風(fēng)味甜瓜中檸檬酸代謝研究進展及RNA—seq技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀

湯謐++劉曄++任儉++張娜++曾紅霞++程維舜++李煜華++孫玉宏

摘 要：隨著人們生活水平的提高，兼具品質(zhì)、營養(yǎng)和健康特征的甜瓜新品種——風(fēng)味甜瓜應(yīng)運而生，探索適度的風(fēng)味甜瓜糖酸比非常重要，而目前對甜瓜果實中主要有機酸成分檸檬酸的代謝機制尚不清晰，因此，綜述了風(fēng)味甜瓜果實檸檬酸代謝特性的研究進展，并對利用RNA-seq技術(shù)分析甜瓜果實檸檬酸代謝關(guān)鍵基因的挖掘提出了一些展望。

關(guān)鍵詞：風(fēng)味甜瓜；檸檬酸；RNA-seq技術(shù)；基因挖掘；研究進展

中圖分類號：S651 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-3547（2016）24-0040-05

甜瓜（Cucumis melo L.），葫蘆科（Cucurbitaceae）甜瓜屬（Cucumis）一年生蔓性草本植物。其果實通常呈球形或長橢圓形，果皮平滑，有縱溝紋；果肉白色、黃色或綠色，味美甘甜；含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、煙酸、鈣、鐵等營養(yǎng)物質(zhì)，是夏季常見的消暑瓜果之一，在果蔬生產(chǎn)和消費中占據(jù)著重要地位。2012年全國甜瓜播種面積達41萬hm2，總產(chǎn)量高達1 330萬t，已穩(wěn)超麻類、煙草等經(jīng)濟作物，成為農(nóng)業(yè)增產(chǎn)、農(nóng)民增收的高效園藝作物（《全國西瓜甜瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2015-2020年）》；2014年，全國甜瓜播種面積達43.89萬hm2，總產(chǎn)量達1 475.80萬t（《中國農(nóng)業(yè)統(tǒng)計資料（2014）》）。但是隨著人們生活水平的提高，傳統(tǒng)的高糖純甜單一口味的甜瓜已不能滿足人們的多樣化需求，兼具品質(zhì)、營養(yǎng)和健康特征的果蔬越來越受歡迎，糖、酸含量較高的甜瓜新品種——風(fēng)味甜瓜因此問世。

外觀、營養(yǎng)和風(fēng)味是決定甜瓜品質(zhì)的關(guān)鍵，而風(fēng)味品質(zhì)是消費者尤為追求的。甜瓜風(fēng)味品質(zhì)主要由可溶性糖和有機酸的含量決定，適當(dāng)?shù)奶撬岜扔兄诠麑嶏L(fēng)味品質(zhì)的提升，產(chǎn)生最佳的口感[1]。因此，研究這2種物質(zhì)的調(diào)控機制和代謝轉(zhuǎn)化非常重要。研究表明，甜瓜品種不同，其果實內(nèi)可溶性糖的成分和含量有差異，早熟甜瓜品種，由于生育期短，光合產(chǎn)物提前進入果實，因此其可溶性糖的主要成分是果糖和葡萄糖；中晚熟甜瓜品種，果實發(fā)育前期可溶性糖主要成分是果糖和葡萄糖，后期主要是蔗糖[2]，而總糖、果糖、葡萄糖和蔗糖含量均受主基因和多基因控制[3]；甜瓜果實中可溶性糖的積累主要發(fā)生在果實發(fā)育的中后期，其與蔗糖磷酸合成酶和酸性轉(zhuǎn)化酶的活性有關(guān)，若合成酶活性升高而轉(zhuǎn)化酶活性降低，糖分就會不斷積累[4]。除此之外，溫光因子也會影響糖分含量的積累，如日溫差積累對果實總糖含量有影響，有效積溫積累對果實葡萄糖含量有影響，而有效輻射積累對果實果糖和蔗糖含量均有影響[3]。

有機酸成分和含量也是影響果實風(fēng)味品質(zhì)的主要因素，其成分以檸檬酸為主，還包括蘋果酸、琥珀酸等。研究表明，甜瓜中有機酸積累的遺傳多態(tài)性較低；此外，日溫差積累對果實總酸、檸檬酸、蘋果酸含量影響較大[3]，而在目前研究中對于調(diào)控檸檬酸代謝的調(diào)控機制還不是特別清晰，其分子標(biāo)記方面的研究也較少[5]，挖掘的關(guān)鍵基因也比較少，因此，運用RNA-seq技術(shù)研究甜瓜果實中檸檬酸代謝特性，并挖掘其中主要的調(diào)控基因，對提高甜瓜果實檸檬酸的含量具有重要作用。

