非對稱二甲基精氨酸與線粒體功能的研究進展

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(中南大學湘雅藥學院藥理學系，湖南 長沙 410078)

·講座與綜述·

非對稱二甲基精氨酸與線粒體功能的研究進展

陳慧麗，李元建，江俊麟*

(中南大學湘雅藥學院藥理學系，湖南 長沙 410078)

線粒體功能障礙參與多種心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展，其突出表現(xiàn)為線粒體生物合成減少和線粒體動力學改變，主要由一氧化氮(NO)減少及氧自由基增加所致。最新研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制物(NOS)非對稱二甲基精氨酸(ADMA)，是導致NO水平下降和氧自由基水平升高的重要機制，也是動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等心血管疾病中線粒體功能障礙的重要原因。本文對ADMA與線粒體功能障礙之間的關(guān)系及可能的機制進行簡要綜述。

非對稱二甲基精氨酸； 線粒體功能障礙； 一氧化氮； 氧化應激

線粒體是真核細胞內(nèi)一種具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細胞器，由外膜、膜間隙、內(nèi)膜和基質(zhì)組成。線粒體不僅是細胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的主要場所，而且還參與細胞中許多重要生命活動(如維持細胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)、生成活性氧及調(diào)節(jié)細胞凋亡)。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙是促進動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病及糖尿病血管病變等多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素。多種心血管疾病的高危因素(如高脂、高糖、低氧)通過影響線粒體膜通透性，增加活性氧生成，導致線粒體膜電位下降和線粒體基質(zhì)腫脹，進而引起線粒體功能障礙和細胞裂解凋亡[1]。因此，調(diào)節(jié)線粒體功能可能是治療心血管疾病的重要藥物靶點。

線粒體功能障礙表現(xiàn)為線粒體生物合成障礙[2]和線粒體動力學改變[3]，主要由一氧化氮(nitric oxide,NO)減少[4]，氧自由基產(chǎn)生增加[5]所致。非對稱二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)是一種新的心血管疾病預測因子，不僅能競爭性抑制一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)，減少NO產(chǎn)生，而且還可促進活性氧的生成。因此，ADMA可能對線粒體功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。本文就近年ADMA對線粒體功能影響的研究進展綜述如下。

1 ADMA的生物學特征

真核生物有三種甲基化精氨酸：單甲基精氨酸(NG-monomethyl-L-arginine,L-NMMA)、ADMA和對稱二甲基精氨酸(symmetric dimethylarginine,SDMA)。它們都是由細胞內(nèi)一些含精氨酸殘基的蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(protein arginine methyltransferase,PRMT)甲基化修飾形成。目前在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)兩種PRMT亞型：PRMTⅠ和PRMTⅡ，前者主要促進ADMA與L-NMMA的形成，而后者主要生成SDMA與L-NMMA。ADMA和L-NMMA是NOS抑制物，通過與左旋精氨酸競爭NOS活性結(jié)合位點，抑制NO生成。由于血漿中ADMA的濃度約為L-NMMA的10倍，因此，ADMA被認為是機體內(nèi)主要的NOS抑制物。ADMA有三種代謝途徑：二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase,DDAH)水解、丙氨酸乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine-glyoxylate aminotransferase-2,AGXT2)代謝和腎臟排泄。約80%的ADMA被DDAH特異性地水解生成瓜氨酸和二甲胺，余下部分通過AGXT2水解和腎臟清除。DDAH有兩種亞型：DDAH1和DDAH2，分別由不同基因編碼。DDAH1主要分布于表達神經(jīng)型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)的組織如大腦、腎臟；DDAH2主要分布于表達內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的組織中如血管、心臟、脾[6]。

