常山截邪、定悸，甘草補(bǔ)脾益氣、調(diào)和諸藥，共為佐使，共奏和解定悸、益氣活血、清熱化痰之效。但常山有毒性，具有強(qiáng)烈的致吐作用，并可致肝、腎的病理?yè)p害，臨床用藥具有不安全性。因青蒿[7]和常山具有截瘧定悸的作用，無(wú)毒性，臨床用藥安全性大，故特意將常山更改為青蒿，且通過(guò)此實(shí)驗(yàn)表明，青蒿與常山在抗心律失常作用上效果無(wú)明顯差異，更利于臨床應(yīng)用。

前期實(shí)驗(yàn)研究[8-11]提示，柴胡三參膠囊(青蒿)可增強(qiáng)缺血性心律失常大鼠心肌細(xì)胞SERCA2a活性、減少鈣超載，抗缺血性心律失常；作用于多種離子通道使氯仿、烏頭堿和氯化鋇誘發(fā)的心律失常得到抑制；在心肌缺血再損傷模型中能降低乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）以及血清丙二醛（MDA）的含量，升高超氧化物歧化酶（SOD）的含量，提高自由基（OFR）清除劑的活力、增強(qiáng)心肌抗氧化能力、抑制心肌脂質(zhì)過(guò)氧化，從而保護(hù)缺血再灌注損傷心肌，有效減少心律失常的發(fā)生。

近年來(lái)多項(xiàng)臨床研究證實(shí)，中藥可通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑、多離子通道阻滯和非離子通道調(diào)節(jié)的整合機(jī)制，發(fā)揮調(diào)節(jié)心律失常作用[12-13]。Cx43是構(gòu)成心肌細(xì)胞間通道和縫隙連接的最基本的蛋白質(zhì)之一,能促進(jìn)心臟的正常發(fā)育，是心肌細(xì)胞電耦聯(lián)及化學(xué)偶聯(lián)的基礎(chǔ)，其數(shù)量改變可影響心肌的電傳導(dǎo)速度，其分布改變影響心肌的傳導(dǎo)各向異性[14],其構(gòu)成的離子通道在細(xì)胞通訊、心肌缺血再灌注損傷及閏盤(pán)重構(gòu)過(guò)程中起著非常重要的作用[15-16]，高表達(dá)的Cx43不僅能促進(jìn)縫隙連接的形成[17],還能有效地降低心律失常的發(fā)生機(jī)率[18]。

在本實(shí)驗(yàn)研究中，結(jié)果表明心肌缺血后Cx43發(fā)生了重構(gòu)，其數(shù)量減少、表達(dá)減弱，分布紊亂、側(cè)邊化，室性心律失常評(píng)分、大鼠死亡率也相應(yīng)的增加，中藥柴胡三參膠囊(青蒿組)與柴胡三參膠囊(常山組)中Cx43表達(dá)均較模型組明顯增強(qiáng)，大部分染色顆粒明顯，界限較為清晰，多散在分布于閏盤(pán)處，分布紊亂情況得到改善，心律失常評(píng)分及大鼠死亡率均較模型組降低。提示柴胡三參膠囊(青蒿組與常山組)均能通過(guò)調(diào)節(jié)Cx43的表達(dá)，減少其降解，有效改善Cx43的分布，穩(wěn)定細(xì)胞間的電偶聯(lián)，從而維持心肌細(xì)胞間正常電活動(dòng)（即正常的傳導(dǎo)速度及各向異性），減少缺血性心律失常的發(fā)生，降低大鼠的死亡率，且柴胡三參膠囊(青蒿組)與柴胡三參膠囊(常山組)對(duì)Cx43的表達(dá)無(wú)明顯差異，在臨床應(yīng)用柴胡三參膠囊(青蒿組)安全性更高。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effect of Chaihu Sanshen Capsule on Cx43 in Myocardial Cells of Rats with Ischemic Arrhythmias

LIU Jianhe1,WANG Jianguo2,YIN Ping2,YANG Chenglong1,TANG Yin2,ZHOU Zheng2,LIU Jinxia2
(1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;
2.Hunan Uiversity of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Chaihu Sanshen capsule on the expression and distribution of connexin 43(Cx43)of gap junction in myocardial cells of rats with ischemic arrhythmias,and provide experimental basis for clinical applicationofChaihuSanshencapsule.MethodsTheratswererandomlydividedintoblankgroup,shamoperation group,model group,Chaihu Sanshen capsule(Qinghao group),Chaihu Sanshen capsule(Changshan group),amiodarone group and Wenxin granules group,10 rats in each group.After intervention for 10 d,in addition to the blank group and the control group,the other rats were made myocardial ischemic arrhythmias model of left anterior descending coronary artery ligation.The expression and distribution of Cx43 protein miocadial cells of rats was detected by immunohistochemical S-P method.ResultsThe Cx43 gray scale of Chaihu Sanshen capsule(Qinghao group)and Chiahu Sanshen capsule(Changshan group)had no significant difference(P＞0.05).The arrhythmia score of Chaihu Sanshen capsule was lower(P＜0.05)and a decrease in mortality,CX43 average gray value increased(P＜0.05)and distribution disorder to improve.Conclusion Chaihu Sanahen capsule(Qinghao)and Chaihu Sanahen capsule(Changshan)both can improve the expression and distribution of Cx43 in myocardial ischemia cell,protect cardiac muscle and to reduce the incidence of ischemic arrhythmias,and Chaihu Sanshen capsule(Qinghao)shows higher clinical safety.

Chaihu Sanshen capsule;ischemic arrhythmias;Connexin 43;Changshan;Qinghao

R285.5；R541.7

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2016.12.004

2016-05-06

湖南省科技廳科研項(xiàng)目（2013SK3103）；湖南省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)課題（201303）；湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金計(jì)劃項(xiàng)目（2014XNFZ03）；湖南省科技創(chuàng)新項(xiàng)目投資計(jì)劃（[2014]658）；2015年湖南省學(xué)位與研究生教育教改研究課題（JG2015B071）。

劉建和，男，醫(yī)學(xué)博士，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治心血管疾病，E-mail:ljh+cm1@163.com。