補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)去勢(shì)腦缺血雌性大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖及ERK/CREB信號(hào)通路的影響

黃昕，周勝?gòu)?qiáng)，劉勝賢，張必超，薛科輝，劉柏炎，*

（1.益陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院，湖南益陽(yáng)413000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208）

補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)去勢(shì)腦缺血雌性大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖及ERK/CREB信號(hào)通路的影響

黃昕1，周勝?gòu)?qiáng)2，劉勝賢1，張必超1，薛科輝1，劉柏炎1，2*

（1.益陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院，湖南益陽(yáng)413000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208）

目的探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)去勢(shì)腦缺血雌性大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells,NSCs）增殖及ERK/CREB信號(hào)通路的影響。方法采用雙側(cè)卵巢切除術(shù)(OVX)結(jié)合大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO)法復(fù)制去勢(shì)雌性大鼠腦缺血復(fù)合模型，將造模后的36只大鼠隨機(jī)分為雙假手術(shù)組、復(fù)合模型組、雌激素組、雌激素+G15組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組及補(bǔ)陽(yáng)還五湯+G15組6組，每組6只，術(shù)后24 h給予相應(yīng)藥物灌胃連續(xù)干預(yù)14 d，同時(shí)每天腹腔注射BrdU、G15分別標(biāo)記增殖細(xì)胞和阻斷GPER-1。采用免疫熒光BrdU/Nestin雙標(biāo)法檢測(cè)各組大鼠缺血側(cè)海馬齒狀回NSCs增殖情況，免疫組化SP法檢測(cè)ERK1/2、CREB1磷酸化蛋白表達(dá)水平。結(jié)果補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和雌激素組缺血側(cè)海馬DG區(qū)BrdU/Nestin雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞及pERK1/2、pCREB1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均增加，與復(fù)合模型組比較有顯著性差異(P＜0.05），但補(bǔ)陽(yáng)還五湯組要多于雌激素組(P＜0.05)。與補(bǔ)陽(yáng)還五湯組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯+G15組缺血側(cè)海馬DG區(qū)BrdU/Nestin雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞及及pERK1/2、pCREB1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均減少（P＜0.05）。結(jié)論補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以促進(jìn)去勢(shì)腦缺血雌性大鼠缺血側(cè)海馬DG區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，激活ERK/CREB信號(hào)通路，可能是其發(fā)揮類(lèi)雌激素作用、促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生作用機(jī)制之一。

腦缺血；神經(jīng)干細(xì)胞；ERK/CREB信號(hào)通路；去勢(shì)大鼠；補(bǔ)陽(yáng)還五湯

缺血性腦卒中是一種發(fā)病率、致死率和致殘率均極高的腦血管疾病，雖然目前診治技術(shù)不斷提高，但尚無(wú)有效治療手段[1]。神經(jīng)流行病學(xué)研究結(jié)果表明，絕經(jīng)前期婦女缺血性卒中的發(fā)病率及其嚴(yán)重程度遠(yuǎn)低于相應(yīng)年齡段的男性，而絕經(jīng)期后女性卒中發(fā)病率明顯增高并且預(yù)后較差，女性絕經(jīng)期后雌激素水平的下降與心腦血管病的發(fā)生有密切關(guān)系，故有學(xué)者提出雌激素在腦缺血中起著十分重要的作用[2]。

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular-signa1regulated kinase,ERK)/cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP responsive element binding protein,CREB）信號(hào)通路是所有真核細(xì)胞內(nèi)將細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核引起增殖、分化等作用的共同信號(hào)途徑[3]。越來(lái)越多的證據(jù)支持，除經(jīng)典核內(nèi)雌激素受體介導(dǎo)雌二醇（estrogen-2,E2）直接發(fā)揮基因效應(yīng)外，該通路在神經(jīng)系統(tǒng)中核外雌激素受體（estrogen receptor,ER）[如G蛋白偶聯(lián)受體30(G protein-coupled receptor 30, GPR30)/G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1（G protein-coupled estrogen receptor 1,GPER-1)]介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)再生等生物學(xué)效應(yīng)中發(fā)揮重要作用[4]。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯是治療缺血性腦卒中后遺癥的經(jīng)典方，有較好的臨床療效。但其是如何促進(jìn)缺血后神經(jīng)再生，恢復(fù)受損的神經(jīng)功能，作用機(jī)制目前尚不完全清楚[5]。