2 ADMA對線粒體功能的影響

2.1減少線粒體生物合成線粒體生物合成是指形成新的線粒體及生成ATP的能力。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator,PGC-1α)是調(diào)控線粒體生物合成的核心因子，NO可通過可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble guanylate cyclase,sGC)信號途徑增加PGC-1α表達，促進線粒體生物合成。越來越多的研究認為線粒體生物合成減少可能是動脈粥樣硬化、糖尿病等心血管疾病線粒體功能障礙的重要因素。在高脂血癥、糖尿病、胰島素抵抗等患者和動物，心臟[7]、骨骼肌[8]、肝臟[9]和脂肪細胞[10]中線粒體密度、ATP合成和PGC-1α表達明顯減少。研究表明[11]，給予8周齡雄性野生型小鼠3個月或12個月的卡路里限制后，心臟、骨骼肌、肝臟、白色脂肪組織、棕色脂肪組織、腦中eNOS表達和環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)形成增加，并伴隨線粒體合成和ATP產(chǎn)生增加，而eNOS基因敲除小鼠則可明顯抑制卡路里限制誘導的cGMP、PGC-1α和線粒體合成增加。在持續(xù)性肺動脈高壓胎羊模型中[12]，肺動脈內(nèi)皮細胞和肺組織線粒體DNA復制數(shù)、ATP水平、電子轉(zhuǎn)運鏈復合物亞基和PGC-1α水平均明顯減少，而給予NO供體DetaNONOate后，線粒體DNA復制數(shù)和ATP水平明顯增加。上述研究表明NO是參與線粒體生物合成的重要因子。ADMA作為NOS的內(nèi)源性抑制物，不僅可減少NO生成，而且在高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。新近研究發(fā)現(xiàn)：在鏈脲佐菌素誘導的1型[13]和2型[14]糖尿病大鼠，血漿ADMA含量明顯增加，而反映心肌線粒體DNA含量的細胞色素C氧化酶亞單位Ⅰ(COXⅠ)/β-actin比值與線粒體合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子PGC-1α轉(zhuǎn)錄明顯減少；在老年大鼠[15]，血漿內(nèi)源性ADMA水平升高的同時也伴有心肌線粒體生物合成減少，且兩者呈明顯負相關(guān)；在培養(yǎng)的大鼠心肌細胞H9C2[14]，外源性ADMA可直接抑制心肌細胞線粒體生物合成與ATP生成。這些結(jié)果提示，ADMA是導致心肌組織線粒體生物合成障礙的重要效應分子。另外，研究亦發(fā)現(xiàn)ADMA不僅可抑制心肌細胞線粒體生物合成，也可抑制肝細胞、支氣管上皮細胞線粒體生物合成。Chen等[16]不僅在糖尿病大鼠發(fā)現(xiàn)血漿ADMA升高與肝臟線粒體生物合成抑制(COXⅠ與β-actin拷貝數(shù)比值降低和PGC-1α表達下調(diào))及ATP生成減少密切相關(guān)，而且在培養(yǎng)的大鼠肝細胞H4IIE證明外源性ADMA可直接減少線粒體DNA含量、ATP生成和PGC-1α表達。WU等[17]也發(fā)現(xiàn)NOS抑制劑L-N-硝基精氨酸甲酯(L-N(G)-Nitroarginine Methylester,L-NAME)可加重花生四烯酸誘導的大鼠肝細胞線粒體生物合成減少，而NO供體S-亞硝基乙酰青霉胺則可減輕花生四烯酸所致大鼠肝細胞線粒體生物合成的降低。在支氣管上皮細胞[18]，ADMA可加重氧化應激和硝化應激，誘導細胞低氧反應，減少PGC-1α表達和線粒體合成。此外，硝化應激亦可直接導致線粒體損傷，減少線粒體合成。綜上所述，ADMA可能通過下調(diào)PGC-1α表達，抑制線粒體生物合成，誘導線粒體功能障礙。

