CRISPR基因魔剪助力HIV／AIDS治愈

李 云，周佳義，張錦鵬，姜東伯，楊 琨（第四軍醫(yī)大學：基礎(chǔ)部免疫學教研室，學員旅，陜西西安7003）

CRISPR基因魔剪助力HIV／AIDS治愈

李 云1，2，周佳義1，2，張錦鵬1，2，姜東伯1，楊 琨1
（第四軍醫(yī)大學：1基礎(chǔ)部免疫學教研室，2學員旅，陜西西安710032）

抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（ART）通過高效抑制艾滋（AIDS）患者體內(nèi)Ⅰ型免疫缺陷病毒（HIV?1）的復(fù)制，獲得了顯著的臨床效果，但由于潛伏在患者體內(nèi)病毒庫的存在，艾滋病仍然是不治之癥．近年來，基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速，以鋅指核酸酶（ZFNs）技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（TALENs）技術(shù)和sgRNA（single guide RNA）引導的CRISPR／Cas9技術(shù)最為引人注目．利用這些基因手術(shù)刀，可以從多個途徑預(yù)防病毒對體內(nèi)正常細胞的感染，抑制或阻止其在體內(nèi)的復(fù)制，例如對能被病毒感染的CD4＋T細胞的兩種輔受體CCR5和CXCR4基因進行突變，或者將整合到被感染的人體細胞中的前病毒DNA切除．其中CRISPR／Cas9技術(shù)以其強大的基因編輯和調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活關(guān)閉的潛能，加之操作的易行和通用等特點，成為當前治療艾滋病的最具前景的基因編輯技術(shù)．

ART；基因編輯技術(shù)；CRISPR／Cas9；人類免疫缺陷病毒

0 引言

Ⅰ型免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus type 1，HIV?1）感染仍是當前世界公共衛(wèi)生的主要難題之一．針對該病毒的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（anti?retrovirus therapy，ART）提出至今已有20年，有效控制了疾病的發(fā)展和蔓延．但是單一依靠該療法不能完全清除患者體內(nèi)潛伏的病毒庫，患者停藥將面臨復(fù)發(fā)的危險，因此需要終生服藥，同時承受精神和經(jīng)濟的雙重壓力．而現(xiàn)今，基因編輯技術(shù)迅速發(fā)展并日趨成熟，從ZFNs，TALENs到CRISPR／Cas9，經(jīng)歷三代技術(shù)變革，其中CRISPR／Cas9尤為突出，因其極強大的可操作性，成為當下最熱門的基因編輯工具．因此運用基因編輯技術(shù)在分子水平上實現(xiàn)對HIV?1的治療，是當前研究的一個熱點．目前，已有研究者利用基因編輯技術(shù)實現(xiàn)了對HIV?1輔受體CCR5和CXCR4基因的突變，切除HIV?1整合到宿主細胞中的病毒基因片段，或利用失去剪切活性的dCas9激活或關(guān)閉HIV?1基因的轉(zhuǎn)錄．

1 三代基因編輯技術(shù)

1．1 鋅指核酸酶技術(shù)鋅指核酸酶（zinc?finger nucleases，ZFNs）由具有DNA識別功能的鋅指蛋白（zinc?finger proteins，ZFP）和非特異性核酸內(nèi)切酶（FokⅠ）構(gòu)成，其中每個鋅指蛋白識別一個特異的三聯(lián)體堿基，將多個鋅指蛋白串聯(lián)起來可以識別一段特定的堿基序列．串聯(lián)起來的鋅指蛋白與執(zhí)行剪切功能的FokⅠ結(jié)合后可致定位靶點產(chǎn)生DNA雙鏈的斷裂（double?strand breaks，DSBs），然后啟動DNA損傷修復(fù)機制，產(chǎn)生插入或刪除突變（Indels）．

Tebas等［1］選擇了依靠抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物控制病情的12位艾滋病患者，收集他們的外周血在體外培養(yǎng)其T淋巴細胞，并用ZFN突變細胞中的CCR5基因，之后將經(jīng)過修飾的細胞回輸患者體內(nèi)．其中6位患者暫停了抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法，他們的HIV水平反彈比通常情況慢，表明這一嘗試雖還不能永久性治療HIV，但是可以在病程上起到緩解作用．