課題組前期研究證實(shí)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠減少腦缺血大鼠腦梗死體積、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，上調(diào)血清E2、腦組織E2及ER水平，具有類(lèi)雌激素作用[6]。因此，本研究擬以雌性去勢(shì)腦缺血復(fù)合模型大鼠為研究對(duì)象，旨在深入探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)缺血海馬內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells,NSCs）增殖及ERK/CREB信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠45只，♀，體質(zhì)量（220±20）g，月齡2～3月，購(gòu)自湖南斯菜克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2009-0004；合格證號(hào)：004535。室溫控制在（24±0.5）℃，自由飲食進(jìn)水，晝夜光照節(jié)律，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物

補(bǔ)陽(yáng)還五湯（《醫(yī)林改錯(cuò)》）：黃芪120 g，歸尾6 g，赤芍4.5 g，桃仁3 g，紅花3 g，地龍3 g，川芎3 g，飲片購(gòu)自湖南益陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院，煎藥濃縮成生藥濃度為2.6 g/mL；戊酸雌二醇片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，1 mg/粒），研磨細(xì)粉后加入蒸餾水制成濃度為100 μg/mL的混懸液；GPER-1特異性阻斷劑G15 (Chemicon公司)：用DMSO和生理鹽水稀釋成50 μg/mL的溶液（DMSO的終濃度為1 mmol/L）；BrdU（Sigma公司）：用DMSO和生理鹽水稀釋成20 mg/mL的溶液（DMSO的終濃度為1 mmol/L）的溶液。上述3種藥物配制好后均于4℃冰箱避光冷藏備用。

1.3 主要試劑及儀器

通用型SP免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：K156919F）；Rabbit Antiphospho-ERK1(Thr202/Tyr204)+ERK2(Thr183/ Tyr185)antibody（北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；Rabbit Anti-phospho-CREB-1Rabbit Anti-phospho-CREB-1(Ser133)antibody（北京博奧森生物技術(shù)有限公司)大鼠抗BrdU單克隆抗體（Abcam公司）；兔抗Nestin單克隆抗體(Abcam公司)；Goat Anti-Rabbit IgG-FITC（Santa Cruz Biotech公司）；Texas Red-conjugated AffiniPure GoatAnti-Rat IgG+IgM（H+L）（Jackson公司）；進(jìn)口羊血清工作液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：WP150926)；2、3、5一氯化三苯四氮哇(2,3,5-chloride Triphenyltin tetrazolylazo,TTC)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140825)；DAB染色液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：K152317J）；DAPI染色液（武漢博士德生物工程有限公司）；大鼠雌二醇ELISA試劑盒（上海勁馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，批號(hào)：Wk30608）。硅膠包被線(xiàn)栓（規(guī)格：L3200，廣州佳靈生物技術(shù)有限公司）；生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（湖北孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)公司，型號(hào)：ZT-12M）；石蠟包埋機(jī)（德國(guó)LEICA儀器公司，型號(hào)：EG1150H）；石蠟切片機(jī)（德國(guó)LEICA儀器公司，型號(hào)：RM2235）；攤片機(jī)（德國(guó)LEICA儀器公司，型號(hào)：HI1220）；倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號(hào)：BX43）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)HERMLE公司，型號(hào)：Z32HK）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystems公司，型號(hào)：MK-3）。

1.4 復(fù)合模型的制備及評(píng)價(jià)

采用雙側(cè)卵巢切除術(shù)(ovariectomy,OVX)制備雌激素缺乏去勢(shì)模型大鼠，在此基礎(chǔ)上采用大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)法復(fù)制局灶性腦缺血模型，制成去勢(shì)雌性局灶性腦缺血大鼠復(fù)合模型。