1 檸檬酸代謝途徑研究進展

葡萄糖經(jīng)過三羧酸循環(huán)生成丙酮酸，丙酮酸主要有兩方面的去處，一是在丙酮酸脫氫酶的作用下氧化脫羧生成乙酰CoA（乙酰輔酶A），二是在丙酮酸羧化酶的作用下羧化生成草酰乙酸，最后草酰乙酸和乙酰CoA在檸檬酸合酶的作用下縮合生成檸檬酸。Lobit等[6]利用依賴于簡化的線粒體三羧酸循環(huán)表示的檸檬酸代謝模型預(yù)測了果實快速生長期檸檬酸的含量，該模型僅考慮了三羧酸循環(huán)的3個中間體（檸檬酸、蘋果酸和丙酮酸），并假設(shè)2個組分之間的流動僅受酶活性、溫度、初始濃度、目標(biāo)組分濃度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的CO2被呼吸作用同化后，在細胞質(zhì)和線粒體之間的流動除了受溫度和酶活性影響外，主要受兩區(qū)室之間的濃度梯度影響[3]。

1.1 風(fēng)味甜瓜中的檸檬酸代謝

經(jīng)過前人的研究可以看出，風(fēng)味甜瓜果實中的有機酸主要是檸檬酸[7，8]，其含量占果實鮮質(zhì)量的1.0%，而傳統(tǒng)甜瓜僅為0.2%[9]。研究表明，甜瓜中有機酸含量由主基因和多基因控制，而檸檬酸合成酶、乙烯、Ca2+-CaM信號系統(tǒng)這3類基因的上調(diào)表達均與檸檬酸積累有關(guān)[3]。湯謐[9]以風(fēng)味3號甜瓜為研究對象，發(fā)現(xiàn)PEPC（檸檬酸合酶）、CS（丙酮酸羧化酶）、IDH（異檸檬酸合酶）和MDH（蘋果酸脫氫酶）這4種酶活性變化與檸檬酸含量的變化呈顯著相關(guān)。可見，在植物細胞中，檸檬酸的積累不是單一的某一生化反應(yīng)的結(jié)果，而是一系列生理過程的綜合結(jié)果。

1.2 其他園藝作物中的檸檬酸代謝

檸檬酸代謝特性在柑橘類研究中已比較成熟。孫琦[10]指出檸檬酸降解有2條途徑：一條途徑是在順烏頭酸酶（ACO）的催化下被轉(zhuǎn)化為異檸檬酸，另一條途徑是在ATP-檸檬酸裂解酶（ATP-CL）的作用下，被分解為草酰乙酸和乙酰輔酶A。此外，檸檬酸通過谷氨酸代謝途徑也從兩方面實現(xiàn)了轉(zhuǎn)化和減酸，一是在GAD（谷氨酸脫羧酶）的作用下，檸檬酸進入GABA（γ-氨基丁酸） 循環(huán)而被消耗，二是在GS（谷氨酰胺合成酶）的催化下形成谷酰胺，進入氨基酸代謝途徑。檸檬酸在柑橘中的代謝機制表現(xiàn)為檸檬酸→異檸檬酸、酮戊二酸和谷氨酸，此后谷氨酸被分解（分解代謝的途徑為谷氨酸→GABA→琥珀酸半醛→琥珀酸）或者用于合成谷氨酸鹽[9]。在研究檸檬酸與蘋果酸的轉(zhuǎn)運途徑時，Rafaelr等[11]主要研究了其在檸檬酸通道中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘋果酸能強烈地抑制檸檬酸離子通道運輸，但對依賴ATP的檸檬酸轉(zhuǎn)運影響很小，因此認(rèn)為在柑橘果肉細胞中，檸檬酸及蘋果酸進入液泡的通道相同。檸檬酸從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到液泡時，需要通過液泡上的H+-ATP酶（V-ATPase）調(diào)節(jié)，同時在轉(zhuǎn)運的過程中也伴隨著質(zhì)子的流動[12]。

