Y染色體微缺失對(duì)ICSI結(jié)局的影響研究進(jìn)展

劉 琳趙小東溫 臻任麗臻王藝嶸成玥美綜述 張學(xué)紅審校

1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)?？漆t(yī)院（蘭州 730000）；2.甘肅省生殖醫(yī)學(xué)與胚胎重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.蘭州大學(xué)

Y染色體微缺失對(duì)ICSI結(jié)局的影響研究進(jìn)展

劉 琳1,2趙小東1,2溫 臻3任麗臻3王藝嶸3成玥美3綜述 張學(xué)紅1,2審校

1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)?？漆t(yī)院（蘭州 730000）；2.甘肅省生殖醫(yī)學(xué)與胚胎重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.蘭州大學(xué)

全世界不育夫婦約占已婚育齡夫婦的10%～15%，其中因男性因素導(dǎo)致的約占50%，少精子、弱精子癥是造成男性不育或生育力下降的主要原因之一。細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域的快速發(fā)展使得無精子因子（azoospermia factor, AZF）[1]被科學(xué)家們廣泛認(rèn)知并接受。AZF位于 Y染色體長臂（Yq），這一區(qū)域的異常與大多數(shù)原發(fā)性無精子癥密切相關(guān)[2]，其發(fā)生率在男性不育的遺傳因素中居第二位，僅次于Klinefelter's syndrome [克氏綜合征，(47, XXY)]。約有10%～20%男性原發(fā)無精子與少精子癥患者中存在AZF微缺失。

卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)（Intracytoplasmic sperm injection, ICSI）的出現(xiàn)，改寫了以前人們普遍認(rèn)為的無精子癥患者和嚴(yán)重少精子癥患者無法生育的觀念，但此項(xiàng)新技術(shù)的出現(xiàn)，也不可避免的將攜帶染色體異常、基因缺失或突變的精子注入到卵胞漿內(nèi)，使得各種遺傳缺陷傳遞給下一代的風(fēng)險(xiǎn)大大增加。由于 ICSI 操作逃避了一些自然選擇屏障，Y染色體微缺失或染色體異?；颊叩暮蟠鷮⒚媾R遺傳缺陷垂直傳遞的風(fēng)險(xiǎn)。因此，深入研究Y染色體微缺失在ICSI過程中的重要作用對(duì)輔助生殖技術(shù)的發(fā)展具有重要意義。本文對(duì)現(xiàn)有的關(guān)于Y染色體微缺失對(duì)ICSI成功率影響的各種研究作一綜述。

一、AZF的構(gòu)成

1996年Vogt等[1]將AZF基因劃分為 3個(gè)無重疊部分，分別命名Yq11的近段、中段和遠(yuǎn)段為AZFa、AZFb和AZFc。有大量的回文序列存在于Y 染色體上，其內(nèi)部的非等位基因同源重組是Y染色體微缺失的主要原因。1999年，Kent- First 等研究者發(fā)現(xiàn)在AZFb和AZFc之間存在一個(gè)AZFd區(qū)[3]，缺失率大約為5%，占AZF總?cè)笔У?9.6%。一般認(rèn)為，該區(qū)的缺失存在于中等程度的少精子或數(shù)目正常但形態(tài)異常精子的患者中，但該區(qū)域內(nèi)的候選成分至今尚未找到，該區(qū)是否存在仍有爭議。

二、Y染色體微缺失的發(fā)生類型

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Y染色體微缺失類型主要包括：AZFa區(qū)缺失、AZFa區(qū)部分缺失，AZFb區(qū)缺失、AZFb區(qū)部分缺失，AZFc區(qū)缺失、AZFc區(qū)部分缺失以及其他區(qū)域的聯(lián)合缺失如AZFb+c區(qū)缺失和AZFa+b+c區(qū)缺失等[4]。AZFb區(qū)及AZFc區(qū)由擴(kuò)增子家族blue (b)、turquoise (t)、green (g)、red (r)、yellow (y)、gray(g)組成，多為順向重復(fù)和反向重復(fù)序列，減數(shù)分裂過程中擴(kuò)增子發(fā)生同源重組是AZFb區(qū)、AZFc區(qū)及AZFb+c區(qū)域聯(lián)合缺失發(fā)生的分子基礎(chǔ)[5]。

