噬菌體展示技術(shù)及其在病原微生物研究中的應(yīng)用進(jìn)展

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(南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，湖南 衡陽(yáng) 421001)

·小專論·

噬菌體展示技術(shù)及其在病原微生物研究中的應(yīng)用進(jìn)展

鄧湘贏，曾焱華*

(南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，湖南 衡陽(yáng) 421001)

噬菌體是能特異性地感染細(xì)菌的一類病毒，其基因數(shù)目少，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，容易在分子水平上操控其基因。噬菌體展示技術(shù)是將外源肽或蛋白以融合蛋白形式表達(dá)并呈現(xiàn)在噬菌體衣殼表面的分子生物學(xué)技術(shù)。與傳統(tǒng)的研究方法相比，噬菌體展示技術(shù)具有通量高、成本低、操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)。本綜述主要聚焦噬菌體展示技術(shù)在病原微生物抗原篩選、抗體制備和疫苗研制等方面的應(yīng)用進(jìn)展。

噬菌體； 噬菌體展示技術(shù)； 病原微生物

噬菌體是能特異性感染細(xì)菌的病毒，因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、基因數(shù)目少而成為分子生物學(xué)研究的重要模型系統(tǒng)。Smith最早用絲狀噬菌體作為載體進(jìn)行分子生物學(xué)研究并首次介紹了噬菌體展示技術(shù)[1]。噬菌體具有高度的基因靈活性是噬菌體展示技術(shù)的基礎(chǔ)。該技術(shù)可將外源蛋白的基因型和表型、蛋白質(zhì)分子結(jié)合活性和噬菌體的可擴(kuò)增性結(jié)合在一起。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展及各學(xué)科間的交叉融合，噬菌體展示技術(shù)被不斷地改進(jìn)與完善，在蛋白質(zhì)相互作用、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、疾病診斷與治療、抗原表位篩選與疫苗研制等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。本文主要介紹噬菌體展示技術(shù)的概況及其在病原微生物研究中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 噬菌體展示技術(shù)概況

噬菌體展示技術(shù)是將外源多肽或蛋白表達(dá)并呈現(xiàn)在噬菌體表面的一種分子生物學(xué)技術(shù)，其原理是將外源DNA片段插入到一個(gè)編碼噬菌體衣殼蛋白的基因中，與衣殼蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，由于展示的外源多肽或蛋白能保持良好的生物學(xué)活性，因而能與目標(biāo)分子特異結(jié)合。同時(shí)，外源多肽或蛋白的融合表達(dá)并不會(huì)影響重組噬菌體感染宿主的能力，通過(guò)簡(jiǎn)單的“生物淘選與擴(kuò)增”即可獲得重組噬菌體。

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過(guò)5 500種噬菌體，根據(jù)噬菌體的生活周期不同，可以將其分為烈性噬菌體和溫和噬菌體。常用的烈性噬菌體主要包括λ噬菌體、T7噬菌體和T4噬菌體等，溫和噬菌體主要包括M13和fd等。兩種類型的噬菌體作為載體時(shí)在以下幾方面各有優(yōu)劣：①純化步驟：M13噬菌體在增殖期間不裂解宿主菌，噬菌體易于純化；而T7,T4和λ噬菌體等裂解性噬菌體，純化比較繁瑣。②生長(zhǎng)速度：T7噬菌體比M13生長(zhǎng)快，在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)就能形成噬菌斑。③穩(wěn)定性：重組的T7噬菌體比M13更穩(wěn)定，適應(yīng)環(huán)境的能力更強(qiáng)。④插入片段大小：M13噬菌體允許插入的片段較短，而T7噬菌體可允許插入大于1 kb的外源基因。因此，研究人員應(yīng)根據(jù)展示蛋白的性質(zhì)和研究目的合理地選擇噬菌體載體。

2 噬菌體展示技術(shù)在病原微生物研究中的應(yīng)用

2.1受體篩選多數(shù)病原微生物表面表達(dá)的某些特異的膜蛋白能與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，然而這些受體分子表達(dá)量很少，通常難以檢測(cè)到，更無(wú)法純化。利用噬菌體展示技術(shù)能高效篩選到這些膜蛋白的受體。目前有3種篩選方法：①用純化的病原微生物表面配體蛋白作為靶分子進(jìn)行淘選；②用完整的病原微生物進(jìn)行淘選；③將噬菌體肽庫(kù)注射到模型動(dòng)物體內(nèi)，噬菌體表面展示的潛在外源配體多肽或蛋白與特定組織結(jié)合，再解剖特定組織進(jìn)行淘選。

