干細(xì)胞向甲狀腺濾泡細(xì)胞的分化研究

盛建國張傳森章建全

干細(xì)胞向甲狀腺濾泡細(xì)胞的分化研究

盛建國1張傳森2章建全1

我國目前有超過2億的甲狀腺疾病患者，其中一部分患者經(jīng)歷外科或者放射治療后可引起甲減，只能通過終身服用合成甲狀腺激素進(jìn)行替代治療。隨著多能干細(xì)胞分化研究的深入，已有多種方法將多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為甲狀腺濾泡細(xì)胞，利用多能干細(xì)胞產(chǎn)生甲狀腺濾泡細(xì)胞，為臨床移植治療甲狀腺功能減退癥提供新的思路。本文總結(jié)近年來誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為甲狀腺濾泡細(xì)胞的研究進(jìn)展，并在此基礎(chǔ)上對(duì)分化細(xì)胞的鑒定、安全性及臨床應(yīng)用面臨的問題等進(jìn)行討論。

甲狀腺； 胚胎干細(xì)胞； 多能干細(xì)胞； 間質(zhì)干細(xì)胞； 細(xì)胞分化

甲狀腺是人體最重要的內(nèi)分泌器官之一，它通過合成和分泌甲狀腺素（T4）和三碘甲狀腺原氨酸（T3），調(diào)節(jié)人體多種生物活動(dòng)，例如：新陳代謝、骨骼生長、腦發(fā)育、體溫調(diào)節(jié)等，影響著人體內(nèi)幾乎每個(gè)組織和細(xì)胞。甲狀腺疾病相當(dāng)普遍，我國目前有2億以上的人患有甲狀腺疾病。其中一部分患者經(jīng)過外科或放射治療后可能導(dǎo)致甲狀腺功能減退，依靠服用人工合成甲狀腺素進(jìn)行替代治療，部分患者存在長期服藥后出現(xiàn)神經(jīng)認(rèn)知功能、心理適應(yīng)性下降，甚至焦慮和抑郁。

多年來，研究人員一直在探索利用干細(xì)胞技術(shù)治療甲狀腺疾病[1-6]。通過干細(xì)胞技術(shù)不僅可以修復(fù)、替代人體缺損的甲狀腺濾泡細(xì)胞，還可以避免對(duì)合成甲狀腺激素的依賴。這種基于干細(xì)胞技術(shù)的再生醫(yī)學(xué)的核心是多能干細(xì)胞（pluripotent stem cell，PSC）。PSC是一種特殊的干細(xì)胞群，有3個(gè)主要特點(diǎn)：（1）自我更新；（2）自我增殖；（3）向三個(gè)胚層多向分化的能力。PSC根據(jù)細(xì)胞來源不同可分為胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）及間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）。本文將對(duì)上述三類干細(xì)胞向甲狀腺濾泡細(xì)胞（thyroid follicular cell，TFC）分化的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行綜述。

一、甲狀腺細(xì)胞的組織來源及關(guān)鍵發(fā)育調(diào)控基因

對(duì)于目的細(xì)胞的組織來源與基因調(diào)控的深入研究是干細(xì)胞定向分化成功與否的基礎(chǔ)。甲狀腺由兩種內(nèi)分泌細(xì)胞組成：TFC和濾泡旁細(xì)胞（calcitonin cell，C細(xì)胞）。大部分腺體組織由TFC構(gòu)成，它來源自前腸內(nèi)胚層，是體內(nèi)負(fù)責(zé)合成與分泌甲狀腺激素的場所。在胚胎發(fā)育的原腸胚期，定型內(nèi)胚層（de fi nitive endoderm，DE）衍生的原始腸的前腸內(nèi)胚層前后軸被分布到包括原始甲狀腺、肺、胰腺和肝臟等器官的特異性結(jié)構(gòu)域中[7-8]，這些器官結(jié)構(gòu)域的局部特異性的主要標(biāo)志是前后軸上不同位置的表達(dá)的特異轉(zhuǎn)錄因子[8]。2001年Damante等[9]在胚胎早中期的原始咽中發(fā)現(xiàn)了一小組細(xì)胞可以發(fā)育成TFC，并且通過Nkx2-1、Foxe1、Pax8和Hhex四種基因的共表達(dá)對(duì)這組細(xì)胞進(jìn)行分離提純。這些基因雖然可以在甲狀腺外組織中單獨(dú)表達(dá)，但是他們只在甲狀腺內(nèi)共同表達(dá)。他們通過建立甲狀腺特異性基因表達(dá)程序來指導(dǎo)甲狀腺的器官發(fā)育[9]。

