miR-128b對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖、遷移和侵襲的影響

張 章， 熊左雋， 范明波， 陳 文

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院神經(jīng)外科，武漢 430014

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miR-128b對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖、遷移和侵襲的影響

張 章， 熊左雋， 范明波， 陳 文△

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院神經(jīng)外科，武漢 430014

目的 研究miR-128b對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖、遷移及侵襲的影響。方法 Real-time PCR測定miR-128b在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251及正常星形膠質(zhì)細(xì)胞系HA1800中的表達(dá)。將U251細(xì)胞分為3組，即miR-128b類似物組、miR-128b抑制劑組及對照組，分別轉(zhuǎn)染miR-128b mimics、抑制劑及microRNA scramble。轉(zhuǎn)染24 h后，Real-time PCR檢測3組細(xì)胞中miR-128b的表達(dá)水平。通過MTT實驗、克隆形成實驗測定細(xì)胞增殖；通過細(xì)胞劃痕實驗、Transwell小室基質(zhì)滲透實驗測定細(xì)胞遷移及侵襲能力。結(jié)果 miR-128b在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251較正常星形膠質(zhì)細(xì)胞系HA1800低表達(dá)，為HA1800的(0.21±0.03)倍(P<0.01)。轉(zhuǎn)染24 h后，miR-128b類似物組miR-128b較對照組表達(dá)量顯著升高，為對照組的(9.16±0.85)倍(P<0.01)，miR-128b抑制劑組較對照組表達(dá)量顯著降低，為對照組的(0.32±0.03)倍(P<0.01)。MTT結(jié)果示：miR-128b類似物組A490 nm值在24、48和72 h顯著低于對照組和miR-128b抑制劑組；培養(yǎng)72 h后，miR-128b類似物組克隆形成率為(24.67±2.82)%，對照組為(52.48±5.86)%，miR-128b抑制劑組為(82.63±9.14)%，3組比較，miR-128b類似物組的克隆形成率顯著低于對照組及miR-128b抑制劑組(P<0.05，P<0.01)。miR-128b類似物組、miR-128b抑制劑組及對照組劃痕愈合率分別為(31.24±3.72)%、(88.74±7.52)%及(62.37±4.33)%，miR-128b類似物組的劃痕愈合率顯著低于對照組及miR-128b抑制劑組(P<0.05)。miR-128b類似物組、miR-128b抑制劑組及對照組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為每個100倍視野下(278±28)個、(696±43)個及(463±37)個，miR-128b類似物組的遷移細(xì)胞數(shù)顯著少于對照組及miR-128b抑制劑組(均P<0.05)。結(jié)論 miR-128b抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖、遷移及侵襲，有望作為一個新的治療靶點。

miR-128b； 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤； 增殖； 遷移； 侵襲

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是一種神經(jīng)系統(tǒng)常見惡性腫瘤[1]。盡管近年來手術(shù)、放療及化療等治療手段取得了顯著進(jìn)步，但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的平均生存時間仍只有9～12個月[2]，預(yù)后仍較差。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療的難點[3]。進(jìn)一步闡明膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)病機制對研發(fā)新的分子靶向藥具有重要的意義。miRNA是一種真核細(xì)胞的小RNA，長度在19～22 nt之間，其可在后轉(zhuǎn)錄水平與靶基因的3′端靶向結(jié)合而降解或者下調(diào)信使RNA表達(dá)[4]。miR-128b是miR-128超家族中的一員，miR-128b在多種腫瘤中異常表達(dá)，并廣泛參與腫瘤生物學(xué)的各個過程[5]。然而，miR-128b對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖、遷移和侵襲的影響尚不清楚。本研究在體外實驗中探討miR-128b對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖、遷移及侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251及正常星形膠質(zhì)細(xì)胞系HA1800購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，microRNA scramble、miR-128b mimics及miR-128b抑制劑均由廣州銳博公司定制合成，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 實時定量PCR

從培養(yǎng)細(xì)胞中提取總miRNA。按TaqMan miRNA reverse transcription kit(ABI，USA)說明書，從5 ng的總miRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。miR-128b引物序列：上游引物5′-UCACAGUGAACCGGUCUCUUU-3′，下游引物5′-AGAGACCGGUUCACGGUGAUU-3′；以U6小核RNA作為內(nèi)參，U6序列：上游引物5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATAT-3′，下游引物5′-AAAAATATGGAACGCTTCACGAA-3′。所得產(chǎn)物在ABI 7500實時定量PCR儀中，使用2-ΔΔCt方法定量，計算miR-128b的相對表達(dá)量。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