如Basha等[2]以炭疽毒素主要受體為靶分子，從M13噬菌體展示肽庫(kù)中篩選到一段能與該受體特異結(jié)合的多肽，該多肽能有效地阻斷ANTXR1(Anthrax toxin receptor 1)和ANTXR2(Anthrax toxin receptor 2)與炭疽毒素的結(jié)合。乙肝病毒包膜蛋白上的preS1抗原對(duì)乙肝病毒黏附、感染肝細(xì)胞至關(guān)重要[3]。Ye等[4]通過(guò)淘選噬菌體多肽庫(kù)，得到了與preS1特異性結(jié)合的短肽B10，并證實(shí)該多肽能有效的阻止乙肝病毒黏附到肝細(xì)胞上。綜上所述，利用噬菌體展示技術(shù)可以篩選到病原微生物上的配體或者與配體相結(jié)合的、宿主細(xì)胞表面的受體，這對(duì)于病原微生物致病機(jī)制的研究至關(guān)重要，同時(shí)也為利用其模擬分子或拮抗分子阻擋病原微生物對(duì)宿主細(xì)胞的感染和疫苗研究奠定了理論基礎(chǔ)。

2.2抗原表位分析及抗原篩選噬菌體展示技術(shù)是低成本高效分析病原微生物抗原表位的研究方法，抗原表位的研究能為闡明病原微生物的致病機(jī)制、感染性疾病的診斷、免疫治療和疫苗研制奠定基礎(chǔ)。本課題組Zeng等[5]以純化的生殖支原體黏附蛋白(MgPa)的多克隆抗體為靶分子，從噬菌體展示隨機(jī)十二肽庫(kù)中篩選到MgPa的模擬表位。Cariccio等[6]用噬菌體展示技術(shù)篩選到了腦膜炎奈瑟氏菌表面粘附素A抗體的模擬表位。目前，噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)是用于篩選病原體模擬表位的有力工具。

利用噬菌體展示cDNA文庫(kù)也能篩選到某些特異性抗原。Talwar等構(gòu)建基于支氣管肺泡灌洗細(xì)胞和白細(xì)胞的T7噬菌體展示cDNA混合文庫(kù)，篩選該文庫(kù)獲得了1 152個(gè)肉狀瘤病的潛在抗原[7]。Kim等[8]證實(shí)利用噬菌體cDNA文庫(kù)篩選到的異質(zhì)性核糖核蛋白H3(Hnrph3)為葡萄膜炎眼部的抗原之一。Guo等[9]利用噬菌展示技術(shù)篩選到類鼻疽伯克氏菌的保護(hù)性抗原。總之，噬菌體展示技術(shù)，尤其是噬菌體cDNA文庫(kù)為抗原篩選提供了便利。

2.3抗體制備單克隆抗體在醫(yī)學(xué)診斷與治療領(lǐng)域被認(rèn)為具有劃時(shí)代意義，大部分單克隆抗體都可以從實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物獲得，但是費(fèi)時(shí)費(fèi)力且產(chǎn)量低。通過(guò)噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)可以快速高效的篩選到高特異性的單克隆抗體基因型，在原核系統(tǒng)中大規(guī)模表達(dá)后即可獲得相應(yīng)的單克隆抗體。利用噬菌體展示技術(shù)獲取特異性抗體的主要優(yōu)勢(shì)在于速度快、不需要免疫動(dòng)物，成功避開(kāi)了體內(nèi)生產(chǎn)抗體的繁瑣步驟。Mohammadzadeh等[10]成功地構(gòu)建了噬菌體抗體庫(kù)，從中篩選到了可以特異性中和HIV-1 p24的抗體。Chen等[11]從噬菌體抗體庫(kù)中篩選到4種能中和腸道病毒71型的抗體。Qiao等[12]用HIV-1糖蛋白gp120淘選噬菌體肽庫(kù)，獲得了一種新的人類單克隆抗體A16。

