組織芯片技術在消化道腫瘤研究中的應用

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(南華大學附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南 衡陽 421001)

·小專論·

組織芯片技術在消化道腫瘤研究中的應用

付實，張琍*

(南華大學附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南 衡陽 421001)

組織芯片是一種高密度的組織微點陣，它能高度集中多種不同類型的組織標本，從而一次性完成大樣本指標篩選工作。相比于傳統(tǒng)的石蠟切片，組織芯片有著更高的效率，在腫瘤學研究中得到廣泛的應用。本文根據(jù)國內(nèi)外研究成果，就組織芯片技術的概念、分類及其在消化道腫瘤研究中的應用進展等方面予以綜述。

組織芯片技術； 生物芯片； 消化道腫瘤

生物芯片技術起源于核酸雜交理論，隨著20世紀90年代的人類基因組計劃和分子生物等相關學科的進展，生物芯片技術也得到了迅猛的發(fā)展。它將大量生物醫(yī)學檢測相關的材料整齊有序的集成在玻片等固像載體上而形成的可與目的靶分子互相作用、并行反應的固相表面。根據(jù)固定在載體上的物質成分可分為基因芯片、組織芯片、蛋白質芯片等，這些高通量的篩選技術從根本上改變了生物醫(yī)學的研究。組織芯片自提出以來，以其高通量、平行性、節(jié)省性等優(yōu)點迅速引起了廣大關注，它可以研究特定基因及其表達產(chǎn)物與疾病的相關性,在腫瘤分子病理研究上極具潛力和價值，它已成為解剖病理學家在腫瘤研究中最具前途的工具之一。

1 組織芯片的概念及分類

組織芯片也稱組織微陣列(tissue microarray,TMA),它的物質成分為標本組織，研究者可通過免疫組化、熒光原位雜交、原位PCR等方法，對組織中特異性的靶點進行高通量的分析。它可以同時在DNA、RNA及蛋白水平上對大量標本進行檢測分析，TMA可以通過成百上千的標本對某一特定的基因進行分析，這與基因芯片有所區(qū)別,基因芯片一般是從單一的組織或者細胞系中對成百上千的基因進行分析[1]。

按照TMA樣本含量的大小可分為低密度芯片(小于200個點)，中密度芯片(200～600個點)，高密度芯片(大于600個點)。按照組織來源分為人類、動物、植物三大類芯片，而人類組織芯片又可分為正常組織芯片、疾病組織芯片、胚胎組織芯片。人類腫瘤組織芯片屬于人類疾病組織芯片中的一種。腫瘤組織芯片又可分為多腫瘤組織芯片、腫瘤進展(演進)芯片和預后組織芯片。多腫瘤芯片是包含多種腫瘤類型的芯片，可以用它來篩選出不同腫瘤類型中的分子差異，腫瘤進展(演進)芯片可以研究某一特定腫瘤不同階段的分子改變，預后芯片包含可用的臨床隨訪資料的腫瘤樣本，可以用其檢測腫瘤預后分子的變化，從而了解該因子與腫瘤預后的關系。

2 組織芯片技術在消化道腫瘤中的應用

從目前國內(nèi)外的資料來看，組織芯片在腫瘤研究中得到廣泛的應用，包括對前列腺癌、陰莖癌、平滑肌肉瘤等[2-4]。在腫瘤中的應用主要是腫瘤標記物的篩選、腫瘤中免疫表型的相關研究、腫瘤病因學、與基因芯片聯(lián)合檢測[5]。

