毒熱清顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

鄭 弘秦會(huì)珍，2施鈞瀚孟祥樂，2▲

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南鄭州 450000；2.河南大學(xué)藥學(xué)院，河南開封 475004

毒熱清顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

鄭 弘1秦會(huì)珍1，2施鈞瀚1孟祥樂1，2▲

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南鄭州 450000；2.河南大學(xué)藥學(xué)院，河南開封 475004

目的為新制劑毒熱清顆粒建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法對制劑中連翹、紫花地丁、甘草采用薄層色譜（TLC）法進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法（HPLC）測定毒熱清顆粒中黃芩苷、綠原酸的含量。色譜柱為Agilent ZORBAX XDB-C18柱（4.6mm×150mm，5μm），流動(dòng)相甲醇-0.4%磷酸（梯度洗脫），流速1.0mL/min，檢測波長為316nm，柱溫25℃。結(jié)果連翹、紫花地丁、甘草的TLC圖斑點(diǎn)清晰，分離度好。黃芩苷、綠原酸檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為0.4764～2.382μg（r=0.9999），0.4216～2.108μg（r=0.9999），加樣回收率分別為98.8%（RSD=1.5%），99.1%（RSD=1.1%），精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的RSD＜2%，n均為6。結(jié)論所建質(zhì)量控制方法科學(xué)合理，可作為毒熱清顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

毒熱清顆粒；黃芩苷；綠原酸；薄層色譜；高效液相色譜

毒熱清顆粒來源于臨床經(jīng)驗(yàn)方，由黃芩、金銀花、連翹、紫花地丁、甘草等藥物組成，用于治療熱毒壅盛之證。方中黃芩清熱燥濕，瀉火解毒為君藥；金銀花、連翹、紫花地丁清熱解毒，涼血消腫散結(jié)為臣，甘草清熱解毒，調(diào)和諸藥。全方共奏清熱解毒、瀉火散結(jié)之功。根據(jù)文獻(xiàn)[1-8]，建立毒熱清顆粒的質(zhì)量控制方法：采用高效液相色譜（HPLC）法測定黃芩苷、綠原酸的含量，對制劑中連翹、紫花地丁、甘草采用薄層色譜法（TLC）進(jìn)行定性鑒別。

1 儀器與試藥

Waters e2695高 效 液 相 色 譜 儀；Sartorius CP225D電子天平，科導(dǎo)臺式超聲波清洗器(Hk250型），黃芩苷對照品（批號：110715-201318）、綠原酸對照品（批號：110753-201314）、連翹苷對照品（批號：110821-201213）和紫花地丁對照藥材（121429-201104）、甘草對照藥材（120904-201117）均來源于中國食品藥品檢定研究院，用于流動(dòng)相試劑均為色譜純，西格瑪公司生產(chǎn)，水為純化水，其它試劑為分析純。毒熱清顆粒（批號：150428，150429，150430）由制劑室生產(chǎn)，飲片來源于安徽普仁藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 紫花地丁TLC 樣品制備：稱取毒熱清顆粒細(xì)粉3g，置具塞三角瓶中加甲醇30mL，超聲20min，過濾，濾液2mL，作為供試品溶液。稱取1g紫花地丁對照藥材同法制成2mL對照藥材溶液。薄層色譜條件：硅膠G薄層板；點(diǎn)樣5～10μL；展開劑甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5：3：1），展距8cm；顯色365nm紫外燈。結(jié)果：在對照藥材色譜相應(yīng)的位置上供試品均有相同顏色的熒光斑點(diǎn)。而陰性對照在相應(yīng)位置上則無斑點(diǎn)。見圖1。

圖1 紫花地丁TLC

2.1.2 連翹TLC 樣品制備：同2.1.1。2mg/mL的連翹苷對照品溶液，作為對照品溶液。薄層色譜條件：硅膠G薄層板；點(diǎn)樣5μL；展開劑三氯甲烷-甲醇（8：1），展距8cm；顯色劑10%硫酸乙醇溶液。結(jié)果：在對照品色譜相應(yīng)的位置上供試品有相同顏色的熒光斑點(diǎn)。而缺連翹的樣品在相應(yīng)位置上則無斑點(diǎn)。見圖2。

圖2 連翹苷 TLC

2.1.3 甘草TLC 樣品制備：稱取毒熱清顆粒細(xì)粉3g，置具塞三角瓶中加甲醇30mL，超聲20min，濾過，濾液水浴鍋蒸干，殘?jiān)铀?0mL溶解并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加10mL水飽和過的正丁醇萃取，共萃取3次，合并正丁醇溶液，用20mL水洗滌2次，棄去水液，正丁醇蒸干，殘?jiān)蛹状?mL溶解，作為供試品溶液；稱取甘草對照藥材1g，同法處理即得2mL甘草對照藥材溶液。薄層色譜條件：硅膠G薄層板；點(diǎn)樣5μL；展開劑甲苯-氯仿-甲醇（5：5：1）[9]，展距8cm；顯色劑10%硫酸乙醇溶液。結(jié)果：在對照藥材色譜相應(yīng)的位置上供試品均有相同顏色的斑點(diǎn)。而缺甘草的陰性樣品則無斑點(diǎn)。見圖3。