鋅指核酸酶技術(shù)有廣泛的應(yīng)用性和發(fā)展?jié)摿Γ源嬖趦r格昂貴、耗時長、具有細胞毒性和一定的脫靶效應(yīng)等限制．

1．2 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶技術(shù)轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（transcription activator?like effector nucleases，TALENs）由兩個TALEN蛋白組成，每個TALEN蛋白包含一個非特異性的FokⅠ內(nèi)切酶域和一個可定制的DNA結(jié)合域．兩個TALEN蛋白分別靶定在DNA兩條鏈的結(jié)合位點上，F(xiàn)okⅠ二聚體對中間的spacer區(qū)域進行切割，產(chǎn)生DSBs并啟動DNA損傷修復(fù)機制．

對于HIV?1的感染，TALENs和ZFNs破壞CCR5基因的效力都能高達45%，但TALENs則引起更少的細胞毒性和脫靶效應(yīng)［2－3］．在誘導多功能干細胞研究中，TALENs對CCR5Δ32單個等位基因的打靶效力可以達到100%，其中雙等位基因打靶達到14%［4］．

在過去的4～5年里，TALENs由于其簡單的設(shè)計，高度的切割效率，近于無限的打靶范圍，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于酵母、哺乳動物和植物中，但是TALENs仍存在脫靶效應(yīng)，而且用慢病毒載體轉(zhuǎn)運TALENs比較容易導致基因組的重排，因此在臨床上的應(yīng)用還需要更加優(yōu)化的策略［5］．

1．3 RNA引導的CRISPR／Cas9技術(shù)CRISPR系統(tǒng)由 crRNA（CRISPR?derived RNA）和 tracrRNA（trans?activating RNA）堿基互補配對組成的tracrRNA／crRNA復(fù)合物與Cas9蛋白構(gòu)成，tracrRNA／crRNA復(fù)合物引導Cas9蛋白在前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer?adjacent motif，PAM）上游處對 crRNA結(jié)合的特定DNA序列進行切割，產(chǎn)生DSBs并啟動DNA損傷修復(fù)機制，其中PAM序列一般為NGG或NAG（N代表任意核苷酸）．而將兩種RNA進行改造連接，設(shè)計成簡化的sgRNA（single guide RNA）后，其與野生型RNA具有類似的活力，且更加方便實用．

與ZFNs和TALENs相似，Cas9技術(shù)也具備改造CCR5基因的能力．在誘導多功能干細胞（induced pluripotent stem cells，IPSCs）的研究中，用CRISPR／Cas9技術(shù)對CCR5Δ32轉(zhuǎn)基因的雙等位基因進行打靶，效率高達33%，優(yōu)于TALENs的14%［4］．

CRISPR／Cas9系統(tǒng)因其價格低廉、操作簡便、具有較高的打靶效率和較低的細胞毒性而得到廣泛應(yīng)用．但是由于Cas9蛋白序列較大，將其用腺相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)運至人體內(nèi)一直存在問題，近期的研究顯示將該分子不同亞基分別導入，在體內(nèi)組裝成為完整的Cas9蛋白已被證明是有效的方法［6－7］．運用CRISPR突變HIV?1輔受體和破壞其病毒庫是目前在基因水平上治療HIV?1／AIDS的主要策略．

2 使用CRISPR／Cas9系統(tǒng)編輯CCR5和CXCR4基因

HIV?1進入人體細胞需要結(jié)合細胞表面的CD4受體和CCR5或CXCR4兩種趨化因子輔受體中的至少一種．其中，CCR5是HIV?1進入細胞的主要輔受體．“柏林病人”在接受純合CCR5Δ32突變捐獻者的異源造血干細胞移植后，艾滋病得以完全治愈［8－9］．而之后運用該方法對其他患者進行的治療嘗試卻不盡如人意［10－11］．有報告顯示，在接受ART的患者中，46%同時感染CCR5和CXCR4分別依賴的兩種HIV毒株，4%僅感染CXCR4依賴的毒株，單純CCR5依賴型感染占大多數(shù)，但值得注意的是CCR5依賴型病毒可以進化為 CXCR4依賴型［12］．因此，利用CRISPR／Cas9技術(shù)在造血干／祖細胞（hematopoietic stem or progenitor cells，HSPCs）或IPSCs中將兩種受體基因同時突變，或許是一種HIV完全治愈的可行方案．