2.1肝癌肝癌是少數(shù)幾種可以直接由病毒誘發(fā)的腫瘤之一，目前乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)是肝癌的首要誘因。組織芯片聯(lián)合基因芯片技術可以更好的來研究肝癌與HBV之間的聯(lián)系。Ma等[6]注意到羧酸末端截斷的HBX(HBV的產(chǎn)物)時常在肝癌中出現(xiàn)，羧基末端截斷型HBx即3’端的X基因的缺失的HBx，完整的HBx包含HBx-Ab1和HBx-Ab2，而截斷型HBx只能由HBx-Ab1來認定，為了驗證羧基末端截斷型HBx在肝癌中起關鍵作用，Ma團隊利用組織芯片聯(lián)合基因芯片技術對肝癌中的HBx進行了檢測，組織芯片結果顯示羧基末端截斷型HBx在HCC有79.3%的表達?；蛐酒Y果顯示HepG2-X1(與截斷型HBx有關)具有促進增殖、抗凋亡的效果，最后得出羧基截斷的HBx蛋白在肝癌的發(fā)生中起著重要的作用的結論。Ma等分別用PCR、RNA印記雜交對組織芯片、基因芯片的結果進行了驗證，結果證明了組織芯片及基因芯片的可靠性。組織芯片還可以研究罕見的肝癌類型，Riehle等[7]利用包含正常肝組織，肝癌、肝纖維板層型癌，膽管癌、肝局灶性結節(jié)性增生等組織的組織芯片進行實驗，結果發(fā)現(xiàn)mTORC1和FGFR1與纖維板層肝細胞癌的發(fā)生密切相關。

2.2胃癌胃癌是中國排名第三的癌癥死亡原因，每年約有70余萬人死于胃癌[8]。胃癌的發(fā)生通常與多種環(huán)境因素及遺傳因素有關。研究胃癌的發(fā)生、發(fā)展機制對胃癌的診治起到至關重要的作用。吳勇軍，等[9]用含152例胃癌、上皮內(nèi)瘤變48例及正常胃粘膜60例構成的進展組織芯片來驗證胃癌中Cofilin1表達及其意義，結果表明Cofilin1在正常胃黏膜組織、上皮內(nèi)瘤變組織、胃癌中表達分別為36.67%、66.67%、78.95%，它與胃癌腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移、臨床分期密切相關，且與胃癌進展及預后密切相關，它們可能是胃癌侵襲轉移重要的生物標記物。

胃癌的分子靶向治療逐漸走向臨床應用，曲妥珠單抗是針對Her2因子原癌基因產(chǎn)物的單克隆抗體，與Her2結合后可間接發(fā)揮抗腫瘤作用，現(xiàn)已應用于乳腺癌中Her2表達陽性的患者。為了驗證Her2在胃癌中表達，Grabsch等[10]構建了含高密度的胃癌標本(單位面積中腫瘤含量大于50%)、低密度的胃癌標本(單位面積中腫瘤含量小于50%)的組織芯片，并用非腫瘤性胃粘膜標本作為對照，結果表明Her2在非腫瘤胃粘膜表達陰性，且只在腸型胃癌的一小部分亞型中表達，Her2在胃癌中的表達存在明顯的異質性，故今后對于有相同的形態(tài)學表型而有不同的分子表型的胃癌患者可能需要不同的治療策略，此研究為曲妥珠單抗治療Her2陽性胃癌提供了依據(jù)。

2.3食管癌食管癌的發(fā)病率雖沒有胃癌高，但5年生存率仍較低。值得慶幸的是近年來食管癌患者5年生存率逐年提高[11]。組織芯片在食管癌中也同樣應用廣泛，可以檢測食管癌B7-H1可以作為其預后因子[12]、食管癌中存在上皮—間充質轉化等[13]。組織芯片技術是可靠的，Li等[14]用組織芯片采用RNA原位雜交的方法研究miR-375在食管癌及正常食管粘膜之間的聯(lián)系及臨床意義，同時他的團隊為了驗證組織芯片所得結果的可信度，又利用qRT-PCR的方法進行了驗證，結果跟RNA原位雜交的基本一致。這些都證明了組織芯片在食管癌檢測中的實用性及可靠性。

