生物酶提取申嗪霉素工藝的研究

姚陳偉

(上海農(nóng)樂(lè)生物制品股份有限公司，上海201419)

生物酶提取申嗪霉素工藝的研究

姚陳偉

(上海農(nóng)樂(lè)生物制品股份有限公司，上海201419)

申嗪霉素是一種廣譜抗真菌類(lèi)微生物源抗生素，在田間使用中低毒、無(wú)殘留。研究了生物酶法提取申嗪霉素精品，利用生物酶安全環(huán)保無(wú)毒性的特點(diǎn)，在不同溫度和添加量的情況下，研究溶解酶和凝聚酶的最適溫度和最佳添加量。結(jié)果表明，溶解酶30 ℃、添加量7%和凝聚酶25 ℃、添加量6%時(shí)，采用這一提純工藝方法可以顯著提高申嗪霉素的純度，純度達(dá)到90%以上。

申嗪霉素；溶解酶；凝聚酶；安全；環(huán)保；純度

申嗪霉素(phenazine-1-carboxlic Acid，PCA)是熒光假單胞菌分泌的一種微生物源殺菌劑，具有廣譜抗菌作用，能夠預(yù)防和治療多種農(nóng)作物根際土傳病害和多種真菌病害(如西瓜枯萎病、辣椒疫病、小麥根腐病、水稻紋枯病、水稻稻曲病、水稻稻瘟病等)。同時(shí)，申嗪霉素具有毒性低、對(duì)生態(tài)環(huán)境友好，在農(nóng)作物中殘留少，用量少，效果好等特點(diǎn)。

圖1 申嗪霉素結(jié)構(gòu)式

申嗪霉素市場(chǎng)前景廣闊。它的制劑為水懸浮劑，為水基化環(huán)保新劑型。這種劑型對(duì)申嗪霉素原藥的純度要求很高，如果申嗪霉素原藥的純度達(dá)不到要求，就會(huì)嚴(yán)重影響水懸浮劑產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性。經(jīng)過(guò)創(chuàng)新生物技術(shù)的菌株改造、優(yōu)化、篩選，申嗪霉素產(chǎn)品技術(shù)水平不斷提升，目前大生產(chǎn)中申嗪霉素的發(fā)酵單位可達(dá)5 000 mg/L以上。但是申嗪霉素發(fā)酵液成分復(fù)雜，培養(yǎng)基殘?jiān)?、菌絲體和大量的雜質(zhì)都使得發(fā)酵液的提取變得困難重重，要想得到純度高的申嗪霉素更是難上加難。因此取得高純度的申嗪霉素原藥，必須進(jìn)行高難度的技術(shù)攻關(guān)。

申嗪霉素是一種完全自主創(chuàng)新的生物農(nóng)藥，目前對(duì)申嗪霉素的分離和純化的研究非常有限，研究人員還是采用化學(xué)法提純工藝?；瘜W(xué)法提純工藝中使用的化學(xué)有機(jī)溶劑具有脂溶性，除經(jīng)呼吸道和消化道進(jìn)入人體外，還可經(jīng)皮膚被人體迅速吸收?；瘜W(xué)有機(jī)溶劑進(jìn)入人體后將作用于富含脂類(lèi)物質(zhì)的神經(jīng)、血液系統(tǒng)，以及肝腎等實(shí)質(zhì)臟器，對(duì)人體造成直接傷害?；瘜W(xué)有機(jī)溶劑對(duì)皮膚和黏膜也有明顯的刺激性，并對(duì)人體有致癌、致突變、致畸變的嚴(yán)重危害。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，發(fā)展中國(guó)家每年約有50萬(wàn)人遭受化學(xué)物質(zhì)危害，有近5 000人死亡。除此以外，化學(xué)有機(jī)溶劑的使用對(duì)環(huán)境的破壞作用嚴(yán)重。更加之，化學(xué)有機(jī)溶劑的生產(chǎn)也是重要的安全隱患源，是造成安全事故的重要原由。在申嗪霉素產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程中，采用安全環(huán)保的提純工藝刻不容緩。