免疫系統(tǒng)中的巨噬細胞，樹突狀細胞和記憶T細胞中均有CCR5基因的表達，該受體在炎癥應(yīng)答中具有將細胞引導至炎癥區(qū)域并增強適應(yīng)性免疫應(yīng)答的作用［13］．CCR5Δ32突變可以保護相應(yīng)的人群免于AIDS等疾病的困擾，但也會在病原感染后的炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生一些不利影響［14］，如CCR5Δ32突變將使機體對黃病毒的免疫力較正常人群低［15］．但總體上，不同研究發(fā)現(xiàn)，CCR5Δ32基因突變?nèi)后w可能已經(jīng)存在了700～2250年［16］，并分布廣泛［13］，可見CCR5功能缺失并沒有對個體產(chǎn)生嚴重的不利影響．

CXCR4是SDF?1（CXCL12）的特異性α?趨化因子受體，參與淋巴細胞的趨化．SDF?1在造血干細胞中有重要作用，與CXCR4之間的信號接觸可調(diào)節(jié)B細胞CD20的表達［17］．另外，研究證明，泛素也是CXCR4的配體，其抗炎作用通過CXCR4介導的信號通路實現(xiàn)［18］．當然，CXCR4的其它功能也不能忽視，在正常小腸黏膜中的CD4＋T淋巴細胞、嗜堿性粒細胞、樹突狀細胞、小膠質(zhì)細胞、NK細胞等都有CXCR4的表達［19］，可見CXCR4缺陷的HSPCs或IPSCs分化建立的免疫系統(tǒng)將是不健全的．因此全身系統(tǒng)性地突變CXCR4會對人體產(chǎn)生不利影響，而部分改造可以作為折中策略：在體外利用CRISPR／Cas9將患者HSPCs或IPSCs中的CCR5和CXCR4基因定點突變，并誘導其分化為T細胞和單核細胞的祖細胞（如祖T細胞和祖單核細胞），將其回輸入患者體內(nèi)后，其中祖T細胞通過淋巴細胞歸巢，能夠增殖并分化為免疫系統(tǒng)所需的CD4＋T細胞，祖單核細胞則增殖分化為單核／巨噬細胞．而CD4?的其他細胞亞群依然由沒有經(jīng)過突變的HSPCs分化而來，CCR5和CXCR4基因依然保留為野生型，因此重構(gòu)的免疫系統(tǒng)中CCR5和CXCR4功能基本正常．此外，CXCR4的功能抑或能在其他通路得到補償，如SDF?1也可以靶定CXCR7受體發(fā)揮作用［20］．

Ye等［4］在野生型 IPSCs中，體外用 CRISPR／Cas9技術(shù)對CCR5Δ32的雙等位基因進行打靶，效率高達33%，之后他們將這些修飾過的IPSCs分化成單核／巨噬細胞，并驗證了它們對HIV?1感染的抵抗性．Kang等［21］用單靶向型sgRNA引導的CPISPR／Cas9編輯IPSCs的CCR5基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：12．5%的細胞內(nèi)CCR5被編輯，其中有22．2%是雙等位基因．而使用雙靶向的sgRNAs則有效地提高編輯CCR5的效率至27%，雙等位基因被編輯的效率占其中的41%．鑒于Cas9編碼序列較大，有研究者首次使用腺病毒載體來運載CRISPR／Cas9組合物，能夠有效地感染原代CD4＋T淋巴細胞，并破壞其CCR5基因的表達［22］．