現(xiàn)有的研究表明，Y染色體微缺失發(fā)生的原因主要有以下3種：（1）de novo 缺失：是指患者缺失而患者男性直系親屬外周血分析中未見缺失。這種缺失類型可能發(fā)生在父代精子生成的過程中或在子代早期胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生[1,6,7]；（2）垂直遺傳：是指父代睪丸生殖細(xì)胞系存在缺失并產(chǎn)生有缺失的精子，缺失精子與卵子結(jié)合產(chǎn)生繼承了其父親生殖細(xì)胞中有缺失的Y染色體微缺失的子代個(gè)體[8,9]；（3）在睪丸生殖細(xì)胞系中存在缺失的嵌合體，如父親外周血淋巴細(xì)胞中未見缺失，而通過ICSI的男性后代卻有Y染色體微缺失，則說明嵌合體的存在[10]。

三、Y染色體微缺失的檢測(cè)

對(duì)無精子癥或者嚴(yán)重少精子癥患者來說，Y染色體微缺失是常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。 2004年歐洲男科學(xué)會(huì)（EAA）和歐洲分子遺傳實(shí)驗(yàn)質(zhì)控網(wǎng)（EMQN）提出了Y染色體微缺失檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，即采用聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)分析，90%以上的微缺失可以被檢出。最新版指南推薦采用兩管多重PCR方法，檢測(cè)位點(diǎn)如下：AZFa： sY84，sY86；AZFb：sY127，sY134；AZFc：sY254，sY255對(duì)照：SRY，ZFX，ZFY[11]。

一般人群中Y染色體微缺失發(fā)生的概率約為1/4 000，在無精子或少精子的不育男性中比例則顯著增加。依據(jù)不同實(shí)驗(yàn)室及不同研究人群，Y染色體發(fā)生的概率大約為1%～58%。一般而言，在非梗阻性無精子癥患者中缺失的概率大約為15%～20%，在少精子癥患者中微缺失發(fā)生的概率大約為7%～10%，需要做ICSI的患者中缺失比例大約占到2%～3%[12,13]。

國內(nèi)外研究顯示，不同種族、地區(qū)的嚴(yán)重少精子癥或無精子癥的不育男性，其Y染色體微缺失的發(fā)生概率不同，為0.7%～34.5%間不等，具有明顯的地區(qū)與種族差異[14]。

四、Y染色體不同類型缺失的重要臨床意義

為了尋找不育的原因、獲得自身和后代遺傳學(xué)咨詢、選擇助孕方式，無精子癥和嚴(yán)重少精子癥的不育患者需要在接受助孕治療前進(jìn)行Y染色體微缺失的檢測(cè)。Y 染色體微缺失發(fā)生的區(qū)域不同，相應(yīng)的臨床表型也有所不同，檢測(cè)出的微缺失類型對(duì)睪丸活檢能否發(fā)現(xiàn)成熟精子預(yù)測(cè)的意義不同。由于Y 染色體在精子發(fā)生時(shí), 無法同其他常染色體一樣，進(jìn)行DNA修復(fù)，因此只要有一個(gè)基因出現(xiàn)微缺陷就會(huì)發(fā)生效應(yīng)。

1. AZFa區(qū)完全缺失大多表現(xiàn)為唯支持細(xì)胞綜合征，大約占到5%。完全缺失的患者，其精子阻滯在青春期前階段，無生育能力并伴有睪丸體積縮小，為絕對(duì)的無精子癥，無法通過ICSI獲得后代[15-19]。

2. AZFb區(qū)缺失和AZFb+c區(qū)缺失大約占總?cè)笔У?5%左右，完全缺失的患者表現(xiàn)為生精阻滯，主要停留在精母細(xì)胞或精子細(xì)胞階段；部分缺失的患者臨床表現(xiàn)多樣化，包括唯支持細(xì)胞綜合征、無精子癥或少精子癥，不推薦給這類病人施行ICSI[20,21]。

以上3種類型的微缺失提示非阻塞性無精子癥，睪丸取精術(shù)（testicular sperm extraction, TESE）/經(jīng)皮附睪抽吸取精術(shù)（percutaneous epididymal sperm aspiration, PESA）常取精失敗，故應(yīng)避免患者進(jìn)行穿刺取精的痛苦。