經(jīng)過(guò)技術(shù)創(chuàng)新，申嗪霉素的提取技術(shù)有較大的提高。從綠色、生物的角度出發(fā)，以生物酶為主要的介質(zhì)，進(jìn)行申嗪霉素發(fā)酵液的分離，并不斷優(yōu)化目的物質(zhì)的提純工藝，使產(chǎn)品的純度達(dá)到預(yù)定的指標(biāo)。

生物酶是一種無(wú)毒、對(duì)環(huán)境友好的生物催化劑，其化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)。生物酶的生產(chǎn)和應(yīng)用，在國(guó)內(nèi)外已具有80多年歷史。20世紀(jì)80年代后，酶的制造和應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大。生物工程作為一門(mén)新興高新技術(shù)在我國(guó)得到了迅速發(fā)展，酶在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用日漸成熟?，F(xiàn)在生物酶處理工藝已被公認(rèn)為是一種符合環(huán)保要求的綠色生產(chǎn)工藝，它使發(fā)酵工業(yè)工藝得到改善和提高。同時(shí)生物酶具有無(wú)毒無(wú)害，可生物降解，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，有利于生態(tài)的維護(hù)，生產(chǎn)過(guò)程安全等很多優(yōu)點(diǎn)而成為發(fā)酵液提取工藝創(chuàng)新研究的熱點(diǎn)。

筆者采用生物酶降解分離純化法，能夠有效解決分離純化和環(huán)境保護(hù)、安全生產(chǎn)等諸多難題，并且以較低的成本獲得較高純度的申嗪霉素。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

⑴ 申嗪霉素粗品(上海農(nóng)樂(lè)生物制品股份有限公司自行生產(chǎn))

申嗪菌株搖瓶培養(yǎng)后經(jīng)20 t發(fā)酵罐罐體發(fā)酵，發(fā)酵液簡(jiǎn)單固液分離烘干后，粉碎得到申嗪霉素粗品。

⑵ 生物溶解酶RJM02、凝聚酶NJM05(上海農(nóng)樂(lè)生物制品股份有限公司)、化學(xué)試劑乙腈、冰乙酸。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備與分析儀器

高效液相色譜儀(島津)、C18柱、臺(tái)式離心機(jī)(TGL-16B，上海安亭科學(xué)儀器廠)、超聲波清洗器(2101T，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)、隔膜真空泵(GM-0.15，天津市騰達(dá)過(guò)濾器件廠)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粉碎、溶解

將含量在40%～50%左右的申嗪霉素粗品進(jìn)行粉碎，加水?dāng)嚢柘♂專(zhuān)砑铀堪凑?00倍的液固重量比例，加水后攪拌2～3 h使其充分溶解。

考察在不同溫度以及不同添加量的條件下添加溶解酶RJM02，研究申嗪霉素的溶解性，找出最適溫度和最佳添加量。添加時(shí)攪拌器的攪拌速度為200 rpm，攪拌時(shí)間為0.5 h，使稀釋液充分溶解，該程序完成后進(jìn)行板框過(guò)濾，過(guò)濾壓力0.1 MPa，收集過(guò)濾液備用。

1.2.2 過(guò)濾液結(jié)晶

對(duì)不同溫度下生物凝聚酶NJM05(上海農(nóng)樂(lè)生物制品股份有限公司生產(chǎn))的活性進(jìn)行研究，生物凝聚酶NJM05加入量為5%～7%(重量比計(jì))，在最適溫度和最佳添加量條件下添加凝聚酶。加入時(shí)以100 rpm轉(zhuǎn)速攪拌使之均勻，攪拌時(shí)間為2 h，攪拌完成后靜置6 h使之充分結(jié)晶，然后板框過(guò)濾，過(guò)濾時(shí)板框壓力為0.05 MPa。

1.2.3 烘干、粉碎成品

結(jié)晶液過(guò)濾板框后，申嗪霉素結(jié)晶品形成濾餅留在板框?yàn)V布上，收集結(jié)晶品，然后將結(jié)晶品送入烘房烘干，粉碎，就得到需要的成品。

