靈芝液體深層發(fā)酵高產(chǎn)胞內(nèi)多糖菌株的篩選及其動(dòng)力學(xué)研究

王國瑞，馮 杰，馮 娜，唐傳紅，張勁松*

（1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家食用菌工程技術(shù)研究中心，國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 201403）

靈芝液體深層發(fā)酵高產(chǎn)胞內(nèi)多糖菌株的篩選及其動(dòng)力學(xué)研究

王國瑞1，2，馮 杰2，馮 娜2，唐傳紅2，張勁松2*

（1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家食用菌工程技術(shù)研究中心，國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 201403）

對實(shí)驗(yàn)室保藏的72株靈芝菌株液體深層發(fā)酵的終生物量和胞內(nèi)多糖兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行了分析，以胞內(nèi)多糖得率為依據(jù)，篩選出了其中得率最高的G0041，G0045和G0059菌株，得率分別為（2.39±0.06）g/L、（2.28± 0.03）g/L和（2.74±0.12）g/L，且3菌株在5%和1%水平上均存在顯著性差異。對3個(gè)菌株進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模型構(gòu)建，得到了菌絲體生長、產(chǎn)物胞內(nèi)多糖生成和底物葡萄糖消耗的動(dòng)力學(xué)方程和方程參數(shù)；方程的建立為后續(xù)靈芝液體深層發(fā)酵胞內(nèi)多糖的優(yōu)化及其規(guī)?；a(chǎn)提供了理論研究基礎(chǔ)。

靈芝；胞內(nèi)多糖；液體深層發(fā)酵；發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

靈芝（Ganoderma lucidum Karst.），屬擔(dān)子菌綱（Basidiomycota）、多孔菌目（Polyporales）、靈芝科（Ganodermataceae）、靈芝屬（Ganoderma），是一種藥、食兩用真菌。靈芝多糖是靈芝的主要活性成分之一，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、抗輻射、抗疲勞等多種生物活性。靈芝多糖的研究一直受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，已分離到的有200多種，大部分為β-型的葡聚糖，少數(shù)為α-型的葡聚糖［1］。

目前，靈芝的發(fā)酵生產(chǎn)主要有固體培養(yǎng)法和液體深層發(fā)酵法。液體深層發(fā)酵具有不受季節(jié)影響，生產(chǎn)周期短，顯著提高生產(chǎn)效率等優(yōu)點(diǎn)，受到人們的廣泛關(guān)注，液體深層發(fā)酵技術(shù)成為獲取靈芝多糖類化合物的重要手段。Hsieh等［2］報(bào)道了在靈芝菌絲液體深層發(fā)酵中，氮限制能提高多糖的產(chǎn)量；Tang等［3］發(fā)現(xiàn)鎂離子和鉀離子能夠提高塊菌中的多糖含量；袁術(shù)斌［1］對不同靈芝菌株進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)液態(tài)發(fā)酵靈芝菌絲體胞內(nèi)多糖含量最高的菌株含量可達(dá)到15.4%，胞外多糖含量最高的可達(dá)到14.2%；喬雙逵［5］研究發(fā)現(xiàn)，液體發(fā)酵中，靈芝胞外多糖在第5天積累到最高值，為0.472 g/L，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，多糖產(chǎn)量降至最低值0.108 g/L；Fang等［6］發(fā)現(xiàn)小菌球有利于靈芝多糖的合成，當(dāng)靈芝菌球直徑分別為＜1.2 mm、1.2—1.6 mm及＞1.6 mm，其單位菌體胞內(nèi)多糖產(chǎn)量分別為85 mg/g、69 mg/g、55 mg/g；王磊等［1］對8種靈芝菌株進(jìn)行篩選，其中濟(jì)寧圓芝菌絲體中多糖含量最高，為117.59 μg/mg；宋頻然等［3］篩選出1株強(qiáng)耐自身代謝產(chǎn)物胞外多糖反饋抑制、高產(chǎn)胞外多糖的靈芝菌株GL029，該菌株的胞外多糖產(chǎn)量達(dá)3.07 g/L；Zhu等［2］在培養(yǎng)中加入從菌塊中提取的多糖和蛋白激發(fā)因子，胞內(nèi)多糖的含量和產(chǎn)量分別達(dá)到了（12.91±1.05）mg/（100 mg）和（1.94±0.18）g/L。