參照Z(yǔ)eynalov等[7]采用OVX術(shù)復(fù)制去勢(shì)雌性大鼠模型。10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉后，腹位固定，腋下2 cm處剪毛備皮，75%酒精消毒，依次剪開(kāi)皮膚、肌層及腹膜，用鑷子深入切口處拽出卵巢切除，手術(shù)縫線(xiàn)結(jié)扎止血(假手術(shù)組的大鼠不摘除卵巢，僅在卵巢與輸卵管連接處夾一下)，縫合切口。如法摘除另一側(cè)的卵巢。從第五天開(kāi)始隨機(jī)選取6只大鼠斷尾取血，隔天1次，ELISA法檢測(cè)血清E2水平，含量低于5.0 pg/mL則確定為去勢(shì)造模成功。15 d后將去勢(shì)組所有動(dòng)物再行MCAO術(shù)。

參照Longa等[8]MCAO法進(jìn)行改良復(fù)制局灶性腦缺血大鼠模型。10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉后，將大鼠固定于手術(shù)操作臺(tái)上，取頸部正中切口，游離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈。結(jié)扎頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈。于頸總動(dòng)脈分叉部下方0.2-0.3 cm處剪一小口，將直徑為0.32 mm的線(xiàn)栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈，插入深度由分叉部計(jì)為約(18.0± 0.5)mm,固定線(xiàn)栓，依次關(guān)閉切口(假手術(shù)組僅切開(kāi)皮膚、分離右側(cè)頸總動(dòng)脈后即縫合)。動(dòng)物于清醒后2 h參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，分值在1～3分者入組，死亡等原因剔除的動(dòng)物予以隨機(jī)替補(bǔ)。

1.5 分組與給藥

將30只復(fù)合造模成功的雌性大鼠隨機(jī)分為5組，每組6只:復(fù)合模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、雌激素組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯+G15組、雌激素+G15組。雙假手術(shù)組6只。總共6組。

術(shù)后24 h各組給予相對(duì)應(yīng)的藥物干預(yù)：補(bǔ)陽(yáng)還五湯組及補(bǔ)陽(yáng)還五湯+G15組給予劑量為12.8 g/（kg·d）補(bǔ)陽(yáng)還五湯灌胃，1.0 mL/只，每日1次；雌激素組及雌激素+G15組給予500 μg/（kg·d）戊酸雌二醇灌胃（70 kg成人臨床等效劑量），1.0 mL/只,每日1次;復(fù)合模型組及雙假手術(shù)組動(dòng)物均給予等體積蒸餾水灌胃。連續(xù)給藥14 d。所有組大鼠術(shù)后第一天起按100 mg/（kg·d）劑量腹腔注射Brdu[9]，1.0 mL/（只·d），連續(xù)注射14 d，標(biāo)記增殖細(xì)胞。補(bǔ)陽(yáng)還五湯+G15及雌激素+G15組按50 μg/（kg·d）劑量腹腔注射GPER-1特異性阻斷劑G15[10]，1.0 mL/（只·d），連續(xù)14 d。雙假手術(shù)組、復(fù)合模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、雌激素組每日均補(bǔ)足等量的載體液（生理鹽水與1 mmol/L的DMSO）腹腔注射。

1.6 血清雌二醇ELISA檢測(cè)

血清雌二醇水平采用ELISA法檢測(cè)，具體過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程操作。

1.7 取材

各組大鼠在灌胃后第14天，末次灌胃及腹腔注射后4 h，各組大鼠用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，打開(kāi)胸腔并暴露心臟，用注射用針頭經(jīng)心尖插入至主動(dòng)脈端并固定好，剪開(kāi)右心耳同時(shí)夾閉腹主動(dòng)脈，用生理鹽水約100 mL通過(guò)注射器快速滴入，待心臟無(wú)血污流出及前爪、肺部顏色也變白后，改用4%多聚甲醛約100 mL灌注，速度先快后慢，固定好后開(kāi)顱取腦，去除小腦、嗅球和腦干只保留大腦組織，置于4%多聚甲醛中固定，4℃冰箱保存用于免疫組化及免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)。