另有研究者用慢病毒包裝的CRISPR／Cas9工具系統(tǒng)將CXCR4功能進行缺失突變，再分別導入到Ghost?CXCR4細胞、Jurkat細胞和原代人類CD4＋T細胞中，實現(xiàn)感染細胞中CXCR4雙等位基因的失活，從而使細胞對 HIV?1的感染產(chǎn)生抵抗［12］．然而，在CD4＋T細胞中，使用一般的CRISPR／Cas9技術(shù)僅能失活1%～5%目標蛋白質(zhì)的表達．Schumann等［23］將sgRNA與Cas9蛋白結(jié)合成Cas9核糖核蛋白（Cas9 RNPs），并在體外用電穿孔法將其導入人類CD4＋T細胞中，可致高達40%的細胞失去CXCR4的高水平表達．

干細胞擁有自我更新并分化成多種多樣特化細胞的能力．自體移植經(jīng)過基因修飾的HSPCs或IPSCs能夠提供針對HIV?1的一種功能性治療方案．目前對于IPSCs，可以有效維持其體外特定的分化狀態(tài)，而在HSPCs中導入CRISPR／Cas9系統(tǒng)后，其分化狀態(tài)如何還有待進一步研究．另外CRISPR系統(tǒng)對兩種細胞是否具有特異性也需要進行對比，才能進一步確定使用哪種細胞更加行之有效．通過電穿孔法將CRISPR／Cas9系統(tǒng)體外導入相關(guān)靶細胞是一種有效的方法，若需使用病毒載體進行體內(nèi)轉(zhuǎn)染，由于慢病毒載體可能導致基因的重排，腺病毒載體有較強的免疫原性，而腺相關(guān)病毒（adenovirus associated virus，AAV）載體已被批準使用，并且SaCas9的編碼序列較小，所以可將SaCas9與AAV進行組合，或許是可行的．

3 使用CRISPR／Cas9系統(tǒng)破壞HIV?1病毒庫

HIV可以將自身基因整合到患者體細胞的基因組中，這些細胞被稱為HIV病毒儲存庫，它們產(chǎn)生極低水平的病毒蛋白，因此可以同時避免細胞病理效應(yīng)和宿主免疫清除．中斷ART或給予病毒庫刺激，能激活儲存庫而表達病毒相關(guān)蛋白從而大量擴增病毒，使HIV不能徹底治愈．利用 CRISPR／Cas9技術(shù)針對HIV?1病毒庫進行治療的方法包括：①實現(xiàn)對整合到宿主細胞中的前病毒基因的切除；②限制病毒復(fù)制；③將病毒儲存庫細胞喚醒后殺死．

3．1 運用CRISPR切除HIV?1基因組Hu等［24］運用Cas9／sgRNA在體外有效地編輯了HIV?1 LTR U3區(qū)域的高度特異性靶位，并在潛伏被感染的小膠質(zhì)細胞，單核／巨噬細胞和T細胞中成功阻止了病毒基因的復(fù)制和表達．Cas9／sgRNAs對宿主細胞既沒有產(chǎn)生基因毒性也沒有產(chǎn)生脫靶編輯，并完全切除了整合前病毒DNA的從LTRs 5’端到3’端的一處9709?bp片段．另外，當病毒基因整合到宿主基因組的不同區(qū)域時，在被感染的細胞中使用多種sgRNA能夠?qū)⒍嗵幉《净蚪M切除．

Zhu等［25］測試了在HIV?1 DNA中能被CRISPR／Cas9打靶的10個位點，測序結(jié)果顯示，靶定Rev第二個外顯子靶位（被稱為T10）的CRISPR／Cas9，能夠有效突變HIV?1 DNA中的所有靶位，顯示出較高的突變水平．

另外有研究者發(fā)現(xiàn)，在體外導入靶向于HIV?1的CRISPR／Cas9系統(tǒng)后，人類IPSC細胞仍能有效分化為可以被HIV?1感染的細胞類型，如單核／巨噬細胞，說明該CRISPR／Cas9系統(tǒng)沒有明顯的細胞毒性，并且分化后的細胞也被證實能夠獲得對HIV?1感染的抵抗性［26］．