3. AZFc區(qū)缺失大約占到35%，該區(qū)域的缺失會(huì)造成超過60%AZF區(qū)域發(fā)生缺失。該類患者的臨床和睪丸組織學(xué)表型具有多樣性：可以表現(xiàn)為性激素水平和睪丸體積的正常或異常；可以有正常的生育能力，從而導(dǎo)致AZFc缺失的垂直遺傳；也可以為無精子癥和少弱精子癥，導(dǎo)致不育[22]。趙連明等的研究表明，雖然大約有50% 的單獨(dú) AZFc 缺失患者能射出精子，但大部分人表現(xiàn)為重度或者嚴(yán)重少精子癥，長期藥物治療效果不明顯，應(yīng)及早對(duì)這類患者經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)/睪丸附睪取精（TESE/PESA）技術(shù)獲得精子，而后采用ICSI可成功受孕[23]。

4. AZFd 區(qū)缺失主要表現(xiàn)為精子數(shù)目正常，但精子形態(tài)異?；蛘呤禽p度的少精子癥。

5. AZFa+b+c 3個(gè)區(qū)域全部缺失的患者，一般表現(xiàn)為染色體核型異常。臨床100%表現(xiàn)為無精子癥，無法從睪丸中獲得精子。因此，可以不必對(duì)這類患者進(jìn)行睪丸穿刺增加其痛苦，同時(shí)女方應(yīng)避免進(jìn)行促排卵治療，使患者無謂增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，并造成女方因促排卵可能面臨的并發(fā)癥[24]。

值得注意的是，AZFc區(qū)缺失患者可能出現(xiàn)隨時(shí)間進(jìn)行性精子數(shù)量減少的現(xiàn)象，最終可發(fā)展至無精子癥[25-27]。為避免發(fā)展到有創(chuàng)傷的取精或者不能生育，這些患者應(yīng)及早治療或提前進(jìn)行精液冷凍保存，并通過胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（preimplantation genetic diagnosis, PGD）的方法選擇女性胚胎, 從而避免Y染色體微缺失的傳遞。另外，AZFc區(qū)缺失患者的男性子代將是AZFc區(qū)缺失的攜帶者。因此，AZFc區(qū)域缺失患者的男性后代在成年早期也應(yīng)考慮精液冷凍保存。

另外，部分患者有內(nèi)分泌異常的表現(xiàn)，臨床上可表現(xiàn)為原發(fā)睪丸衰竭，導(dǎo)致激素水平的改變，睪酮產(chǎn)生減少、FSH增高、LH正?；蛳鄳?yīng)不同程度的增高表現(xiàn)[28]。

五、Y染色體微缺失對(duì)ICSI結(jié)局的影響

Y染色體微缺失的個(gè)體因其精子發(fā)生過程存在缺陷，所以這種缺失在自然受孕的情況下很少代代相傳。ICSI技術(shù)的出現(xiàn)使無精子和少精子癥患者獲得生育機(jī)會(huì)，但也可能會(huì)向卵胞漿內(nèi)注入未經(jīng)自然選擇的攜帶染色體異?；験 染色體微缺失的精子，從而將這些遺傳缺陷垂直傳遞給下一代，影響人類的優(yōu)生和自然進(jìn)化。

1. Y染色體微缺失自然傳遞給男性后代 Y染色體微缺失的主要表型是男性不育，因此，通過自然傳播的AZF缺失的報(bào)道比較少見。Kühnert等報(bào)道了一例特殊病例：AZFc區(qū)缺失由父親垂直遺傳給兒子[29]。Zhu等發(fā)現(xiàn)在19例漢族不育男性中，AZFc區(qū)的缺失可以垂直遺傳兩代到三代[30]。Samli等發(fā)現(xiàn)一例父親將AZFb區(qū)缺失垂直自然遺傳給3個(gè)兒子的特殊病例[31]。Dai等的研究表明，父親具有Y染色體微缺失，則其傳遞給兒子的概率約為70%[6]。這也說明，盡管AZFc缺失嚴(yán)重影響精子發(fā)生的過程，但并不能完全阻滯自發(fā)懷孕。

2. Y染色體微缺失通過ICSI 傳遞給男性后代 男性不育患者因ICSI技術(shù)的大力發(fā)展，使得助孕技術(shù)翻開了新的篇章，然而越過自然選擇機(jī)制的行為使得子代遺傳缺陷風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。與自然傳遞給子代相比，Y染色體的微缺失因ICSI傳遞給子代則有相對(duì)較多的報(bào)道。