圖3 甘草TLC

2.2 含量測定

2.2.1 色 譜 條 件 色 譜 柱：Agilent ZORBAX SB-Aq柱（4.6mm×150mm，5μm）；以甲醇-0.4%磷 酸（0～25，甲 醇25～47，25～35，甲 醇47～47，35～36甲 醇47～25，36～40甲 醇25～25）為流動(dòng)相，檢測波長為316nm[10-11]。

2.2.2 對照品溶液的制備 取黃芩苷對照品，稱定為11.91mg，加甲醇定容至50mL，制成每1mL含238.2μg的溶液，即得黃芩苷對照品溶液。精密稱取綠原酸對照品10.54mg，加甲醇定容至50mL，制成每1mL含210.8μg的溶液，即得綠原酸對照品溶液(10℃以下保存）。取上述兩種對照品溶液各5mL，混合均勻即得混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末約1g，精密稱定，置25mL容量瓶中,加入甲醇約20mL，超聲30min，放冷，甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10.0mL，用容量瓶加甲醇稀釋至50mL，搖勻，取續(xù)濾液用0.45μm微孔濾膜濾過，即得.

2.2.4 線性關(guān)系的考察 精密取黃芩苷對照品溶液（每1mL含238.2μg）2、4、6、8、10mL，分別置10mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻即得濃度分別為每 1mL含 47.64、95.28、142.92、190.56、238.2μg的5種黃芩苷對照品溶液；同法，精密量取綠原酸對照品溶液（每1mL含210.8μg）2、4、6、8、10mL，分別置10mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻即得濃度的分別為每1mL含42.16、84.32、126.48、168.64、210.8μg的5種綠原酸對照品溶液，分別取上述5種濃度梯度的黃芩苷和綠原酸對照品溶液，按給定色譜條件測定黃芩苷和綠原酸的峰面積。以相應(yīng)對照品峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得黃芩苷回歸方的程為：Y=2.03E+06X-1.02E+05（R=0.9999）；綠原酸回歸方程為：Y=1.15E+06X-5.10E+04（R=0.9999），結(jié)果表明黃芩苷進(jìn)樣量在0.4764～2.382μg，綠原酸在0.4216～2.108μg線性關(guān)系良好。

2.2.5 陰性干擾試驗(yàn) 缺黃芩樣品溶液：按處方比例稱取本處方中藥材（不含黃芩），按制備工藝制備缺黃芩陰性樣品，然后按2.2.3項(xiàng)下方法制備得缺黃芩陰性對照溶液。

缺金銀花樣品溶液：按處方比例稱取本處方中藥材（不含金銀花），按制備工藝制備缺金銀花陰性樣品，然后按2.2.3項(xiàng)下方法制備得缺金銀花陰性對照溶液。

吸取黃芩苷和綠原酸對照品溶液、供試品溶液和缺黃芩、缺金銀花的陰性溶液各10μL，分別注入色譜儀中。按照上述色譜條件測定。結(jié)果供試品溶液色譜圖中，在與黃芩苷和綠原酸對照品色譜相應(yīng)的位置上，均有一相同的色譜峰，而缺黃芩陰性溶液在與黃芩苷相應(yīng)位置上無色譜峰，缺金銀花陰性溶液在于綠原酸對照品相應(yīng)位置上無色譜峰，見圖4。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別測定峰面積。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD為0.6%、綠原酸峰面積的RSD為0.7%。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液10μL，第一次進(jìn)樣后每2h進(jìn)樣一次，共進(jìn)樣7次（12h）,分別測定峰面積。結(jié)果黃芩苷和綠原酸的峰面積積分值的RSD分別為1.1%、1.0%。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號樣品6份，制成6份供試品溶液，分別進(jìn)樣10μL，按照上述色譜條件測定。結(jié)果黃芩苷和綠原酸含量的的RSD分別為1.2%、1.3%。

圖4 毒熱清顆粒 HPLC圖

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 加樣回收率試驗(yàn)稱取樣品6份（含量已知），每份0.50g，分別加入2.1840mg的黃芩對照品和0.9486mg的綠原酸對照品，按照

2.2.3項(xiàng)下方法操作，測定結(jié)果見表1～2。

2.2.10 樣品的含量測定 取 三 批 樣 品 ， 分 別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算含量，見表3。