運用該方法對HIV?1患者自身骨髓造血干細胞進行基因改造后回輸入體內(nèi)或許是行之有效的臨床治療方案．在這項策略中使用有剪切活性的Cas9蛋白容易對與靶向基因同源或相似的序列進行切割，產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，甚至細胞毒性，因此在臨床治療中選擇恰當?shù)?sgRNA極為重要．上述研究中所選用的sgRNA及其Cas9蛋白對細胞沒有產(chǎn)生明顯的毒性，可以提供參考．

3．2 運用CRISPR限制HIV?1基因復(fù)制雖然哺乳動物的限制因子能限制HIV?1和其他病毒的復(fù)制，但它們通常在相關(guān)靶向細胞中不表達．因此，通過使用合成的轉(zhuǎn)錄因子誘導限制因子表達可能是抑制病毒復(fù)制的一種潛在途徑．通過失活Cas9的催化活性位點得到?jīng)]有剪切活性的dCas9，它可以募集轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域到特定的啟動子區(qū)域來激活轉(zhuǎn)錄，表達限制因子．而且最近Konermann等［27］用可以選擇性結(jié)合MS2噬菌體外殼蛋白的兩個極小的發(fā)卡結(jié)構(gòu)取代sgRNA的兩個末端頸環(huán)結(jié)構(gòu)，利用這一機制使sgRNA招募多個轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，從而增強轉(zhuǎn)錄的效力．

Bogerd等［28］使用構(gòu)建的SAM（synergistic activa?tion mediators）誘導了兩種限制因子 APOBEC3G（A3G）和APOBEC3B（A3B）的表達．當他們使用單個sgRNA時，只觀察到A3G和A3B中等程度的表達激活，當使用兩種sgRNA時，二者則呈現(xiàn)高水平表達．盡管A3G或A3B蛋白都能阻斷Vif缺陷型HIV?1的復(fù)制，但由于A3G會被HIV?1的Vif蛋白降解，所以只有A3B蛋白能夠抑制野生型HIV?1．這些研究表明，利用sgRNA／Cas9招募轉(zhuǎn)錄激活因子這種方法，可以對影響病毒復(fù)制的內(nèi)源性基因進行篩選．由于目前沒有有效的辦法將構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)有效遞送至已被感染的潛伏T細胞，而且限制因子不一定能完全抑制病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，因此它在臨床上的應(yīng)用還有待觀望．

3．3 運用CRISPR激活病毒庫細胞并將其清除通過再激活休眠的病毒，在ART和免疫清除的作用下，清除潛伏的病毒庫，這種策略被稱之為“喚醒并殺死（shock and kill）”［29］．

Saayman等［30］通過將dCas9和VP64轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域整合在一起，利用構(gòu)建成的 dCas9?VP64／sgRNAs系統(tǒng)靶向激活HIV?1前病毒LTR區(qū)的啟動子，并在病毒基因的增強子中發(fā)現(xiàn)“hotspot”區(qū)域，通過靶向此區(qū)域，能夠在被感染的T細胞中高度有效增強病毒基因的轉(zhuǎn)錄活化．

Limsirichai等［31］證明dCas9和潛伏期反轉(zhuǎn)化合物（latency?reversing compounds）的組合能夠促進潛伏HIV?1的轉(zhuǎn)錄，并且使用以CRISPR為基礎(chǔ)的乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因表觀修飾也能促進病毒基因激活．他們評估了 dCas9?VP64和 SAM（synergistic activation mediator）系統(tǒng)引導基因激活的能力，并發(fā)現(xiàn)后者激活轉(zhuǎn)錄的水平要比前者高．而且當SAM結(jié)合潛伏反轉(zhuǎn)復(fù)合物如組蛋白去乙酰酶抑制劑和酪氨酸激酶抑制劑時，能協(xié)同增加潛伏HIV的激活．另外，使用以CRISPR／Cas9為基礎(chǔ)的乙酰轉(zhuǎn)移酶（dCas9?p300）進行基因表觀修飾能顯著再激活潛伏的HIV．同時，有研究者利用dCas9?SAM系統(tǒng)在HIV?1潛伏的TZM?bI上皮細胞、Jurkat T細胞和CHME5小膠質(zhì)細胞中激活HIV?1前病毒基因表達，并發(fā)現(xiàn)在后兩者的細胞中由于病毒蛋白毒性的積累，導致了細胞的自殺［32］．