1.8 指標(biāo)檢測(cè)

1.8.1 免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)缺血側(cè)海馬DG區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖情況常規(guī)組織脫水、透明、浸蠟、包埋、4 μm連續(xù)冠狀切片，65℃烤片2 h后常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸鹽高溫高壓修復(fù)10 min，2 mol/L的HCl 37.0℃孵育30 min，0.1 mol/L硼酸漂洗10 min，5%羊血清封閉內(nèi)滴加100 μL正常山羊血清室溫封閉30 min，甩去不洗，同時(shí)加入大鼠抗BrdU單克隆抗體（1∶100）、兔抗Nestin單克隆抗體(1∶100)各50 μL，4℃冰箱孵育過(guò)夜，室溫復(fù)溫30 min，PBS洗5 min×3次，滴加Goat Anti-Rabbit IgG-FITC（1∶100）和Texas Red-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rat IgG+IgM（H+L）（1∶100）熒光標(biāo)記二抗各50 μL，室溫避光孵育1 h，PBS洗5 min×3次，滴加DAPI染色液50 μL，室溫避光孵育10 min，PBS洗5 min×3次，20 μL甘油封片，熒光顯微鏡下觀(guān)察。同時(shí)用PBS代替一抗作空白對(duì)照以檢查免疫反應(yīng)的特異性。每只動(dòng)物隨機(jī)取5張切片，每張切片高倍鏡視野(×400)觀(guān)察左側(cè)海馬齒狀回(dentate gyrus, DG)，用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算單位面積陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均值作為該組神經(jīng)干細(xì)胞增殖水平。

1.8.2 免疫組化法檢測(cè)大鼠缺血側(cè)海馬DG區(qū)pERK1/2、pCREB1蛋白的表達(dá)嚴(yán)格按照通用型SP試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程操作。每只動(dòng)物隨機(jī)取5張切片，每張切片高倍鏡視野(×400)觀(guān)察左側(cè)海馬DG區(qū)，用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算單位面積陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均值作為該組pERK1/2、pCREB1蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件及Graph Pad Prism 5作圖軟件進(jìn)行處理分析。計(jì)量資料用“±s”表示，組間比較，用單因素方差分析（One-way ANOVA）。分析前，先進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，滿(mǎn)足條件者用方差分析，方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者，再進(jìn)行兩兩比較，兩兩比較方差齊者用SNIP法，方差不齊者用Tambane's T2法。當(dāng)資料不符合正態(tài)分布時(shí)，采用多個(gè)獨(dú)立樣本比較的秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合模型判斷

OVX術(shù)后，ELISA結(jié)果見(jiàn)去勢(shì)組大鼠血清雌二醇水平隨著時(shí)間的推移不斷降低，術(shù)后第1天至術(shù)后第9天由（64.5±3）pg/mL下降至（4.1±0.5）pg/mL，小于5.0 pg/mL；假手術(shù)組大鼠血清雌二醇在（63.5±4）pg/mL范圍內(nèi)波動(dòng)。說(shuō)明去勢(shì)造模成功（見(jiàn)圖1）。且45只大鼠MCAO術(shù)后24 h，4只死亡，5只無(wú)明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，36只均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損，評(píng)分在1～3分之間，故納入研究。說(shuō)明有36只大鼠去勢(shì)局灶性腦缺血復(fù)合模型造模成功。

圖1 OVX術(shù)后假手術(shù)與去勢(shì)組大鼠血清雌二醇隨時(shí)間變化情況（n=6，±s）

2.2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠缺血側(cè)海馬DG區(qū)NSCs增殖的影響