將U251細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)液(添加10%胎牛血清以及抗生素)，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后傳代。將細(xì)胞分為miR-128b陰性對照組、miR-128b類似物組、miR-128b抑制劑組及對照組，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒、pcDNA6.2-GW/miR-128b mimics、DNA6.2-GW/miR-128b inhibitor及DNA6.2-GW /microRNA scramble，使用Lipofectamine 2000 reagent進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 MTT實驗

細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后添加5 mg/mL MTT溶液40 μL，孵育4 h，每孔加入200 μL DMSO，搖床上充分振蕩。490 nm波長處測定吸光度(A)值。重復(fù)3次，取平均值。

1.5 克隆形成實驗

每個孔接種600個U251細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后，測定克隆形成率。先去除培養(yǎng)液，用PBS清洗3遍，再用甲醇固定細(xì)胞20 min，然后1%亞甲基藍(lán)染色40 min，去離子水清洗2遍，晾干。顯微鏡下計算大于50個細(xì)胞的克隆數(shù)量。統(tǒng)計克隆形成率(plating efficiency，PE)，PE%=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%

1.6 細(xì)胞劃痕實驗

將miR-128b類似物組、miR-128b抑制劑組及對照組細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，融合后用滅菌槍頭沿直線用力劃直線。劃痕后即刻和48 h時在顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕修復(fù)情況，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(劃痕后即刻的劃痕面積-劃痕后48 h的劃痕面積)/劃痕后即刻的劃痕面積×100%。實驗重復(fù)3次，取平均值。劃痕愈合率越高，表示細(xì)胞遷移能力越強。

1.7 Transwell細(xì)胞侵襲實驗

將miR-128b類似物組、miR-128b抑制劑組及對照組各取2×104個細(xì)胞，種在Transwell小室的碳酸磷脂表面，上室BioCoatTM包被Matrigel基質(zhì)膠(BD Biosciences，San Jose，CA)，37 ℃培養(yǎng)24 h。取出上層小室，將膜下面的細(xì)胞與1%多聚甲醛混合，用0.2%結(jié)晶紫溶液染色15 min。顯微鏡下計數(shù)進(jìn)入膜下的細(xì)胞量，100倍視野中隨機取10個視野，計算平均值。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-128b在正常星形膠質(zhì)細(xì)胞及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)

Real-timePCR檢測顯示，miR-128b在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251較正常星形膠質(zhì)細(xì)胞系HA1800低表達(dá)，為HA1800的(0.21±0.03)倍(P<0.01)。

2.2 轉(zhuǎn)染后各組U251細(xì)胞中miR-128b的表達(dá)量檢測

轉(zhuǎn)染24h后，Real-timePCR檢測細(xì)胞系中miR-128b的表達(dá)水平，結(jié)果示：miR-128b陰性對照為對照組(0.94±0.12)倍(P>0.05)，miR-128b類似物組miR-128b較對照組表達(dá)量顯著升高，為對照組的(9.16±0.85)倍(P<0.01)，miR-128b抑制劑組較對照組表達(dá)量顯著降低，為對照組的(0.32±0.03)倍(P<0.01)，見圖1。提示miR-128bmimics可顯著提高U251細(xì)胞中miR-128b的表達(dá)量，而miR-128b抑制劑可顯著降低U251細(xì)胞中miR-128b的表達(dá)量。

**P<0.01圖1 miR-128b在各組中的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-128b in each group

2.3 miR-128b抑制U251細(xì)胞增殖

MTT實驗示：24h時，對照組、miR-128b類似物組、miR-128b抑制劑組A490nm值分別為(0.32±0.04)、(0.23±0.03)和(0.42±0.05)，miR-128b類似物組顯著低于對照組(t=-3.117，P=0.017)和miR-128b抑制劑組(t=-5.643，P=0.002)；48h時，對照組、miR-128b類似物組、miR-128b抑制劑組A490nm值分別為(0.52±0.05)、(0.38±0.06)和(0.73±0.07)，miR-128b類似物組顯著低于對照組(t=-3.104，P=0.018)和miR-128b抑制劑組(t=-6.575，P=0.001)；72h時，對照組、miR-128b類似物組、miR-128b抑制劑組A490nm值分別為(0.68±0.06)、(0.47±0.06)和(1.23±0.12)，miR-128b類似物組顯著低于對照組(t=-4.286，P=0.006)和miR-128b抑制劑組(t=-9.811，P<0.001)，見圖2A。