由于在HIV患者體內(nèi)T細胞被大量殺傷，依賴機體自身免疫系統(tǒng)清除被重新激活的潛伏病毒庫細胞并不現(xiàn)實．而通過病毒蛋白積累導致的細胞自殺或者結(jié)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法，或許是在臨床上應(yīng)用該方法的正確途徑．但是由于目前很難在體外建成可以代表體內(nèi)潛伏病毒庫的細胞模型［30］，加上向潛伏細胞中傳遞基因的效率較低［32］等，運用CRISPR并聯(lián)合ART在臨床上應(yīng)用這種“shock and kill”策略還存在許多限制．

4 結(jié)語

縱觀幾十年艾滋病的臨床治療，依靠單一的臨床干預(yù)難以將其徹底治愈已是不爭的現(xiàn)實．CRISPR／Cas9技術(shù)因其在經(jīng)濟效益和操作便捷等方面明顯的優(yōu)勢而受到廣泛關(guān)注，從該方法提出至今區(qū)區(qū)三年時間，已在基因水平治療艾滋病方面提供了多條思路，顯示出良好的應(yīng)用前景．通過有剪切活性的Cas9蛋白可以實現(xiàn)對HIV?1感染人體細胞相關(guān)輔受體的編輯從而阻止感染，并對整合到宿主細胞中的前病毒基因進行切除，而失去剪切活性的dCas9可以引導病毒儲存庫細胞前病毒的激活，再結(jié)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法將其消滅，還可以引導宿主細胞限制因子的表達，從而抑制病毒基因的復(fù)制．綜上所述，類似于現(xiàn)有的雞尾酒療法，可與CRISPR／Cas9引領(lǐng)的基因編輯策略進行組合，從而形成徹底治愈HIV?1的一套方案．然而，Cas9對PAM序列的依賴性使其不能靶向任意基因，sgRNA與DNA的不完全匹配以及目標基因與其它基因的同源性對脫靶率也存在影響，這些在一定程度上限制了Cas9的廣泛使用．近期國人在基因編輯技術(shù)方面的研究取得了突出成績，韓春雨等［33］報道的結(jié)合單鏈guide DNA（gDNA）的核酸內(nèi)切酶NgAgo（Natronobacterium gregoryi Argonaute）沒有PAM序列的限制，并且gDNA與靶向DNA之間互補配對的容錯率較低，應(yīng)用于HIV?1的基因治療，在理論上能夠減少細胞毒性，并且能夠任意靶向病毒庫細胞中HIV?1基因并實現(xiàn)剪切，雖然該技術(shù)目前受到了質(zhì)疑，但是仍然有團隊利用其實現(xiàn)了基因的表達敲降［34］．另外南京大學周國華教授的團隊報道了結(jié)構(gòu)引導的核酸內(nèi)切酶技術(shù)，并證明其有刪除大片段DNA的潛力［35－36］，因此在切除整合在宿主細胞中的HIV?1基因時，可以保證HIV?1基因的功能完全喪失．基因編輯技術(shù)迅猛發(fā)展，在助力HIV／AIDS的治愈上將發(fā)揮更加強大的作用，希望在不久的將來可以實現(xiàn)在臨床上對HIV?1的徹底治愈．

［1］Tebas P，Stein D，Tang WW，et al．Gene editing of CCR5 in autolo?gous CD4 T cells of persons infected with HIV［J］．N Engl J Med，2014，370（10）：901－910．

［2］Mussolino C，Alzubi J，F(xiàn)ine EJ，et al．TALENs facilitate targeted genome editing in human cells with high specificity and low cytotox?icity［J］．Nucleic Acids Res，2014，42（10）：6762－6773．

［3］Mussolino C，Morbitzer R，Lütge F，et al．A novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity in combination with low toxicity［J］．Nucleic Acids Res，2011，39（21）：9283－9293．

［4］Ye L，Wang J，Beyer AI，et al．Seamless modification of wild?type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111（26）：9591－9596．