2.2降低線粒體膜電位線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)是反映線粒體內(nèi)膜通透性的最佳指標之一。MMP的形成與保持不僅可以調(diào)控線粒體內(nèi)膜對各種物質(zhì)的選擇性和通透性，而且是呼吸鏈氧化磷酸化中的必要過程，在維持線粒體正常結(jié)構(gòu)與功能中起重要作用。線粒體膜電位下降是細胞凋亡的早期表現(xiàn)，一旦線粒體膜電位下降，將導致呼吸鏈的氧化磷酸化鏈失偶聯(lián)、線粒體基質(zhì)膨脹和破裂、促凋亡蛋白釋放，細胞進入不可逆的凋亡過程，而抑制線粒體膜電位下降，就可阻抑細胞凋亡的發(fā)生[19]。大量研究發(fā)現(xiàn)多種心血管的高危因素如高糖、高脂均可誘導細胞線粒體膜電位下降，導致細胞死亡。潘瑤等[13]在培養(yǎng)的心肌細胞或肝臟細胞[16]證明內(nèi)、外源性NOS抑制物ADMA或L-硝基精氨酸均可直接導致細胞線粒體膜電位下降，引起線粒體功能受損。有趣的是，ADMA在神經(jīng)細胞對線粒體膜電位有不同報道。在PC12細胞[20]，1-甲基4-苯基吡啶離子(1-methyl,4-phenyl pyridium,MPP+)可特異性抑制線粒體呼吸鏈中復合物酶I的活性，引起氧化磷酸化崩解、Ca2+超載，從而激活nNOS，導致NO大量生成。過多的NO與線粒體產(chǎn)生的過氧化物作用生成過硝酸酸鹽，從而引起線粒體蛋白和DNA的氧化，導致線粒體膜電位下降、呼吸鏈電子傳遞障礙和ATP 合成不足，而ADMA可減輕MPP+誘導的PC12細胞線粒體膜電位的下降、細胞色素C的增加。這種作用的差異尚不清楚：可能由于細胞類型不同，對ADMA的作用有差別；也可能是導致細胞損傷的危險因素不同，NO生成不同。在心肌細胞、肝細胞、支氣管上皮細胞是高糖等外源性因素導致NO減少，ADMA增多，而在神經(jīng)細胞是MPP+導致NO過度生成，ADMA通過抑制NOS過度激活、NO過度生成，降低細胞內(nèi)ROS水平而減輕MPP+所致的神經(jīng)細胞線粒體功能障礙。

3 ADMA影響線粒體功能的機制

3.1增加氧化應激線粒體不僅是活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生的主要部位，而且是ROS攻擊的首要靶點。在線粒體電子鏈傳遞過程中，一部分電子在傳遞至細胞色素C氧化酶之前漏出呼吸鏈，與氧發(fā)生單電子還原反應生成超氧陰離子、過氧化氫或羥自由基，導致氧化應激。后者可抑制線粒體呼吸酶活性，減慢呼吸鏈電子傳遞，使線粒體內(nèi)膜通透性轉(zhuǎn)換孔持續(xù)開放、質(zhì)子跨膜梯度下降、線粒體膜電位降低和ATP生成減少，引起線粒體功能受損。近年來有文獻報道，ADMA可促進氧化應激的發(fā)生。在高脂血癥、動脈粥樣硬化、1型和2型糖尿病患者和大鼠血管[21]、心臟[14]、肝臟[16]氧化應激增加與血漿ADMA升高密切相關(guān)；在培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞[22]、肝細胞株H4IIE[16]等，ADMA可通過抑制NOS使其與L-精氨酸之間的電子傳遞解偶聯(lián)，明顯增加細胞活性氧生成，誘導氧化應激，進而導致線粒體功能障礙。在肺動脈內(nèi)皮細胞[22]，ADMA可促進eNOS解偶聯(lián)，使eNOS從胞漿膜轉(zhuǎn)位至線粒體，增加線粒體蛋白硝化水平，導致線粒體合成障礙，而ATP減少可降低熱休克蛋白90(90-kDa heat shock protein,HSP90)的活性，阻止HSP90-eNOS相互作用，進一步加重eNOS解偶聯(lián)、加重線粒體功能障礙，形成惡性循環(huán)。進一步研究發(fā)現(xiàn)[23]，ADMA通過促進肺動脈內(nèi)皮細胞Akt1酪氨酸殘基Y350位點硝化反應，使eNOS的S617和S1179位點磷酸化，進而誘導eNOS線粒體轉(zhuǎn)位。ADMA亦可通過增強Akt1在Thr308和Ser473位點磷酸化，減弱HSP90-Akt1相互作用，增加HSP70水平，減弱Akt1與其抑制劑C端調(diào)節(jié)蛋白之間的相互作用，促進eNOS磷酸化并轉(zhuǎn)位至線粒體。這種轉(zhuǎn)位可引起肉毒堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(carnitineacetyl transferase,CrAT)硝化增加和CrAT活性降低，導致?；舛緣A水平升高誘導線粒體功能障礙，而L-精氨酸可逆轉(zhuǎn)這些病理變化[24]。另外，研究亦發(fā)現(xiàn)ADMA可通過促進三磷酸鳥苷環(huán)化水解酶降解，使NOS輔因子四氫生物嘌呤減少，最終導致eNOS失偶聯(lián)，線粒體超氧陰離子增加，進一步加重線粒體功能障礙[25]。同時，ROS本身也可導致ADMA生成增多，進一步誘導線粒體產(chǎn)生更多的ROS[26]。綜上所述，誘導氧化應激可能是ADMA導致線粒體功能障礙的重要機制。