之前的研究報(bào)道中大多都是對靈芝液體深層發(fā)酵優(yōu)化靈芝菌絲體的生產(chǎn)量以及胞外多糖產(chǎn)量的研究［10-13］，但是對靈芝菌絲體液態(tài)發(fā)酵過程中菌絲體生長的變化，底物的利用，以及胞內(nèi)產(chǎn)物靈芝多糖的過程變化的系統(tǒng)研究則較少。系統(tǒng)研究靈芝菌絲體液體深層發(fā)酵的過程變化對于菌絲體生長的控制和調(diào)控靈芝多糖的產(chǎn)量具有重要的意義。通過液體深層發(fā)酵對實(shí)驗(yàn)室保藏的72株靈芝菌株進(jìn)行篩選，以期獲得高產(chǎn)胞內(nèi)多糖的靈芝菌株，在前期篩選的基礎(chǔ)上對獲得的高產(chǎn)菌株進(jìn)行動(dòng)力學(xué)的研究，構(gòu)建其動(dòng)力學(xué)模型，通過動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)的解析，進(jìn)一步了解靈芝液體深層發(fā)酵過程的動(dòng)態(tài)變化，為后續(xù)的優(yōu)化和規(guī)模化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 高產(chǎn)胞內(nèi)多糖菌株的篩選

1．1 材料與方法

1.1.1 供篩選菌株

供篩選菌株的編號(hào)、名稱、來源見表1。

表1 供試靈芝菌株編號(hào)、名稱和來源Table 1 Codes，names and sources of G．lucidum strains tested

（續(xù)表1）

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)備

酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek公司Biotek-Synergy HT多功能酶標(biāo)儀；離心機(jī)，美國Beckman公司Allegretm25R Centrifuge離心機(jī)；搖床，上海杜科自動(dòng)化設(shè)備有限公司DKY-Ⅱ恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司LRH-250生化培養(yǎng)箱。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），美國BD公司生產(chǎn)，稱取39 g固體粉末溶于1 000 mL蒸餾水，121℃滅菌15 min。

液體種子培養(yǎng)基：豆餅粉20 g/L；葡萄糖25 g/L；MgSO4·7H2O 1.5 g/L；KH2PO43 g/L；pH 5.4，121℃滅菌30 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：豆餅粉20 g/L；葡萄糖20 g/L；可溶性淀粉10 g/L；MgSO4·7H2O 1.5 g/L；KH2PO43 g/L；pH 5.4，121℃滅菌30 min。

1．2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

將菌種在固體平板上進(jìn)行活化，26℃培養(yǎng)7 d，待菌絲布滿平板后，挑取黃豆大小的菌塊接入種子培養(yǎng)基中，然后置于旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)6—8 d（150 r/min，26℃），待小菌球基本布滿搖瓶；從搖床上取下?lián)u瓶，按定量接種法將每個(gè)菌株接到發(fā)酵培養(yǎng)基中（接種量10%），在搖床上培養(yǎng)8 d（150 r/min，26℃），本試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 菌絲體生物量的測定

取適量發(fā)酵培養(yǎng)液將其在15 317 g下離心20 min，收集菌絲體于60℃烘箱烘干至恒重，稱重，求3個(gè)重復(fù)的平均值，以g/L計(jì)量。

1.2.3 菌絲體中含胞內(nèi)多糖粗提液的制備

將烘干后的靈芝菌絲體研磨成粉末，稱取100 g加入100 mL蒸餾水，沸水浴提取3 h。冷卻后定容至100 mL，將溶液在15 317 g下離心15 min后取上清液備用［14］。

1.2.4 總糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法［15］。

1.2.5 還原糖含量的測定

采用3，5-二硝基水楊酸法［16］。

1．3 靈芝液體深層發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的構(gòu)建

發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是研究發(fā)酵過程中菌體濃度、底物濃度和產(chǎn)物濃度等狀態(tài)變量隨發(fā)酵時(shí)間變化規(guī)律及控制變量之間的關(guān)系。研究靈芝液體深層發(fā)酵動(dòng)力學(xué)可以清楚地了解發(fā)酵過程的動(dòng)態(tài)變化。