1996年，Kent-First等[32]首次得到32對(duì)因男方因素不育的夫婦通過ICSI 獲得子代的研究。對(duì)父親具有Y染色體微缺失的3對(duì)父子進(jìn)行研究，其中2對(duì)父子具有AZFb和AZFc之間區(qū)域的缺失，第三對(duì)父子具有AZFb和AZFc區(qū)域大片段的缺失。通過ICSI產(chǎn)生的子代Y染色體微缺失的概率為9.4%，這個(gè)概率和普通男性不育中微缺失的概率相近。Liu等[33]研究了199個(gè)漢族父親和來自輔助生殖技術(shù)的228個(gè)子代之間的Y染色體微缺失的情況，其中行IVF出生的子代85個(gè)、ICSI出生的子代73個(gè)，自然懷孕70個(gè)。研究結(jié)果表明，Y染色體微缺失的概率在IVF，ICSI，以及自然懷孕案例中的比例分別為10.7%，3.2%和8.2%，無顯著性差異。在70例自然生產(chǎn)的子代中新發(fā)1例子代Y染色體微缺失，在158例經(jīng)輔助生殖產(chǎn)生的子代中未發(fā)生Y染色體微缺失。研究結(jié)果表明，輔助生殖技術(shù)并不能顯著提高子代Y染色體微缺失的概率。Oates等[34]的研究表明，42例AZFc區(qū)缺失的父親通過ICSI生育得到的子代中18例均遺傳了其父代的AZFc區(qū)缺失，但其缺失長度并未增加。國內(nèi)學(xué)者王麗霞等[35]在488名無精子、少精子癥患者中發(fā)現(xiàn)56例患者存在Y染色體微缺失，且均為AZFc缺失。比較少精、無精患者缺失組和未缺失組未發(fā)現(xiàn)有胎兒畸形、流產(chǎn)率、早產(chǎn)率、后代出生體質(zhì)量、雙胎妊娠率與男嬰比例等存在差異。缺失組成功妊娠19例，其中出生男嬰8例，行AZF微缺失檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)均為AZFc缺失。由此可知，AZFc微缺失可以由父親遺傳給男性子代，缺失片段的長度和類型基本一致，但是成年后同樣會(huì)有精子發(fā)生障礙和不育的風(fēng)險(xiǎn)，這與近年來的文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相一致[36-40]。而國內(nèi)外文獻(xiàn)對(duì)從父親垂直遺傳而來的除AZFc區(qū)之外的缺失類型尚未見報(bào)道，同時(shí)亦沒有證據(jù)證明AZF微缺失患者的后代的缺失范圍會(huì)擴(kuò)大。

van Golde等[42]比較19例AZFc區(qū)缺失患者和同期239例正常精液排出的ICSI妊娠結(jié)局，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AZFc區(qū)缺失患者的受精率，胚胎質(zhì)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組，但是妊娠率和帶嬰回家率之間并無顯著差異。國內(nèi)孫寶剛等[41]對(duì)109例妻子不明原因流產(chǎn)男性患者進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：在109例反復(fù)流產(chǎn)夫婦中Y染色體異常28例。Y染色體結(jié)構(gòu)異常18例，數(shù)目異常2例，多態(tài)性變異8例，未發(fā)現(xiàn)存在Y染色體缺失的病例。吳畏研究組[43]比較了Y 染色體微缺失患者和無缺失的無精子或嚴(yán)重少弱精子癥患者的ICSI治療結(jié)局。結(jié)果表明，兩組在女方年齡、不孕年限、男方年齡、獲卵數(shù)、ICSI 卵子數(shù)、平均移植胚胎數(shù)等基本情況差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Y染色體微缺失組與對(duì)照組相比，受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率、生化妊娠率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明Y染色體微缺失不影響ICSI治療結(jié)局。王麗娟研究組[44]以22例Y染色體微缺失患者進(jìn)行的27個(gè)ICSI治療周期為研究組，以88例無缺失的嚴(yán)重少精子癥或無精子癥患者101個(gè)ICSI治療周期為對(duì)照組。研究結(jié)果表明，研究組和對(duì)照組的受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、新鮮周期移植優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、胚胎著床率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、男嬰比例等均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上研究結(jié)果都表明，Y染色體微缺失對(duì)ICSI治療周期的妊娠結(jié)局無顯著性影響。