2 風(fēng)味甜瓜中調(diào)控檸檬酸代謝的主要基因研究進展

雖然對于風(fēng)味甜瓜果實中檸檬酸的代謝機制的研究尚不清楚，但目前運用分子標(biāo)記等現(xiàn)代生物技術(shù)已挖掘了其中的一些關(guān)鍵基因。Cohen等[13]將與檸檬酸含量有關(guān)的數(shù)量性狀位點（QTL）定位到連鎖群上，結(jié)果檢測到5個和檸檬酸含量有關(guān)的QTLs，其分別位于LGⅣ、LGⅧ、LGⅪ、LGⅫ上。朱慧芹[14]利用六世代聯(lián)合分離分析法發(fā)現(xiàn)，檸檬酸含量受1對加性-顯性主基因和加性-顯性上位性多基因（D-O）控制。朱慧芹等[15]以口感酸甜味差異明顯的甜瓜品種為研究對象，定位了3個與檸檬酸含量有關(guān)的QTL（cit7.1、cit8.1、cit8.2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)其分別位于LGⅦ、LGⅧ上；林瓊[16]發(fā)現(xiàn)在柑橘中，其檸檬酸降解以谷氨酰胺途徑為主，而最有可能與CitCHX、CitAL-MT和CitDIC這3個轉(zhuǎn)運蛋白基因有關(guān)。

3 RNA-seq技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀及其在主要作物中的應(yīng)用

3.1 RNA-seq技術(shù)及其發(fā)展現(xiàn)狀

RNA-seq就是通過高通量測序技術(shù)，檢測mRNA、smallRNA、LncRNA等的序列信息，研究其表達水平的一種方法。現(xiàn)如今，高通量測序技術(shù)已廣泛運用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域，并在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域獲得諸多成果。例如在果蔬作物的研究中，已完成對葡萄、番木瓜、蘋果、草莓、香蕉、梨、甜橙、克里曼丁柑橘和桃等作物的全基因組測序，這有助于在相關(guān)物種上開展基因和啟動子挖掘、分子遺傳標(biāo)記開發(fā)、全基因組關(guān)聯(lián)分析、比較基因組學(xué)等研究[17]。轉(zhuǎn)錄組是連接基因組與代謝組的紐帶，轉(zhuǎn)錄組測序是對已完成全基因組測序物種進行深入研究的有效方法[18]。相較于基因組學(xué)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)針對的是被轉(zhuǎn)錄表達的部分特定基因，其研究范圍縮小，針對性更強。

與傳統(tǒng)的EST測序或芯片技術(shù)相比，RNA-seq技術(shù)對轉(zhuǎn)錄物及其可變剪切體表達水平的檢測更加精確，并有助于新的基因、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的發(fā)掘及基因結(jié)構(gòu)變化的發(fā)現(xiàn)。因此，RNA-seq被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄組研究的一個革命性工具[19，20]。目前應(yīng)用比較普遍的測序平臺是Illumina，如運用HiSeq 2000測序儀，采用邊合成邊測序的技術(shù)手段，能同時檢測數(shù)億條序列信息，并對表達豐度極低的序列有較好的檢測效果[21]。

3.2 RNA-seq 技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用

對于已知全基因組序列的物種，比對轉(zhuǎn)錄組測序信息，可以研究基因的表達差異、結(jié)構(gòu)變化，并發(fā)現(xiàn)新基因。近年來，該技術(shù)得到廣泛運用，并取得了良好結(jié)果。Filichkin 等[22]對擬南芥（Arabidopsis thaliana）轉(zhuǎn)錄組進行測序，發(fā)現(xiàn)至少42%的內(nèi)含子基因存在可變剪接；Zhang等[23]對水稻（Oryza sativa）轉(zhuǎn)錄組進行深度測序，發(fā)現(xiàn)了7 232個有組織特異性的新轉(zhuǎn)錄本和23 800個可變剪接，為分析水稻復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄機制提供了廣泛的依據(jù)；李瀅等[24]應(yīng)用Roche 454（GS FLX Titanium System）對二年生丹參根的轉(zhuǎn)錄組進行測序，研究其基因表達譜，挖崛其功能基因，共獲得18 235條Unigene，其中，13 980條Unigene為首次發(fā)現(xiàn)。于安民[25]采用高通量RNA-seq測序技術(shù)，首次獲得了陽春砂的轉(zhuǎn)錄組信息和3個不同發(fā)育期果實的表達譜信息，為陽春砂果實發(fā)育過程中糖和萜類代謝的研究提供了重要的遺傳信息，為深入研究陽春砂果實發(fā)育及次生代謝調(diào)控的分子機制奠定了重要基礎(chǔ)。