上述四種基因的作用目前已經(jīng)基本研究明確，Nkx2-1和Pax8主要負(fù)責(zé)驅(qū)動(dòng)Tg、TPO和NIS基因的甲狀腺特異性激活[10-11]，在維持甲狀腺濾泡細(xì)胞存活、甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)的維持及甲狀腺發(fā)育后期維持甲狀腺前體細(xì)胞的存活方面發(fā)揮作用[12-13]。Foxe1的主要作用是調(diào)控甲狀腺前體細(xì)胞遷移的作用[14]。Hhex主要作用包括間接調(diào)控甲狀腺原基的形成、發(fā)育后期甲狀腺前體細(xì)胞的存活、甲狀腺前體細(xì)胞遷移等[15-17]。

二、胚胎干細(xì)胞向甲狀腺濾泡細(xì)胞的分化

ESC起源于胚泡期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass，ICM）[18-20]。當(dāng)去除了維持多能性的培養(yǎng)條件后，ESC將可分化產(chǎn)生胚胎內(nèi)胚層、中胚層和外胚層三個(gè)胚層的細(xì)胞[21]。所以，評(píng)估ESC的分化潛能對(duì)于其在未來研究和治療應(yīng)用中的有效性至關(guān)重要。Keller等[21]和Doetschman等[22]研究發(fā)現(xiàn)可以將完全或部分分離的ESC在非附著條件下集簇形成球形集落即類胚體（embryoidbodies，EBs）進(jìn)行體外分化，EBs細(xì)胞可以在附著底物后長時(shí)間培養(yǎng)和分化。這一特性配合新的合適的培養(yǎng)條件和方案，為ESC向TFC的分化研究提供了研究基礎(chǔ)。

2001年Espinoza等[23]研究發(fā)現(xiàn)Pax8和Nkx2-1在甲狀腺Tg基因啟動(dòng)子的表達(dá)中起主要作用。Lin等[1]在2003年通過在培養(yǎng)的EB中表達(dá)甲狀腺譜系標(biāo)志物的方法首次證明了鼠胚胎干細(xì)胞可以體外分化成TFC，同時(shí)表明了在無血清條件下，EB分化的單層細(xì)胞中持續(xù)的Pax8和TSHr基因表達(dá)需要TSH，而Tg沒有表達(dá)。Arufe等[2,6]利用基因編輯方法將綠色熒光蛋白標(biāo)記于TSH受體啟動(dòng)子基因，用來示蹤內(nèi)源性TSHR，這些ESC經(jīng)過胰島素和胰島素樣生長因子-1刺激后，在含有TSH的基底膜基質(zhì)中分化出具有濾泡樣結(jié)構(gòu)的TFC簇。為了更有效的在體外向TFC定向分化，細(xì)胞需要進(jìn)行有條件地引導(dǎo)培養(yǎng)，從而有利于DE形成，進(jìn)而分化成甲狀腺祖細(xì)胞發(fā)生部位——前腸內(nèi)胚層前部（anterior foregut endoderm，AFE）。Kubo等[24]通過對(duì)非洲爪蟾的發(fā)育研究發(fā)現(xiàn)：（1）FBS雖然是中胚層來源細(xì)胞系分化的有效誘導(dǎo)劑，但對(duì)內(nèi)胚層誘導(dǎo)效果差；（2）限制mESC暴露于血清可以增強(qiáng)DE相關(guān)基因的表達(dá)；（3）含有激活素的培養(yǎng)基可以有效增加小鼠和人ESC中DE的數(shù)量。但是，僅由激活素誘導(dǎo)產(chǎn)生的DE對(duì)甲狀腺細(xì)胞系產(chǎn)生抵抗，需要額外的修飾培養(yǎng)。Green等[25]在成形素與抑制素推動(dòng)DE向AFE轉(zhuǎn)變的研究實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)NOGGIN（BMP信號(hào)拮抗劑）和SB-431542（激活素A/nodal和TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的藥理學(xué)抑制劑）協(xié)同由WNT3a、KGF、FGF10、BMP4和EGF組成的生長因子混合物可以進(jìn)一步將人類胚胎干細(xì)胞導(dǎo)向腹側(cè)AFE。然而，Longmire等[26]發(fā)現(xiàn)這種加入FGF2的雞尾酒方法是有效誘導(dǎo)mESC中Nkx2-1所必須的。這些發(fā)現(xiàn)表明通過階段特異性和時(shí)間依賴性BMP/TGF-β抑制，然后組合誘導(dǎo)BMP和FGF信號(hào)，可以有效地在內(nèi)胚層祖細(xì)胞中產(chǎn)生甲狀腺感受態(tài)細(xì)胞（由Nkx2-1，F(xiàn)oxa2和Pax8表達(dá)證明）。