［5］Hockemeyer D，Wang H，Kiani S，et al．Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases［J］．Nat Biotechnol，2011，29（8）：731－734．

［6］Zetsche B，Volz SE，Zhang F．A split?Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation［J］．Nat Biotechnol，2015，33（2）：139－142．

［7］Ma D，Peng S，Xie Z．Integration and exchange of split dCas9 domains for transcriptional controls in mammalian cells［J］．Nat Commun，2016，7：13056．

［8］Hütter G，Nowak D，Mossner M，et al．Long?Term Control of HIV by CCR5 Delta32／Delta32 Stem?Cell Transplantation［J］．New Eng?land Journal of Medicine，2009，360（7）：692－698．

［9］Yukl SA，Boritz E，Busch M，et al．Challenges in detecting HIV persistence during potentially curative interventions：a study of the Berlin patient［J］．PLoS Pathog，2013，9（5）：e1003347．

［10］Kordelas L，Verheyen J，Beelen DW，et al．Shift of HIV Tropism in Stem?Cell Transplantation with CCR5 Delta32 Mutation［J］．New England Journal of Medicine，2014，371（9）：880－882．

［11］Hutter G，Bodor J，Ledger S，et al．CCR5 Targeted Cell Therapy for HIV and Prevention of Viral Escape［J］．Viruses，2015，7（8）：4186－4203．

［12］Hou P，Chen S，Wang S，et al．Genome editing of CXCR4 by CRISPR／cas9 confers cells resistant to HIV?1 infection［J］．Sci Rep，2015，5：15577．

［13］Barmania F， Pepper MS．C?C chemokine receptor type five（CCR5）：An emerging target for the control of HIV infection［J］．Applied＆Translational Genomics，2013，2：3－16．

［14］Klein RS．A moving target：the multiple roles of CCR5 in infectious diseases［J］．J Infect Dis，2008，197（2）：183－186．

［15］Kindberg E，Mickiene A，Ax C，et al．A deletion in the chemokine receptor 5（CCR5）gene is associated with tickborne encephalitis［J］．J Infect Dis，2008，197（2）：266－269．

［16］Libert F，Cochaux P，Beckman G，et al．The deltaccr5 mutation conferring protection against HIV?1 in Caucasian populations has a single and recent origin in Northeastern Europe［J］．Hum Mol Genet，1998，7（3）：399－406．

［17］Pavlasova G，Borsky M，Seda V，et al．，Ibrutinib inhibits CD20 upregulation on CLL B cells mediated by the CXCR4／SDF?1 axis［J］．Blood，2016，128（12）：1609－1613．

［18］Saini V，Marchese A，Majetschak M．CXC chemokine receptor 4 is a cell surface receptor for extracellular ubiquitin［J］．J Biol Chem，2010，285（20）：15566－15576．

［19］Israel F．Charo，Rebecca Hills，Richard Horuk，Kouji Matsushima， Philip M．Murphy，Joost J．Oppenheim．Chemokine receptors：CXCR4．Last modified on 09／05／2016．Accessed on 16／10／2016．IUPHAR／BPS Guide to PHARMACOLOGY．http：／／www．guidetop?harmacology．org／GRAC／ObjectDisplayForward？objectId＝71．

［20］Cruz?Orengo L，Holman DW，Dorsey D，et al．CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity［J］．J Exp Med，2011，208（2）：327－339．

［21］Kang H，Minder P，Park MA，et al．CCR5 Disruption in Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR／Cas9 Provides Selective Resistance of Immune Cells to CCR5?tropic HIV?1 Virus［J］．Mol Ther Nucleic Acids，2015，4：e268．

［22］Li C，Guan X，Du T，et al．Inhibition of HIV?1 infection of primary CD4＋T?cells by gene editing of CCR5 using adenovirus?delivered CRISPR／Cas9［J］．J Gen Virol，2015，96（8）：2381－2393．

［23］Schumann K，Lin S，Boyer E，et al．Generation of knock?in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2015，112（33）：10437－10442．