3 討論

薄層色譜法簡單、快速、準(zhǔn)確，是制定中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的常用方法，本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法鑒別制劑中紫花地丁、連翹苷、甘草，其中紫花地丁和連翹分別參照2015年版《中國藥典》一部紫花地丁和連翹項(xiàng)下薄層色譜方法，甘草薄層色譜鑒別曾根據(jù)《中國藥典》采用，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15：1：1：2)為展開劑，結(jié)果樣品中色譜峰較多，分離度不好，經(jīng)過篩選，甘草薄層色譜鑒別根據(jù)文獻(xiàn)[9]采用甲苯-氯仿-甲醇（5：5：1）為展開劑。結(jié)果表明，建立的連翹、紫花地丁、甘草薄層色譜方法具有斑點(diǎn)清晰，專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)。

表1 綠原酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表2 黃芩苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表3 含量測定結(jié)果（mg/g）

黃芩苷和綠原酸分別為處方中黃芩和金銀花的主要有效成分，其藥理藥效文獻(xiàn)[12-18]已有較多的研究，黃芩和金銀花又分別是處方中的君藥和臣藥，因此本實(shí)驗(yàn)采用高效液相測定樣品中黃芩苷、綠原酸的含量。流動(dòng)相的選擇，根據(jù)文獻(xiàn)[1-2，4-6，19]采用甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.4%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)對比，最終流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸梯度洗脫；在優(yōu)選測定波長時(shí)，一般文獻(xiàn)采用的方法是黃芩苷在280nm波長條件下測定，綠原酸在327nm波長條件下測定，實(shí)驗(yàn)顯示黃芩苷的最大吸收分別在280nm，316nm處，另外，綠原酸最大吸收為327，而在316nm波長下吸收仍比較高，因此，根據(jù)文獻(xiàn)[10-11，20]及實(shí)驗(yàn)測定的黃芩苷和綠原酸紫的外吸收圖譜，把吸收波長定為316nm。在316nm波長條件下，樣品中目標(biāo)峰的峰形和分離度均良好，專屬性實(shí)驗(yàn)，加樣回收試驗(yàn)及穩(wěn)定性試驗(yàn)均符合要求，因此該方法可以用作黃芩苷和綠原酸的含量測定。

對3批中試樣品的測試結(jié)果顯示，黃芩苷和綠原酸的含量比較穩(wěn)定，3批樣品中黃芩苷平均含量3.888mg/g（RSD=3.1%），綠原酸平均含量1.944 mg/g（RSD=3.1%），可以按照3批樣品黃芩苷和綠原酸平均含量的80%設(shè)定控制標(biāo)準(zhǔn)，即暫定本品每1g含黃芩苷不得低于3.11mg，含綠原酸不得低于1，56mg。

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Quality Standard Study of dureqing granule

ZHENG Hong1QIN Huizhen1,2SHI Junhan1MENG Xiangle1,2
1.The First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou,450000，China; 2.Pharmaceutical College,He'nan University,Kaifeng 475004,China

ObjectiveTo establish quality standard of new preparations of dureqing granule.MethodsForsythia,Violet,Licorice in dureqing granule were identified by TLC.The contents of baicalin and chlorogenic acid were determined by HPLC,which was performed on an Agilent ZORBAX XDB-C18 column (4.6mm×250mm,0.45μm）with a mobile phase methanol-0.4% phosphoric acid (gradient elution),at a flow rate of 1.0mL/min.The detection wavelength was 316nm,with column temperature 25℃.ResultsChromatographic characteristics of qualitative identification were evident.The linear range of baicalin was 0.4764～2.382μg (r=0.9999) and the average recovery rate was 98.8% (RSD=1.5%).The linear range of chlorogenic acid was 0.4216～2.108μg (r=0.9999) and the average recovery rate was 99.1% (RSD=1.1%). RSDs of precision, stability and reproducibility tests were lower than 2.0%(n=6).ConclusionThe method of qualitative and quantitative analysis is accurate,feasible and suitable for effective quality control of dureqing granule.

HPLC;TLC;Baicalin;Chlorogenic acid;Dureqing granule

R285.5

A

2095-0616（2016）19-64-05

2016-06-16）

國家自然科學(xué)基金-河南省人民政府人才培養(yǎng)聯(lián)合基金（U1304824）；中國博士后科學(xué)基金特別資助（2015T80772）；中國博士后科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目（2015M582190）；河南省博士后基金項(xiàng)目（2014-75）；河南省濟(jì)源市科技攻關(guān)項(xiàng)目（15013034）；河南省科技廳“三區(qū)”人才計(jì)劃 （2014-566，2015-423）；

▲通訊作者