2.4早期診斷病原微生物表面的某些特異分子或抗原可用于微生物的特異診斷。在抗原未知或者不容易獲得的情況下，使用噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)可獲得相應(yīng)的抗原表位，從而進(jìn)一步找到可能的特異性診斷標(biāo)志物，用于研發(fā)臨床診斷試劑。本課題組Wang等[13]以純化的結(jié)核病人血清為靶分子，從噬菌體展示隨機(jī)十二肽庫(kù)中篩選到能與結(jié)核病陽(yáng)性血清特異結(jié)合的兩條多肽，基于這兩條多肽建立的結(jié)核病血清學(xué)診斷試驗(yàn)具有較高的敏感性與特異性。Wu等[14]從噬菌體抗體文庫(kù)中篩選到能與流感病毒特異結(jié)合的單鏈可變區(qū)抗體，可用于流感病毒診斷試劑的研發(fā)。Jang等[15]從噬菌體文庫(kù)中篩選到能與肺炎鏈球菌表面蛋白A(Pneumococcal surface protein A,PspA)特異結(jié)合的多肽2B11，可用于肺炎鏈球菌感染的診斷。綜上所述，通過(guò)噬菌體展示肽庫(kù)獲得的抗體，具有很高的特異性和靈敏度，在臨床診斷上具有很好的應(yīng)用前景。

2.5疫苗研制噬菌體作為疫苗載體，可以分為噬菌體DNA疫苗和噬菌體展示疫苗。與標(biāo)準(zhǔn)的DNA疫苗相比，噬菌體DNA疫苗由于有噬菌體衣殼蛋白的保護(hù)，能有效阻止DNA降解，從而能誘導(dǎo)更強(qiáng)、更持久的免疫應(yīng)答。噬菌體展示疫苗能將外源性抗原展示到噬菌體表面，隨著噬菌體的增殖，外源性抗原的表達(dá)水平也不斷增加，使機(jī)體產(chǎn)生較高的免疫應(yīng)答。

如本課題組Zeng等[16]將從噬菌體展示肽庫(kù)中篩選到的MgPa的模擬表位制備成多抗原肽，該多抗原肽能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫與細(xì)胞免疫應(yīng)答。Bahadir等[17]將HBcAg的全蛋白展示在M13噬菌體表面，證實(shí)該重組噬菌體在BALB/c小鼠體內(nèi)有較好的免疫原性。Khurana等[18]利用噬菌體肽庫(kù)技術(shù)研制埃博拉病毒的疫苗。Li等[19]利用噬菌體展示技術(shù)淘選到針對(duì)于流感病毒血凝素亞單位2(HA2)的單鏈可變片段，可用于流感疫苗的研制。因此，噬菌體疫苗在病原微生物疫苗研究中顯示出巨大的潛力。

3 總結(jié)和展望

噬菌體展示技術(shù)以其高庫(kù)容、高效方便及靈活篩選等優(yōu)勢(shì)在生命科學(xué)許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，尤其在病原微生物的診斷和治療領(lǐng)域正越來(lái)越受到重視。然而，噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用也存在以下一些限制：①在載體的選擇方面，雖然噬菌體的種類有上千種，但最常用的載體只有屬于溫和噬菌體的M13，fd以及屬于烈性噬菌體的T7和T4等，這表明在噬菌體載體研究上還有很廣闊的空間。②噬菌體的增殖和相應(yīng)外源肽或蛋白的表達(dá)要依靠宿主基因，因此，毒性的分子肽或蛋白不利于進(jìn)行表達(dá)和展示，這為應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)研究毒性多肽或蛋白質(zhì)帶來(lái)不便。③編碼多肽或蛋白質(zhì)基因的偏愛(ài)性，可能導(dǎo)致噬菌體肽庫(kù)的多樣性受到限制。④攜帶有抗原模擬表位的噬菌體進(jìn)入機(jī)體后，一方面誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)模擬表位的抗體，另一方面也誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)噬菌體和其它蛋白的抗體。⑤通過(guò)噬菌體抗體庫(kù)篩選到的病原微生物的特異抗體在產(chǎn)量、穩(wěn)定性等方面還達(dá)不到臨床要求，仍需做大量深入的研究工作。噬菌體展示技術(shù)雖然存在以上缺陷，但隨著噬菌體展示技術(shù)和噬菌體肽庫(kù)技術(shù)的不斷完善與發(fā)展，該技術(shù)勢(shì)必會(huì)給病原微生物的診斷、治療與疫苗研制等帶來(lái)更廣闊的應(yīng)用前景。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.03.025

2017-01-04；

2016-03-24

國(guó)家自然科學(xué)基金(NO:31370207)資助.

*通訊作者，曾焱華，E-mail:zengyihua21cn@126.com.

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