2.4大腸癌大腸癌最容易發(fā)生肝轉移，可以用組織芯片研究大腸癌轉移瘤的情況，Katz等[15]利用188例直腸癌肝轉移術后患者的標本及預后信息制作了預后組織芯片，用來研究腫瘤浸潤淋巴細胞(CD3、CD4、CD8及調(diào)節(jié)性T細胞)計數(shù)與患者預后的關系，結果顯示含有大量調(diào)節(jié)性T細胞的患者預后差，這可能與免疫抑制有關，而腫瘤的免疫反應可以作為大腸癌肝轉移患者預后的一個獨立指標。組織芯片還可以與其他技術聯(lián)合運用，來篩選與大腸癌相關的腫瘤標志物，Kume等[16]做了迄今為止規(guī)模最大的生物標志物膜蛋白驗證研究，首先對來源于大腸癌及息肉中的5566種蛋白進行篩選，利用去細胞成分分析、TMHMM算法、質譜選擇反應(多反應)檢測技術等多項方法，篩選出ITGA5、GPRC5A、PDGFRB、TFRC等這些已經(jīng)證實與大腸癌相關的蛋白，同時也篩選出C8orf55這個功能尚不明確蛋白，Kume團隊又利用包含14種常見腫瘤及13種正常組織做成的組織芯片了解該蛋白在不同組織表達情況，結果顯示C8orf55在結腸癌中相比正常結腸組織有更高的表達，C8orf55可能是結腸癌的生物標志物。

2.5胰腺癌相比大腸癌，胰腺癌預后差，病死率高，具有“難發(fā)現(xiàn)、易轉移、難治療”這三大特點，有“癌中之王”之稱，所以做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷至關重要。Wen等[17]首先利用人胰腺癌組織芯片對Oct4和NanogOct4進行檢測，結果顯示Oct4和NanogOct4均在化生管中有強表達，隨后又用金黃地鼠胰腺癌模型進行了驗證，分別于第15、19、24周處死地鼠獲得相應組織進行實驗，結果顯示第15周可檢測到化生管，第24周的組織出現(xiàn)胰導管內(nèi)癌，而化生管中Oct4強表達(因沒有免疫反應性，地鼠組織中NanogOct4無法評價)，在腫瘤的早期出現(xiàn)上述因子，考慮Oct4、NanogOct4可能與胰腺癌的早期發(fā)生密切相關。篩選與預后相關的標志物也很重要，能為靶向治療提供依據(jù)。Winter等[18]利用預后組織芯片將多個腫瘤標志物進行對比，結果表明，相比其他標志物，MUC1、間皮素能更好的了解胰腺癌預后。miRNA是內(nèi)源性非編碼RNA分子，與胰腺癌的診斷、治療效果、預后密切相關。楊珂[19]就采用原位雜交、免疫組化的方法檢測106例胰腺癌組織芯片中miR-150及其靶蛋白c-Myb、MUC4在胰腺癌中的表達情況，得出miR-150及其靶蛋白與胰腺癌預后相關的結論。

3 TMA的缺點

組織芯片優(yōu)點眾多，同時它也有自身的不足。例如因為腫瘤的異質性，所取樣本并不一定能代表腫瘤組織，制備的過程需要專業(yè)的人員和設備，制作成本較大，存在抗原變化等問題[20]。同時也存在組織芯片的制作尚不能自動化，標本脫片、移位及相應的讀片及信息處理系統(tǒng)不完備等問題。

4 應用前景

組織芯片以其高通量、節(jié)省性等優(yōu)點在腫瘤中的應用非常廣泛，使得分子病理學的研究取得了重大發(fā)展。它仍有許多潛在的應用，當前組織芯片絕大多數(shù)都應用于腫瘤研究，相信以后也可更多的應用于炎癥、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等非腫瘤疾病方向。組織芯片還可運用于轉基因的動物，以研究特定基因表達，為疾病的靶向治療提供依據(jù)。未來的組織芯片所包含的樣本可以更大，將有利于疾病的大數(shù)據(jù)研究。雖然組織芯片實現(xiàn)了小型化，但讀片與大數(shù)據(jù)的分析仍需要耗費大量時間，相信以后隨著與之配套的讀片與分析儀器設備的出現(xiàn)，其必將發(fā)揮更大的效能和作用。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.019

2016-07-14；

2017-01-16

國家自然科學基金資助項目(No.81372378)

*通訊作者，E-mail:hyzhanglig@163.com.

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