1.3.1 菌體生成動(dòng)力學(xué)模型的構(gòu)建

本試驗(yàn)中選擇Logistic［17］方程建立發(fā)酵過程菌絲體生長的動(dòng)力學(xué)模型，方程如下：

當(dāng)t＝0時(shí)，X＝X0為初始條件，（1-1）積分變形后為：

兩邊同時(shí)取對數(shù)得：

對方程（1-3）采用擬線性法作圖，直線的斜率為μm，截距為－ln（Xm/X0－1）。

式中：X——菌體干重（g/L）；X0——菌體的初始生物量（g/L）；Xm——菌體的最大生物量（g/L）；μm——最大比生長速率（h－1）；t——發(fā)酵時(shí)間（h）

1.3.2 產(chǎn)物生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)模型的建立

靈芝發(fā)酵產(chǎn)生胞內(nèi)多糖與菌體的生長屬于部分相關(guān)的關(guān)系，可采用Luedeking-Piret［17］模型表示：

積分變換，結(jié)合（1-2）式得：

兩邊同時(shí)取對數(shù)，有

采用擬線性法求取參數(shù)α和β。

式中：P——產(chǎn)物（胞內(nèi)多糖）的濃度（g/L）；P0——產(chǎn)物（胞內(nèi)多糖）的初始濃度（g/L）；α、β——常數(shù)

1.3.3 底物消耗動(dòng)力學(xué)模型的建立

對于葡萄糖消耗模型，采用Luedeking-Piret［17］方程

積分變換后，結(jié)合（1-2）式得：

兩邊同時(shí)取對數(shù)，得：

同樣采取擬線性法求得A和B。

式中：S——基質(zhì)（葡萄糖）的濃度（g/L）；S0——基質(zhì)（葡萄糖）的初始濃度（g/L）；A、B——常數(shù)

1．4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0和DPS v 7.05數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 靈芝菌株液體深層發(fā)酵生理生化指標(biāo)分析

對72株供試菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，分別測定其菌絲體生物量，胞內(nèi)總糖含量和胞內(nèi)還原糖含量，得出胞內(nèi)多糖含量和胞內(nèi)多糖得率。試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

由表2分析可知，生物量較大的分別是G0068、G0099、G0157，含量分別為（21.81±5.75）g/L、（23.16± 2.16）g/L、（21.13±3.17）g/L；多糖含量較高的分別是G0059、G0100、G0195，含量分別為（21.10± 0.18）g/100 g菌絲體、（24.67±0.54）g/100 g菌絲體、（14.60±0.21）g/100 g菌絲體；胞內(nèi)多糖得率較大的分別是G0041、G0045、G0059，含量分別為（2.39±0.06）g/L、（2.28±0.03）g/L、（2.74±0.12）g/L。

表2 不同菌株各參數(shù)試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental results of different strains

菌絲體生物量和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量是判斷菌株性能優(yōu)劣的重要指標(biāo)，在篩選的72株菌株中，上述兩類卻具有不一致性，因此，將兩者統(tǒng)籌考慮，即以胞內(nèi)多糖得率作為篩選依據(jù)，我們將72株菌株中胞內(nèi)多糖得率排名前二十的菌株，即G0059、G0041、G0045、G0100、G0157、G0033、G0186、G0007、G0062、G0047、G0099、G0159、G0154、G0067、G0069、G0063、G0152、G0093、G0003、G0178，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)中顯著性差異分析方法進(jìn)行深入研究。菌株胞內(nèi)多糖得率顯著性分析結(jié)果見表3。

通過差異顯著性分析可知，在5%顯著水平上，G0059、G0041、G0045、G0100和G0157差異顯著；G0157和G0033差異不顯著；G0186和G0007差異不顯著；G0007和G0062差異不顯著；G0062、G0047、G0099、G0159、G0154、G0067、G0069、G0063和G0152差異顯著；G0152和G0093之間差異不顯著；G0093、G0003和G0178差異顯著。在1%顯著水平上，G0059、G0041、G0045、G0100和G0157差異顯著；G0157和G0033差異不顯著；G0186、G0007和G0062差異不顯著；G0062和G0047差異不顯著；G0047、G0099、G0159、G0154、G0067、G0069、G0063和G0152差異顯著；G0152和G0093之間差異不顯著；G0003和G0178差異不顯著。此20株菌株中，G0059胞內(nèi)多糖得率最高，為2.74 g/L，G0178胞內(nèi)多糖得率最低，為1.53 g/L。

表3 20個(gè)菌株胞內(nèi)多糖得率顯著性分析Table 3 Significance test for 20 strains’intracellular polysaccharide yields