各組大鼠缺血側(cè)海馬DG區(qū)免疫熒光結(jié)果顯示：胞核呈紅色熒光者為BrdU陽(yáng)性細(xì)胞（增殖細(xì)胞），胞漿呈綠色熒光者為Nestin陽(yáng)性細(xì)胞（NSCs），胞核呈藍(lán)色熒光者為細(xì)胞核，Merge后呈枯黃色者為BrdU和Nestin雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞（即增殖的NSCs）（見(jiàn)圖2）。雙假手術(shù)組海馬DG區(qū)BrdU、Nestin陽(yáng)性細(xì)胞少量分布，表達(dá)較弱，無(wú)雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞；復(fù)合模型組可見(jiàn)少量雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和雌激素組模型組雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞均增加，與復(fù)合模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）（圖2C、D），而補(bǔ)陽(yáng)還五湯組要多于雌激素組(P＜0.05)。與雌激素組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組分別比較，雌激素+G15組雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞、補(bǔ)陽(yáng)還五湯+ G15組雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞均減少（P＜0.05）（見(jiàn)圖2、表1）。

圖2 各組大鼠缺血側(cè)海馬DG區(qū)NSCs增殖情況[免疫熒光BrdU(紅)/Nestin（綠）雙標(biāo)，×400]

表1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠缺血側(cè)海馬DG區(qū)NSCs增殖的影響（n=6，±s,個(gè)/mm2）

表1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠缺血側(cè)海馬DG區(qū)NSCs增殖的影響（n=6，±s,個(gè)/mm2）

注：與復(fù)合模型組比較，*P＜0.05；與雌激素組比較，▲P＜0.05；與補(bǔ)陽(yáng)還五湯組比較，△P＜0.05。

組別雙假手術(shù)組復(fù)合模型組雌激素組補(bǔ)陽(yáng)還五湯組雌激素+G15組補(bǔ)陽(yáng)還五湯+G15組F值BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)3.62±0.91 6.93±1.83 14.82±4.21 25.21±4.60 7.89±1.43 14.32±2.54 -Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)2.96±0.51 5.12±1.51 15.41±3.16 26.76±4.87 8.54±1.26 15.57±2.31 -雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)2.50±0.21 4.36±0.62 11.62±2.78* 23.53±3.28*▲6.80±1.31▲13.34±1.76△32.16

2.3 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠缺血側(cè)海馬DG區(qū)pERK1/ 2、pCREB1蛋白表達(dá)的影響

各組大鼠缺血側(cè)海馬DG區(qū)免疫組化結(jié)果顯示：pERK1/2表達(dá)主要位于細(xì)胞漿，pCREB 1表達(dá)主要位于細(xì)胞核，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色或棕褐色（見(jiàn)圖3）；雙假手術(shù)組右側(cè)海馬DG區(qū)可見(jiàn)pERK1/2、pCREB 1一定量表達(dá)；復(fù)合模型組pERK1/2、pCREB 1表達(dá)稍增加。與復(fù)合模型組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和雌激素組pERK1/2、pCREB 1陽(yáng)性細(xì)胞均增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），但補(bǔ)陽(yáng)還五湯組要多于雌激素組(P＜0.05)。與雌激素組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組分別比較，雌激素+ G15組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯+G15組pERK1/2、pCREB1陽(yáng)性細(xì)胞均減少（P＜0.05）（見(jiàn)圖3、表2）。

圖3 各組大鼠缺血側(cè)海馬DG區(qū)pERK1/2、pCREB1蛋白表達(dá)水平光鏡圖（免疫組化SP法，×400）

表2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠缺血側(cè)海馬DG區(qū)pERK1/2、pCREB 1蛋白表達(dá)的影響（n=6，±s,個(gè)/mm2）

表2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠缺血側(cè)海馬DG區(qū)pERK1/2、pCREB 1蛋白表達(dá)的影響（n=6，±s,個(gè)/mm2）