培養(yǎng)72h后，miR-128b類似物組克隆形成率為(24.67±2.82)%，對照組為(52.48±5.86)%，miR-128b抑制劑組克隆形成率為(82.63±9.14)%。3組比較，miR-128b類似物組的克隆形成率顯著低于對照組及miR-128b抑制劑組(P<0.05，P<0.01)，見圖2B。

A：A490 nm值的比較；B：克隆形成率比較；*P<0.05 **P<0.01圖2 3組A490 nm值及克隆形成率比較Fig.2 Comparison of A490nm value and colony formation rate of the three groups

2.4 miR-128b抑制U251細(xì)胞遷移及侵襲

劃痕48h后，miR-128b類似物組、miR-128b抑制劑組及對照組劃痕愈合率分別為(31.24±3.72)%、(88.74±7.52)%以及(62.37±4.33)%。3組比較，miR-128b類似物組的劃痕愈合率顯著低于對照組及miR-128b抑制劑組(P<0.05，P<0.01)，見圖3A。培養(yǎng)24h后，miR-128b類似物組、miR-128b抑制劑組及對照組侵襲細(xì)胞數(shù)100倍視野下分別為(278±28)個、(696±43)個及(463±37)個。3組比較，miR-128b類似物組的遷移細(xì)胞數(shù)顯著少于對照組及miR-128b抑制劑組(P<0.05，P<0.01)，見圖3B。

3 討論

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高，據(jù)2013年美國官方數(shù)據(jù)報道，年齡標(biāo)化平均年發(fā)病率為3.19/100 000[6]，男性多于女性，發(fā)病隨年齡增長而增長，并于75～84歲達(dá)到發(fā)病高峰，于85歲后發(fā)病率開始下降[7]。預(yù)后較差，中位生存時間僅9～12個月[2]。年齡、術(shù)前狀態(tài)、腫瘤位置、腫瘤影像學(xué)特征及切除范圍都是影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后的因素[8]。得益于手術(shù)+放化療為主的綜合治療進(jìn)步，神經(jīng)膠質(zhì)瘤2年總生存率從10.4%增加至26.5%，中位生存時間也從12.1月增至14.6月[9]。但是術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍是影響預(yù)后的重要因素。

A：細(xì)胞劃痕實驗；B：Transwell實驗(×100)圖3 miR-128b抑制U251細(xì)胞遷移及侵襲Fig.3 Suppression of migration and invasion by miR-128b

近年來，miRNA被報道在多種腫瘤中異常表達(dá)，并且異常表達(dá)與諸如增殖、凋亡、遷移及侵襲等多種腫瘤生物學(xué)功能相關(guān)[10-11]。miR-128家族包括miR-128a和miR-128b，其在腦組織中表達(dá)豐富，在多種惡性腫瘤中miR-128異常表達(dá)[12]。Hu等[13]報道m(xù)iR-128可通過靶向調(diào)節(jié)VEGF-C表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌腫瘤形成。Shen等[14]報道m(xù)iR-128可通過下調(diào)PTEN表達(dá)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖。Katada等[15]在42例未分化胃癌組織中發(fā)現(xiàn)miR-128a上調(diào)表達(dá)，而miR-128b下調(diào)表達(dá)。Polytarchou等[16]報道m(xù)iR-128b在乳腺癌中下調(diào)表達(dá)，并可通過調(diào)節(jié)Bmil表達(dá)抑制腫瘤干細(xì)胞生長。在胃癌中，miR-128b下調(diào)表達(dá)，并可通過靶向調(diào)節(jié)PDK1/Akt/NF-κB軸調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞活動性[5]。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-128b在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系較正常星形膠質(zhì)細(xì)胞系低表達(dá)，同時轉(zhuǎn)染miR-128b類似物組miR-128b表達(dá)量較轉(zhuǎn)染陰性對照序列的對照組顯著升高，miR-128b抑制劑組較對照組表達(dá)量顯著降低。提示miR-128bmimics可顯著提高U251細(xì)胞中miR-128b的表達(dá)量，而miR-128b抑制劑可顯著降低U251細(xì)胞中miR-128b的表達(dá)量。進(jìn)一步行MTT和克隆形成實驗，發(fā)現(xiàn)miR-128b類似物組A490nm值顯著低于miR-128b抑制劑和對照組，miR-128b類似物組的克隆形成率顯著低于對照組及miR-128b抑制劑組，表明上調(diào)miR-128b的表達(dá)可抑制增殖，這與Wang等[17]在胃癌中的報道結(jié)果一致。