3.3 RNA-seq 技術(shù)在園藝作物中的應(yīng)用

Zenoni等[26]通過Illumina GA Ⅱ測序平臺，對葡萄（Vitis vinifera）坐果、著色、成熟3個發(fā)育期的果實進行轉(zhuǎn)錄組研究，通過與參考基因組比對，發(fā)現(xiàn)了多個MYB轉(zhuǎn)錄因子家族、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶家族的新基因以及可變剪接。楊侃侃[27]通過RNA-seq技術(shù)，檢測了黃皮、綠皮西瓜在不同生長時期的基因表達變化，發(fā)現(xiàn)差異表達的基因主要體現(xiàn)在細胞組成、分子功能、生物過程等方面。馮超[28]對楊梅不同時期的果實進行RNA-seq，分析了楊梅的密碼子偏好性并鑒定出4個高頻密碼子，檢測到果實成熟期蔗糖累積和有機酸降解的關(guān)鍵基因，分別是蔗糖磷酸合成酶（SPS）基因和GAD基因；對不同有機酸含量的楊梅品種進行進一步RNA-seq發(fā)現(xiàn)，液泡H+-ATPase（V-ATPase）B亞基的基因可能對不同品種楊梅的有機酸含量起決定作用。魏海蓉[29]通過對不同品種的櫻桃進行RNA-seq，共發(fā)現(xiàn)18個與花青素生物合成相關(guān)的基因。

4 RNA-seq技術(shù)在甜瓜中的應(yīng)用及對果實檸檬酸代謝特性的分析展望

高通量測序技術(shù)在甜瓜的研究中也有著廣泛的應(yīng)用。2012年甜瓜基因組測序完成，為關(guān)鍵基因發(fā)掘奠定了重要基礎(chǔ)。牛鵬輝[30]通過對甜瓜的全基因組數(shù)據(jù)分析，共鑒定出56個轉(zhuǎn)錄因子基因家族，并篩選出14個候選的內(nèi)參基因。陳嘉貝等[31]對在鹽脅迫環(huán)境下不同品種甜瓜進行RNA-seq分析，共發(fā)現(xiàn)27個響應(yīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄因子，其中18個轉(zhuǎn)錄因子表達量下調(diào)，9個上調(diào)。

目前，檸檬酸代謝的調(diào)控機制還不明確，也只是運用傳統(tǒng)的分子標(biāo)記來進行基因定位。而利用RNA-seq技術(shù)進行全基因組測序已成為時代的潮流，運用RNA-seq技術(shù)研究甜瓜果實檸檬酸代謝特性，并挖掘其中主要的調(diào)控基因，將會為豐富風(fēng)味甜瓜的品質(zhì)研究提供可能。

鑒于如今RNA-seq技術(shù)的快速發(fā)展，以及RNA-seq技術(shù)自身的優(yōu)勢，已在很多物種上開展基因和啟動子挖掘、分子遺傳標(biāo)記開發(fā)、全基因組關(guān)聯(lián)分析、比較基因組學(xué)的研究。在甜瓜檸檬酸代謝研究中運用RNA-seq技術(shù)，將有助于在甜瓜中挖掘更多調(diào)控檸檬酸代謝的基因。下一步我們的研究也將引入轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究策略，對不同發(fā)育時期（前期、中期、后期）的果實進行RNA-seq測序，系統(tǒng)研究果實發(fā)育不同階段的轉(zhuǎn)錄組變化，對基因的差異表達進行分析，發(fā)現(xiàn)差異表達基因所參與的主要生物學(xué)過程，挖掘與檸檬酸代謝有關(guān)的基因，構(gòu)建相關(guān)基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，分析相關(guān)基因在果實不同發(fā)育時期的表達水平，同時測定相關(guān)基因編碼酶在果實不同發(fā)育時期的活性以及檸檬酸含量，為揭示風(fēng)味甜瓜檸檬酸積累的分子機制奠定基礎(chǔ)，也為豐富甜瓜果實的品質(zhì)研究提供可能。

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