Antonica等[4]和Ma等[5,27]通過激活關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Pax8和Nkx2-1有效地將鼠和人類ESC分化為功能性TFC，由此衍生的TFC通過表達(dá)特定的轉(zhuǎn)錄因子能夠形成三維的具有功能性甲狀腺濾泡。雖然將Pax8和Nkx2-1轉(zhuǎn)染到ESC中以啟動(dòng)分化過程的初始方法也可以誘導(dǎo)表觀遺傳改變，但卻在體內(nèi)移植后發(fā)現(xiàn)腫瘤形成。但對(duì)甲狀腺分化過程中多種生長調(diào)節(jié)因子的甄別卻可以作為甲狀腺細(xì)胞分化的非轉(zhuǎn)染方法考慮[28]。使用這些基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子已經(jīng)探索了誘導(dǎo)PAX8和NKX2-1的不同方法。Ma等[29]通過Pax8和Nkx2-1的轉(zhuǎn)錄共激活因子TAZ將hESC誘導(dǎo)分化成TFC，觀察到甲狀腺濾泡形成、豐富的TG蛋白表達(dá)、TSH誘導(dǎo)和劑量依賴性放射性碘攝取及蛋白結(jié)合碘的積累，但TAZ在其中的作用機(jī)制目前并沒有得到全部清楚表述，有待后續(xù)研究。

最終，到目前為止，TFC的定向分化只有在mESC中證實(shí)，尚不能確定目前的機(jī)制和方法是否同樣對(duì)hESC有同樣的研究結(jié)果。

三、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向甲狀腺濾泡細(xì)胞的分化

Takahashi等[30]在2006年通過簡單的強(qiáng)制表達(dá)四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（Oct4，Sox2，Klf4和 c-Myc；統(tǒng)稱為 OSKM或Yamanaka因子），成功的將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)換為PSC。Yamanaka因子是通過沉默體細(xì)胞和逆轉(zhuǎn)錄病毒基因、激活多能性基因網(wǎng)絡(luò)、誘導(dǎo)表觀遺傳改變這三個(gè)步驟來對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行重編程。開辟了個(gè)性化的再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。iPSC技術(shù)跨越了技術(shù)和倫理障礙，作為個(gè)體化細(xì)胞替代療法的無限來源具有巨大的希望。

iPSC技術(shù)經(jīng)歷了大量關(guān)鍵因素的改進(jìn)和發(fā)展，已經(jīng)使得iPSC可以用于治療目的。Wernig等[31]和Tsuji等[32]成功利用源自小鼠iPSC的神經(jīng)細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)小鼠模型中的帕金森病和脊髓損傷，療效也是安全的。Kobayashi等[33]研究發(fā)現(xiàn)人類iPSC衍生的神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞可以安全有效的治療非人類的靈長類動(dòng)物的脊髓損傷。但iPSC向TFC的誘導(dǎo)分化研究甚少。