遷移和侵襲是惡性腫瘤的典型特征，是腫瘤細(xì)胞、宿主和腫瘤微環(huán)境間一系列復(fù)雜、多步驟、多因素相互作用的連續(xù)過程，這其中涉及到轉(zhuǎn)化生長因子β、成纖維細(xì)胞、腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞、趨化因子、凝血酶、miRNA等一系列分子[18]。miR-128b類似物組的劃痕愈合率顯著低于對照組及miR-128b抑制劑組，miR-128b類似物組的遷移細(xì)胞數(shù)顯著少于對照組及miR-128b抑制劑組，表明miR-128b過表達(dá)可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲。Woo等[19]在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)miR-128下調(diào)CSF-1的表達(dá)，進(jìn)而降低了卵巢癌細(xì)胞系的活動性和粘附能力，抑制轉(zhuǎn)移，本研究結(jié)果與之一致，提示miR-128b可能在不同的腫瘤組織發(fā)揮相似的作用。但其機制目前尚不清楚，可能為通過抑制PDK1表達(dá)進(jìn)而顯著抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖、遷移和侵襲[20]。

總之，本研究首次在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)miR-128b呈低表達(dá)，并且miR-128b高表達(dá)可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，這為更深入了解神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)病機制提供了一個新的視角，并有可能為神經(jīng)膠質(zhì)瘤藥物開發(fā)提供一個新的靶點。當(dāng)然，本文也存在一定的不足，比如miR-128b在動物實驗中的結(jié)果及所起的作用和機制如何，尚待進(jìn)一步研究。

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(2016-08-16 收稿)

Effect of miR-128b on Proliferation，Migration and Invasion of Glioblastoma Cells

Zhang zhang，Xiong Zuojun，F(xiàn)an Mingboetal

DepartmentofNeurosurgery，TheCentralHospitalofWuhan，TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430014，China

Objective To investigate the potential role of miR-128b in regulation of glioblastoma cell proliferation，migration and invasion.Methods Expression level of miR-128b in glioblastoma cell line U251 and normal astrocyte cell line HA1800 was investigated by real-time PCR.U251 cell line was divided into three groups：control group(transfected with microRNA scrambles)，miR-128b group(transfected with miR-128b mimics)and miR-128b inhibitor group(transfected with miR-128b inhibitor).MTT method and colon-formation assay were used to examine the cell proliferation ability.Cell scratch assay and Transwell assay were used to determine cell migration ability.Results Real-time PCR results indicated that the expression level of miR-128b in U251 was(0.21±0.03)folds the expression in HA1800(P<0.01).The gene expression of miR-128b in miR-128b mimics group was (9.16±0.85) times that of the control group(P<0.01)，and miR-128b expression of miR-128b inhibitor group was(0.32±0.03)folds that of the control group 24 h after transfection(P<0.01).TheA490 nmof miR-128b group was significantly lower than that of control group and miR-128b inhibitor group after culturing for 24，48 and 72 h.After 72 h cultivation，the colony formation rate in miR-128b group was (24.67±2.82)%，significantly lower than the rate [(52.48±5.86)%] in control group，and the rate [(82.63±9.14)%] in miR-128b inhibitor group(P<0.05，P<0.01).The wound healing rate was significantly lower in miR-128b group [(31.24±3.72)%] than in miR-128b inhibitor group [(88.74±7.52)%] and control group [(62.37±4.33)%] (bothP<0.05).The invasive cell number in miR-128b group was (278±28)，significantly less than(696±43) in miR-128 inhibitor group and (463±37)in control group(P<0.05).Conclusion miR-128b inhibits glioblastoma cell proliferation，migration and invasion，and might be a new potential therapy target.

miR-128b； glioblastoma； proliferation； migration； invasion

R739.41

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.06.004

張 章，男，1979年生，主治醫(yī)師，E-mail：zhangzhang8886@sina.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：chenwenwuhan888@126.com