1.2.4 測(cè)定

HPLC法測(cè)定申嗪霉素的效價(jià)(含量)。色譜條件：C18柱，流動(dòng)相(體積比，乙腈︰水︰冰醋酸= 40︰60︰0.2)，檢測(cè)波長(zhǎng)：248 nm，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

取溶解液40 μL于1.5 mL離心管中，加入960 μL乙腈超聲溶解5 min，離心機(jī)10 000 rpm離心5 min，取離心管上清液進(jìn)樣，檢測(cè)，PCA含量為90%左右。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物溶解酶作用溫度選擇

生物酶主要作用機(jī)理是誘導(dǎo)契合，當(dāng)?shù)孜锝Y(jié)合到酶的活性部位時(shí)，酶的構(gòu)象有一個(gè)改變。底物誘導(dǎo)酶蛋白構(gòu)象的變化，導(dǎo)致催化基團(tuán)的正確定位與底物結(jié)合到酶的活性部位上去。

圖2 PCA液相檢測(cè)圖譜

表1 不同溫度下RJM02對(duì)申嗪霉素的水解作用

在30 ℃左右時(shí)，底物能夠最大限度與酶結(jié)合，說(shuō)明在此溫度下酶的活性最高，能夠有效結(jié)合目標(biāo)產(chǎn)物。

2.2 凝聚酶作用的最適溫度

凝聚酶于水中與目標(biāo)產(chǎn)物發(fā)生酶促反應(yīng)，凝聚成晶體使之發(fā)生沉淀。申嗪霉素形成有效結(jié)晶體之后通過(guò)板框過(guò)濾，形成的濾餅即為純度較高的申嗪霉素。

絮凝酶NJM05在溫度25 ℃，添加量6%時(shí)，申嗪霉素能夠最大限度形成有效晶體，回收率最高。

3 結(jié) 論

試驗(yàn)研究表明，溫度為30 ℃時(shí)申嗪霉素在溶解酶RJM02作用下保持溶解，然后用生物絮凝酶NJM05在25 ℃左右結(jié)晶，能以最大收率回收目標(biāo)產(chǎn)物，目標(biāo)產(chǎn)物純度為90%左右。生物酶工藝達(dá)到了提取純化申嗪霉素和保護(hù)環(huán)境，安全生產(chǎn)的多重效果。

表2 NJM05在不同溫度下的結(jié)晶效果

試驗(yàn)表明，生物酶技術(shù)在改進(jìn)生產(chǎn)工藝，節(jié)約能耗，安全生產(chǎn)，減少環(huán)境污染，提高產(chǎn)品質(zhì)量，增加附加值和開(kāi)發(fā)新型原料的產(chǎn)品等方面都具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。隨著技術(shù)的進(jìn)步，生物酶技術(shù)將在各種領(lǐng)域的工程技術(shù)中得到更廣泛的應(yīng)用。

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Study on the Application of the Biological Enzyme in the Extracting Process of Phenazine-1-carboxylic Acid

YAO Chen-wei
(Shanghai Nongle Biological Products Co., Ltd., Shanghai 201418, China)

Phenazine-1-carboxylic acid is a broad-spectrum antifungal microbe derived antibiotics in the field are in use, low toxicity and no residue. This paper studies the enzymatic extraction of phenazine-1-carboxylic acid products, using non-toxic environmentally safe biological enzyme, in different temperature and adding quantity, the optimum temperature and optimum amount study on the dissolving enzyme and condensed enzyme. The experiment showed that lytic enzyme addition of 7% at 30 ℃ and at 25 ℃ 6% addition of enzyme condensation, the purification process can significantly improve the purity of phenazine-1-carboxylic acid, reached more than 90%.

phenazine-1-carboxylic acid; dissolve enzyme; condensation enzyme; security; environmental protection; purity

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2016.06.04

TQ450

：A

1009-6485(2016)06-0025-03

姚陳偉(1982—)，男，漢族，工程師，主要從事細(xì)菌、放線菌的培養(yǎng)和工業(yè)化生產(chǎn)工作。Tel： 021-37571353，E-mail： gxjcxp@126.com。

2016-10-25。