注：與復(fù)合模型組比較，*P＜0.05；與雌激素組比較，▲P＜0.05；與補(bǔ)陽(yáng)還五湯組比較，△P＜0.05。

組別雙假手術(shù)組復(fù)合模型組雌激素組補(bǔ)陽(yáng)還五湯組雌激素+G15組補(bǔ)陽(yáng)還五湯+G15組F值pERK1/2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)224.31±13.42 243.42±23.76 463.90±45.82* 571.97±47.93*▲276.19±21.68▲284.29±27.96△65.40 pCREB 1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)187.36±12.89 198.32±14.90 248.92±15.76* 289.46±29.13*▲212.14±16.80▲233.52±21.91△52.21

3 討論

OVX術(shù)可以有效消除雌性動(dòng)物體內(nèi)雌激素對(duì)外源性雌激素及其類(lèi)似物對(duì)其干預(yù)效應(yīng)的影響；MCAO法是目前國(guó)際公認(rèn)的模擬人類(lèi)缺血性腦卒中的經(jīng)典局灶性腦缺血造模方法。本實(shí)驗(yàn)在雌性大鼠成功去勢(shì)的基礎(chǔ)上采用改良的Longa線(xiàn)栓法造模，發(fā)現(xiàn)缺血后2 h大鼠均有不同程度的神經(jīng)功能缺損，變異小，模型穩(wěn)定可靠。OVX術(shù)結(jié)合MCAO法成功復(fù)制了去勢(shì)雌性大鼠局灶性腦缺血復(fù)合模型。

既往研究表明在缺血腦組織中，雌激素具有神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和促神經(jīng)再生作用，應(yīng)用雌激素替代治療可使腦梗死體積明顯縮小，組織病理?yè)p害的嚴(yán)重程度亦明顯減輕，分子機(jī)制主要與激活核受體ERα與ERβ誘導(dǎo)的慢速基因組效應(yīng)相關(guān)[11]。新近研究發(fā)現(xiàn)一種新型膜性雌激素受體GPR30/GPER-1，同時(shí)參與介導(dǎo)了雌激素快速非基因組效應(yīng)及基因組效應(yīng)。GPER-1與雌激素結(jié)合后被激活，活化與其相偶聯(lián)的G蛋白，使Gαβγ異三聚體解離成Gα和Gβγ，快速激活細(xì)胞內(nèi)的第二信號(hào)系統(tǒng)包括ERK1/ 2/CREB1的激活、鈣離子動(dòng)員等，并間接調(diào)節(jié)一系列相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，從而影響細(xì)胞的增殖、分化、存活及凋亡[12]。Jover-Mengual等[13]報(bào)道ERK1/2、CREB1在腦缺血損傷大鼠雌激素神經(jīng)保護(hù)作用中扮演關(guān)鍵角色。本研究發(fā)現(xiàn)去勢(shì)腦缺血雌性大鼠灌服雌二醇后，ERK/CREB通路亦被激活，且右側(cè)海馬DG區(qū)NSCs增殖增加。

目前，尚沒(méi)有足夠的證據(jù)表明中風(fēng)病人能夠從雌激素替代治療中獲益，此外，長(zhǎng)期使用雌激素替代治療會(huì)增加老年中風(fēng)高危患者乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等疾病的風(fēng)險(xiǎn)，因此，植物類(lèi)雌激素逐漸引起了眾多學(xué)者的關(guān)注。植物雌激素與哺乳動(dòng)物雌激素具有相似的分子結(jié)構(gòu)，能夠通過(guò)結(jié)合并激活雌激素受體而發(fā)揮弱雌激素樣神經(jīng)保護(hù)作用，而不良反應(yīng)少見(jiàn)[14]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯是治療中風(fēng)后遺癥的經(jīng)典名方，臨床療效較肯定，但其促神經(jīng)功能恢復(fù)的機(jī)理尚未完全明確[5]。課題組前期研究證實(shí)該方能促進(jìn)缺血腦內(nèi)NSCs增殖，提高海馬新生神經(jīng)元數(shù)量，增加去勢(shì)腦缺血大鼠雌二醇水平和雌二醇受體的表達(dá)，減少腦梗死體積，具有類(lèi)雌激素作用[6,15]。本研究結(jié)果表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠促進(jìn)去勢(shì)腦缺血雌性大鼠右側(cè)海馬DG區(qū)NSCs增殖及pERK1/2、pCREB1的表達(dá)，且效果優(yōu)于戊酸雌二醇，同時(shí)能被GPER-1的特異性阻斷劑G15部分逆轉(zhuǎn)，進(jìn)一步說(shuō)明本方具有類(lèi)雌激素作用，而通過(guò)調(diào)控ERK/CREB通路活性是其作用的分子機(jī)制。