Ma等[34]于2015年通過使用EF1a-STEMCCA多順反子（OKSM）慢病毒感染的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞生成小鼠iPSC細(xì)胞，隨后通過載體轉(zhuǎn)染Pax8-1和Nkx2-1基因，在激活素A和TSH作用下生成TFC，結(jié)果顯示iPS細(xì)胞中甲狀腺特異性基因NIS，TSHR，Tg和TPO的表達(dá)顯著增強(qiáng)，功能性甲狀腺濾泡細(xì)胞具有劑量依賴性cAMP產(chǎn)生和放射性碘吸收。此外，細(xì)胞在培養(yǎng)物中形成三維濾泡結(jié)構(gòu)，并且在PAX8+NKX2-1+iPS細(xì)胞移植到裸鼠中后形成“甲狀腺樣器官”，并且根據(jù)免疫組織化學(xué)判斷所有細(xì)胞都表達(dá)Tg蛋白。這一分化的TFC的性質(zhì)與先前ESC細(xì)胞分化的TFC非常相似。這一研究結(jié)果也證明iPSC可以給干細(xì)胞向TFC的分化研究提供一種全新的種子細(xì)胞。

四、間充質(zhì)干細(xì)胞向甲狀腺濾泡細(xì)胞的分化

目前MSC向TFC分化的研究主要集中在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞。上述兩項(xiàng)研究均為國內(nèi)研究者的初步嘗試和探索，不如國外ESC細(xì)胞研究那樣深入，水平有待加強(qiáng)，。

（一）BMSC向甲狀腺濾泡細(xì)胞的分化

劉東源團(tuán)隊(duì)于2011年研究顯示，利用第3代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在胰島素和TSH的誘導(dǎo)分化下，通過流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示可見TSHr（99%）和Nkx2-1（99%）表達(dá)[35]。同年，劉東源領(lǐng)導(dǎo)的另一組研究人員通過使用SD大鼠的BMSC利用相同的誘導(dǎo)條件，得出如上相同的結(jié)果[36]。雖然兩組人員初步探討了體外誘導(dǎo)BMSC源性甲狀腺細(xì)胞的方法及可行性，取得了TSHR及Nkx2-1的高表達(dá)，但并未對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞做細(xì)胞免疫熒光分析及RT-PCR分析，也未對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞做功能測定。

潘倩等[37]2015年利用Transwells小室構(gòu)建了大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與大鼠甲狀腺細(xì)胞FRTL-5共培養(yǎng)體系，利用TSH、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、生長抑素及氫化可的松作為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化大鼠BMSC。結(jié)果顯示細(xì)胞免疫組化檢測到Pax8和Nkx2-1的顯著表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光法也檢測到NIS、TPO和Tg的顯著表達(dá)。RT-PCR檢測Pax8和Nkx2-1基因含量增加。細(xì)胞功能方面試圖利用電化學(xué)發(fā)光法檢測T3和T4的含量，但因誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中添加了胎牛血清，后者包含T3、T4激素類物質(zhì)，盡管檢測結(jié)果的排他性不強(qiáng)，但與其他各組檢測結(jié)果相比較，結(jié)果具有明顯差異，較其他組增高趨勢明顯，與其他3個(gè)檢測結(jié)果綜合起來分析，總體研究結(jié)果仍然是有借鑒價(jià)值的。

（二）UCMSC向甲狀腺濾泡細(xì)胞分化

李振想等[38]利用TSH、胰島素及干細(xì)胞生長因子在體外誘導(dǎo)人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞向TFC分化，流式細(xì)胞結(jié)果顯示Nkx2-1和TSHR的表達(dá)率分別為27.2%和65.7%，但蛋白質(zhì)分子層面和基因表達(dá)水平均未作檢測。