圖1 靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體生物量在發(fā)酵過程中的變化Fig．1 Biomass variation of G．lucidum mycelia during liquid submerged fermentation

2．2 高產(chǎn)胞內(nèi)多糖靈芝菌株液體深層發(fā)酵過程研究

以上述研究為基礎(chǔ)，選取胞內(nèi)多糖得率最高的3株菌，即G0059、G0041和G0045進(jìn)行分析研究。對三株菌的菌絲體生物量、還原糖消耗量以及胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的過程曲線進(jìn)行分析，如圖1—3所示。由圖1分析可知，3個(gè)菌株幾乎沒有延滯期，很快進(jìn)入對數(shù)期，在發(fā)酵1 d后進(jìn)入穩(wěn)定期，G0045和G0059穩(wěn)定期均比較長，G0041在第6天生物量又有大幅增長，達(dá)到9.25 g/L。圖2中，3株菌還原糖均在第1天消耗比較快，第8天降到最低點(diǎn)，為17.54 g/L，其中G0059消耗較緩慢，G0045消耗最多。圖3中，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量呈逐漸增加趨勢，G0059第1天增長最快，之后平穩(wěn)增長，G0041和G0045前4 d呈指數(shù)增長，之后平穩(wěn)增長，發(fā)酵第8天達(dá)到最大值，為1.70 g/L。

圖2 靈芝液體深層發(fā)酵培養(yǎng)液中還原糖的消耗Fig．2 Consumption of reducing sugar of G．lucidum liquid submerged fermentation medium

圖3 靈芝液體深層發(fā)酵胞內(nèi)多糖產(chǎn)量Fig．3 Intracellular polysaccharide yield of G．lucidum liquid submerged fermentation

2．3 高產(chǎn)胞內(nèi)多糖靈芝菌株液體深層發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行試驗(yàn)，探討在發(fā)酵罐中分批發(fā)酵靈芝胞內(nèi)多糖的條件和動(dòng)力學(xué)特征，利用發(fā)酵試驗(yàn)數(shù)據(jù)分別求得三個(gè)菌株動(dòng)力學(xué)方程的各個(gè)參數(shù)。以G0041動(dòng)力學(xué)方程參數(shù)求解過程為例，說明參數(shù)求解過程［18-19］。

G0041菌絲體生長動(dòng)力學(xué)方程求解如下：

G0041產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)方程求解如下：

G0041底物消耗動(dòng)力學(xué)方程求解如下：

用同一方法分別求得菌株G0045和G0059的動(dòng)力學(xué)方程參數(shù)，最終所求的參數(shù)結(jié)果如表4所示。

表4 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)估計(jì)值Table 4 Parameter estimation of fermentation kinetic models

由表4分析可知，Xm為菌體的最大生物量，在相同的發(fā)酵條件下，G0041的最大生物量達(dá)到12.479 g/L，相比G0045和G0059分別高出89.19%、169.23%。X0為通過建立動(dòng)力學(xué)模型求得的菌體初始生物量，三株菌相差較小，G0041分別比G0045和G0059高出9.27%、10.85%。μm為最大比生長速率，G0041、G0045、G0059分別達(dá)到了0.518 h－1、0.684 h－1、0.647 h－1，G0045和G0059分別比G0041高出32.05%、24.90%。α表示與菌體生長相關(guān)的產(chǎn)物生成系數(shù)，β表示與菌體濃度相關(guān)的產(chǎn)物生成系數(shù)，三組數(shù)據(jù)中α和β均不為0，靈芝菌絲體發(fā)酵屬于部分相關(guān)模型。A表示菌體生長相關(guān)的底物消耗系數(shù)，B表示與菌體濃度相關(guān)的底物消耗系數(shù)。

由表可見，在菌絲體生長期β非常小，接近于0，其意義為發(fā)酵在對數(shù)生長期，菌體大量生長，而產(chǎn)物只有少量合成，進(jìn)入穩(wěn)定生長期后，產(chǎn)物大量連續(xù)合成，因此發(fā)酵過程應(yīng)屬于部分相關(guān)型發(fā)酵。

將表4所得到的參數(shù)分別代入公式（1-1），（1-4）和（1-7）即可得到G0041，G0045和G0059三株菌的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)方程（表5）。

表5 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)方程Table 5 Fermentation kinetic equations