3. Y染色體微缺失不同缺失熱點(diǎn)對(duì)ICSI成功率的影響 研究表明：Y染色體微缺失患者缺失的熱點(diǎn)不同，影響ICSI的成功率不同，這一點(diǎn)與缺失熱區(qū)分布和睪丸組織學(xué)類型的關(guān)系相一致。吳畏研究組[43]的結(jié)果表明，雖然ICSI治療周期形成的胚胎情況和妊娠結(jié)局與Y染色體微缺失并無顯著性影響，但不同的缺失位點(diǎn)導(dǎo)致的ICSI結(jié)局是不盡相同的，其他類型Y染色體微缺失患者配偶臨床妊娠機(jī)會(huì)低于AZFd區(qū)部分缺失加c區(qū)全部缺失患者。Zhu等[45]2015的最新研究共招募61例AZFc區(qū)缺失的不育患者，根據(jù)sY152是否單獨(dú)缺失為標(biāo)準(zhǔn)將實(shí)驗(yàn)組分為兩組，以50例無精子或少精子但無缺失的患者為對(duì)照組。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，sY152組和AZFc組的受精率較對(duì)照組低。3組之間在MII卵數(shù)、胚胎質(zhì)量、2PN數(shù)、可移植胚胎數(shù)、臨床妊娠率、種植率、流產(chǎn)率、多胎率、分娩率、男/女性別比率等方面沒有顯著差異。提示sY152單獨(dú)缺失導(dǎo)致較低的受精率，但對(duì)最終的妊娠結(jié)局不產(chǎn)生大的影響。de Llanos等[46]比較了4例gr/gr缺失患者的ICSI結(jié)果，研究表明，取卵數(shù)、合子數(shù)及妊娠率均無顯著性差別，與Oates等[34]的研究結(jié)果一致。

六、結(jié)語

男性不育患者多數(shù)因病因不清缺乏特異有效的治療。因采用不恰當(dāng)?shù)闹委煼椒ㄔ斐傻馁Y源、人力的浪費(fèi)和病人的痛苦令人擔(dān)憂。結(jié)合國內(nèi)外關(guān)于Y染色體微缺失的研究進(jìn)展，我們建議將Y染色體微缺失的篩查作為對(duì)男性不育患者的一項(xiàng)常規(guī)檢查項(xiàng)目，找到不育的真正原因，從而避免不必要的藥物及手術(shù)治療。

盡管已經(jīng)有大量的針對(duì)Y染色體微缺失的研究，然而來自不同地理分布，不同民族的人群得到的結(jié)果并不是很一致，甚至出現(xiàn)相反的結(jié)果。基于現(xiàn)在已經(jīng)得到的數(shù)據(jù)，我們可以得到以下基本信息：（1）Y染色體微缺失在無精子癥以及嚴(yán)重的少精子癥患者中十分常見；（2）盡管大多數(shù)的AZF缺失是新發(fā)的，仍有通過自然孕育或ICSI垂直遺傳給子代的缺失；（3）為了更好地了解Y染色體微缺失發(fā)生的機(jī)制，對(duì)病人的篩選標(biāo)準(zhǔn)要更加準(zhǔn)確，臨床資料的登記以及各種檢查指標(biāo)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)男性不育患者Y染色體微缺失的父代和子代的追蹤和隨訪，以期正確評(píng)估Y染色體微缺失通過ICSI技術(shù)對(duì)子代可能造成的風(fēng)險(xiǎn)，并通過遺傳家系研究進(jìn)一步明確。

ICSI技術(shù)的普遍開展和大規(guī)模應(yīng)用引起的下一代男性不育問題會(huì)慢慢凸顯，輔助生殖科研人員應(yīng)盡早從分子流行病的角度深入研究Y染色體微缺失的遺傳機(jī)制，使Y染色體微缺失的檢測(cè)不僅僅是一種檢測(cè)手段，同時(shí)成為一種合理有效的預(yù)測(cè)及阻斷手段。

致謝：本文由甘肅省衛(wèi)生行業(yè)科研計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：GSWSKY-2015-50）；蘭州大學(xué)第一醫(yī)院院內(nèi)基金（項(xiàng)目編號(hào)：ldyyyn2013-04）；蘭州大學(xué)國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：201710730170）基金資助

Y染色體/遺傳學(xué); 精子注射, 細(xì)胞質(zhì)內(nèi);生殖技術(shù), 輔助; 不育, 男性

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（2017-04-05收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.03.015

R 698.2