綜上所述，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以促進(jìn)去勢(shì)腦缺血雌性大鼠缺血側(cè)海馬DG區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，具有類(lèi)雌激素作用；通過(guò)上調(diào)缺血側(cè)海馬DG區(qū)ERK1/2、CREB1的磷酸化水平,激活ERK/CREB信號(hào)通路，可能是其發(fā)揮類(lèi)雌激素作用、促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生、修復(fù)受損的神經(jīng)功能的作用機(jī)制之一。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Buyang Huanwu Decoction on Neural Stem Cells Proliferation and ERK/CREB Signaling Pathway in Hippocampus after Cerebral Ischemia in Ovariectomized Female Rats

HUANG Xin1,ZHOU Shengqiang2,LIU Shengxian1,ZHANG Bichao1,XUE Kehui1,LIU Baiyan1，2*
(1.Yiyang Medical College,Yiyang,Hunan 413000，China;2.Hunan University of Chinese Medicine, Changsha,Hunan 410208，China)

ObjectiveTo investigate the effects of Buyang Huanwu Decoction on neural stem cells(NSCs)proliferation and ERK/CREB signaling pathway in hippocampus after cerebral ischemia in ovariectomized female rats.Methods The ovariectomized female rats with cerebral ischemia model was established by the methods of ovariectomy（OVX）and middle cerebral artery occlusion(MCAO).The 36 rats were randomly divided into 6 groups,double sham-operation group,compound model group,estrogen group,estrogen+G15 group and Buyang Huanwu Decoction group and Buyang Huanwu Decoc tion+G15 group,6 rats in each group.The rats were given corresponding medicine intragastric administration for 14 days from 24 hours after operation,at the same time,BrdU and G15 were intraperitoneal injected to label the proliferation cells and block GPER-1 in each day,respectively.The NSCs proliferation of ischemic hippocampal dentate gyrus in rats was detected using immunofluorescence BrdU/nestin double staining with paraffin sections,the SP method of immunohistochemistry was used to detect the expression levelofERK1/2,CREB1phosphorylationprotein.ResultsComparedwiththecomposite model group,the number of double positive cells and pERK1/2,pCREB1 positive cells in ischemic hippocampal DG area of Buyang Huanwu Decoction group and estrogen group were increased(P＜0.05),but the indicators in Buyang Huanwu decoction group were higher than estrogen group(P＜0.05).Compared with Buyang Huanwu Decoction group,the numberof double positive cells and pERK1/2,pCREB1 positive cells in ischemic hippocampal DG area of Buyang Huanwu Decoction+G15 group were decreased(P＜0.05).ConclusionBuyang Huanwu Decoction can promote ischemic hippocampal NSCs proliferation in ovariectomized female rats after cerebral ischemia,and to activate ERK/CREB signaling pathway,which may be one of the mechanism of its estrogen-like effect and endogenous neurogenesis.

cerebral ischemia;neural stem cells;ERK/CREB signaling pathway;OVX rats;Buyang Huanwu Decoction

R285.5

A

2016-05-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81273989）；湖南省教育廳一般項(xiàng)目（14C1131）；湖南省科技廳一般項(xiàng)目（S2014F1023）；益陽(yáng)市科技廳一般項(xiàng)目（YK1541）。

黃昕，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：心腦血管疾病研究。

*劉柏炎，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，Email:liubaiyan@126.com。