［24］Hu W，Kaminski R，Yang F，et al．RNA?directed gene editing specifically eradicates latent and prevents new HIV?1 infection［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111（31）：11461－11466．

［25］Zhu W，Lei R，Le Duff Y，et al．The CRISPR／Cas9 system inacti?vates latent HIV?1 proviral DNA［J］．Retrovirology，2015，12：22．

［26］Liao HK，Gu Y，Diaz A，et al．Use of the CRISPR／Cas9 system as an intracellular defense against HIV?1 infection in human cells［J］．Nat Commun，2015，6：6413．

［27］Konermann S，Brigham MD，Trevino AE，et al．Genome?scale tran?scriptional activation by an engineered CRISPR?Cas9 complex［J］．Nature，2015，517（7536）：583－588．

［28］Bogerd HP，Kornepati AV，Marshall JB，et al．Specific induction of endogenous viral restriction factors using CRISPR／Cas?derived tran?scriptional activators［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2015，112（52）：E7249－E7256．

［29］Archin NM，Margolis DM．Emerging strategies to deplete the HIV reservoir［J］．Curr Opin Infect Dis，2014，27（1）：29－35．

［30］Saayman SM，Lazar DC，Scott TA，et al．Potent and Targeted Activation of Latent HIV?1 Using the CRISPR／dCas9 Activator Complex［J］．Mol Ther，2016，24（3）：488－498．

［31］Limsirichai P，Gaj T，Schaffer DV．CRISPR?mediated activation of latent HIV?1 expression［J］．Mol Ther，2016，24（3）：499－507．

［32］Zhang Y，Yin C，Zhang T，et al．CRISPR／gRNA?directed synergistic activation mediator（SAM）induces specific，persistent and robust reactivation of the HIV?1 latent reservoirs［J］．Sci Rep，2015，5：16277．

［33］Gao F，Shen XZ，Jiang F，et al．DNA?guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute［J］．Nat Biotechnol，2016，34（7）：768－773．

［34］Qi J，Dong Z，Shi y，et al．NgAgo?based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish［J］．Cell Res，2016，26（12）：1349－1352．

［35］Xu S，Cao S，Zou B，et al．An alternative novel tool for DNA editing without target sequence limitation：the structure?guided nuclease［J］．Genome Biol，2016，17（1）：186．

［36］Varshney GK，Burgess SM．DNA?guided genome editing using struc?ture?guided endonucleases［J］．Genome Biol，2016，17（1）：187．

Magic scissors CRISPR and HIV／AIDS cure pursue

LI Yun1，2，ZHOU Jia?Yi1，2，ZHANG Jin?Peng1，2，JIANG Dong?Bo1，YANG Kun1
The Fourth Military Medical University：1Teaching and research office of Immunology， Based Department；2Student brigade，Xi’an 710032，China

anti?retrovirus therapy has achieved obvious clinical efficiency by suppressing the replication of HIV?1 in the patients with acquired immunodeficiency syndrome， AIDS．However，AIDS still remains incurable because of latent virus reservoirs in patients infected．In recent years，with the rapid development of genome editing technologies，the ZFNs（zinc?finger nucleases）and TALENs（transcription activator?like effector nucleases）and CRISPR／Cas9 guided by single guide RNA have been utilized to edit the gene of HIV?1 co?receptors，such as CCR5 and CXCR4 in CD4＋T cells，or to excise the provirus genes which integrate into the genome of somatic cells infected，aiming to prevent the normal cells from HIV?1 or to restrict the replication of the virus in human body．At present，CRISPR／Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats／CRISPR?associated nuclease 9） has been shedding new light on HIV?1 cure pursuing，due to its pow?erful potential in genomic editing and transcription regulation in common with feasible manipulation．

ART；genome editing technologies；CRISPR／Cas9；human immunodeficiency virus

R512．91

A

2095?6894（2017）02?60?05

2016－11－18；接受日期：2016－12－05

國家自然科學基金面上項目（81171977）

李 云．E?mail：387783851＠qq．com

楊 琨．教授．E?mail：yangkunkun＠fmmu．edu．cn姜東伯．E?mail：superjames1991＠foxmail．com