五、干細(xì)胞治療中的關(guān)鍵問題

ESC不僅在倫理上具有明確的爭議，還存在分化組織移植后的免疫排斥問題[30]。與ESC不同，iPSC沒有倫理爭議問題，能夠從大量學(xué)術(shù)和商業(yè)實(shí)驗(yàn)室中獲得，可以用于創(chuàng)傷治療中移植供體的來源和廣泛的疾病治療中。但無論哪種誘導(dǎo)方式或者重編程方式如何，在干細(xì)胞用于人體疾病治療前，必須知曉所有潛在的可引起疾病的基因改變，這顯然存在較大難度和挑戰(zhàn)。

在實(shí)現(xiàn)PSC在細(xì)胞替代治療中的實(shí)際應(yīng)用之前，需要解決許多問題[39]，以下論點(diǎn)可能不夠詳盡：（1）建立無異種的和化學(xué)組分確定的培養(yǎng)條件以降低培養(yǎng)中的變異并根除潛在引入的可能引發(fā)免疫應(yīng)答的異種抗原；（2）制定特定譜系的有效誘導(dǎo)方案；（3）確定細(xì)胞的成熟階段和所需的治療細(xì)胞劑量；（4）制定譜系選擇和（或）清除未分化細(xì)胞以減少移植物的PSC污染的嚴(yán)格策略；（5）解決導(dǎo)致GvHD的供體（受體）相容性；（6）iPSC和ESC之間公認(rèn)的差異，如表觀遺傳學(xué)（異常表觀遺傳記憶以及供體細(xì)胞記憶）和突變負(fù)荷是否產(chǎn)生不同的治療結(jié)果；（7）對(duì)于治療成功與否至關(guān)重要的就是能夠開發(fā)出將治療細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到靶位置的投放技術(shù)。

六、結(jié)論

利用PSC來源的TFC治療甲狀腺功能減退癥，將有效解決臨床移植供體材料的來源難題，要看到干細(xì)胞研究和譜系定向培養(yǎng)技術(shù)的快速發(fā)展，特別是TFC的誘導(dǎo)分化研究取得的巨大進(jìn)展，更要清醒地認(rèn)識(shí)到在臨床應(yīng)用前的道路上仍有上述許多問題需要解決。相信基于干細(xì)胞技術(shù)的再生醫(yī)學(xué)用于治療甲狀腺疾病只是時(shí)間問題。

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37 潘倩. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化[D]. 上海： 第二軍醫(yī)大學(xué), 2015 .

38 李振想, 官立萍, 姬明麗, 等. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為甲狀腺細(xì)胞的初步探討[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 29(12)：1904-1906.

39 Sewell W, Lin RY. Generation of thyroid follicular cells from pluripotent stem cells： potential for regenerative medicine[J]. Front Endocrinol (Lausanne), 2014, 5：96.

Generation of thyroid follicular cells from stem cells

Sheng Jianguo1, Zhang Chuansen2, Zhang Jianquan1.
1Department of Ultrasound in Medicine, ChangzhengHospital, Shanghai 200003, China;2Research Center of Regenerative Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433,China

ZhangJianquan, Email:ultramez@sina.com; ZhangChuansen, Email:chuansenzhang@126.com

More than 200 milllion people in China are afflicted with a thyroid related disorder. The majority of patients may cause hypothyroidism after surgery or radiation therapy. The synthetic thyroid hormone is the replacement therapy for hypothyroidism. Due to the great progresses in the research of pluripotent stem cell differentiation, thyroid follicular cells derived from pluripotent stem cells may become a solution to this issue. In this review, we summarize recent advances in the enrichment and purification of differentiated cells, and discuss the concerns of tumorigenicity,immunological rejection and clinical uses.

Thyroid gland; Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Messenchymal stem cells; Cell differentiation

2017-02-15）

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.03.012

國家自然科學(xué)基金（81171436）

200003 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院超聲診療科1；200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)再生醫(yī)學(xué)研究中心2

章建全，Email：ultramez@sina.com；張傳森，Email：chuansenzhang@126.com

盛建國，張傳森，章建全.干細(xì)胞向甲狀腺濾泡細(xì)胞的分化研究[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版），2017，7（3）：185-188.