3 結(jié)論

通過對72株菌株的篩選，獲得高產(chǎn)胞內(nèi)多糖菌株3株，分別為G0041、G0045、G0059。對篩選獲得的3株菌進(jìn)行了詳細(xì)的發(fā)酵過程研究，最大菌絲體生物量達(dá)到（23.16±2.16）g/L，最大胞內(nèi)多糖產(chǎn)量達(dá)到（24.67±0.54）g/100 g菌絲體，最大得率達(dá)到（2.74±0.01）g/L。根據(jù)已有的動(dòng)力學(xué)模型，對篩選獲得的三株菌的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行求解，由動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)得到菌絲體生物量，產(chǎn)物胞內(nèi)多糖合成量，底物葡萄糖消耗量的動(dòng)力學(xué)方程，方程反應(yīng)了三者的變化規(guī)律及其相互關(guān)系。發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立對發(fā)酵過程如何進(jìn)行有效調(diào)控、發(fā)酵工藝的最優(yōu)化，以及最大限度地提高胞內(nèi)多糖產(chǎn)量具有重大的意義。如衛(wèi)功元等［20］研究谷胱甘肽不同溫度下細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)之間的內(nèi)在聯(lián)系，得到谷胱甘肽分批發(fā)酵過程中細(xì)胞濃度的變化同溫度以及底物濃度之間的關(guān)系，并驗(yàn)證了模型的適用性。發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究有助于深入認(rèn)識(shí)和掌握發(fā)酵過程，為確定最佳發(fā)酵工藝條件和建立發(fā)酵過程中菌體濃度、基質(zhì)濃度、溫度、pH、溶氧等工藝參數(shù)的控制方案打下一定的基礎(chǔ)，為設(shè)計(jì)放大發(fā)酵規(guī)模和從分批發(fā)酵過渡到連續(xù)發(fā)酵提供一定的理論支持。發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立對于了解發(fā)酵過程中的動(dòng)態(tài)行為，如菌絲體的生長，碳源和氮源的消耗等起到重要作用，為更加全面深刻地認(rèn)識(shí)G0119發(fā)酵過程及大規(guī)模生產(chǎn)的發(fā)酵優(yōu)化控制提供依據(jù)。

近年來，功能性食品的種類和數(shù)量不斷增多，靈芝多糖的生物活性越來越受到人們關(guān)注，所以，進(jìn)一步全面研究發(fā)酵動(dòng)力學(xué)，了解其發(fā)酵機(jī)理，開發(fā)高附加值的靈芝多糖產(chǎn)品，最大限度地開發(fā)和利用靈芝多糖將成為未來的研究重點(diǎn)。

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（責(zé)任編輯：程智強(qiáng)）

Screening and kinetic study of high-yield intracellular polysaccharide strains of Ganoderma lucidum in liquid submerged fermentation

WANG Guo-rui1，2，F(xiàn)ENG Jie2，F(xiàn)ENG Na2，TANG Chuan-hong2，ZHANG Jing-song2*
（1College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences；Key Laboratory of Southern Edible Fungi Resources and Utilization，Ministry of Agriculture；National Engineering Research Center of Edible Fungi；National R＆D Subcenter for Edible Fungi Processing；Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding，Shanghai 201403，China）

The 72 strains of Ganoderma lucidum preserved in the laboratory were analyzed in terms of final biomass and synthetic intracellular polysaccharide indicators of liquid submerged fermentation，and 3 highest yield strains（G0041，G0045 and G0059）were selected according to intracellular polysaccharide yield，their yields being（2.39±0.06）g/L，（2.28±0.03）g/L and（2.74±0.12）g/L respectively and significantly different at 5%and 1%levels.The 3 strains’kinetic models were also established，obtaining their kinetic equations and equation parameters of mycelial growth，intracellular polysaccharide production and glucose consumption.The established equations provided a subsequent research basis for G.lucidum liquid submerged fermentation optimization and mass production.

Ganoderma lucidum；Intracellular polysaccharide；Liquid submerged fermentation；Fermentation kinetics

S567.3；S646

A

1000-3924（2016）06-010-08

2015-10-22

上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目［滬農(nóng)科攻字（2016）第5-4號(hào)］

王國瑞（1989—），女，在讀碩士，研究方向：藥用真菌

*通信作者，E-mail：syja16＠saas.sh.cn