3.2上調(diào)解偶聯(lián)蛋白2表達解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2,UCP2)是定位于線粒體內(nèi)膜上的一種離子通道，通過介導質(zhì)子跨膜內(nèi)流，驅(qū)散線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的質(zhì)子濃度梯度，降低線粒體膜電位，使底物氧化和ADP磷酸化解偶聯(lián)，進而使ATP生成減少，導致線粒體功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)，1型[13]、2型[14]糖尿病大鼠和老年大鼠[15]血漿ADMA濃度升高，并伴有心臟和肝臟UCP2水平上調(diào)，線粒體膜電位降低以及ATP生成減少。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ADMA濃度與UCP2水平呈正相關(guān)。類似現(xiàn)象在細胞實驗也被證實：在大鼠肝細胞H4IIE和心肌細胞，ADMA可直接上調(diào)UCP2水平，引起線粒體功能障礙，而NO供體硝普鈉則可降低UCP2水平，改善線粒體功能；在脂肪細胞[27]，外源性NOS抑制劑L-NAME可減輕腫瘤壞死因子α對細胞UCP2表達的抑制作用，而用NO供體孵育則產(chǎn)生相反作用。這些結(jié)果提示，上調(diào)UCP2轉(zhuǎn)錄水平可能是ADMA導致線粒體功能障礙的機制之一。

3.3改變線粒體動力學蛋白線粒體動力學包括線粒體的融合與分裂。線粒體融合和分裂之間的平衡控制著線粒體數(shù)量和質(zhì)量，是維持生物體眾多生理活動的基礎(chǔ)如細胞分裂、細胞凋亡等，同時也在ATP生成、自由基清除等過程中起重要作用。動力學相關(guān)蛋白1(dynamic related protein 1,Drp1)和線粒體外膜分裂蛋白1(fission protein 1,Fis1)是線粒體分裂的重要因子。研究表明，2型糖尿病患者臂靜脈血管內(nèi)皮細胞[28]Fis1和Drp1表達明顯增加，并伴隨線粒體ROS水平升高，線粒體結(jié)構(gòu)片段化，而抑制ROS產(chǎn)生可抑制Drp1表達，阻礙線粒體分裂。ADMA是影響氧化應激的重要因素，也可能通過促進線粒體分裂導致線粒體功能受損。Miller等[29]發(fā)現(xiàn)一氧化氮合酶抑制物L-NAME可引起大鼠主動脈線粒體動力學蛋白表達模式的顯著改變(線粒體融合蛋白mitofusin 1、mitofusin 2和optic atrophy 1減少，線粒體分裂蛋白Drp1和Fis1增加)，導致線粒體融合減少、分裂增加。De Palma等[30]發(fā)現(xiàn)L-NAME可增加分化型生肌前體細胞Drp1轉(zhuǎn)位至線粒體，并與Fis1相互作用，進而促進線粒體分裂，導致線粒體功能障礙。這些研究提示，改變線粒體動力學蛋白可能是ADMA導致線粒體功能障礙的另一機制。

4 小 結(jié)

線粒體功能障礙的機制復雜多樣并相互聯(lián)系、相互影響。隨著研究的不斷深入，線粒體功能障礙在心血管疾病中的重要地位逐漸凸顯。ADMA為NOS內(nèi)源性抑制物，可通過引起線粒體功能障礙而在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。因此對ADMA與線粒體功能的研究將有助于為今后心血管疾病的研究和防治開拓新思路。

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2017-02-19；

2017-05-01

國家自然科學基金面上項目(81373408).

*通訊作者，E-mail:junlinjiang@csu.edu.cn.

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蔣湘蓮)