脂氧素A4對大鼠肺缺血再灌注損傷氧化損傷的影響

李春來劉永梁李洪志袁曉環(huán)李興旺劉再英▲

1.牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院麻醉科，黑龍江牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院黑龍江省抗纖維化生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江牡丹江 157011；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，浙江溫州 325027

脂氧素A4對大鼠肺缺血再灌注損傷氧化損傷的影響

李春來1劉永梁1李洪志2袁曉環(huán)2李興旺3劉再英1▲

1.牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院麻醉科，黑龍江牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院黑龍江省抗纖維化生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江牡丹江 157011；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，浙江溫州 325027

目的探討脂氧素A4對大鼠肺缺血再灌注損傷氧化應(yīng)激的影響。方法取36只大鼠（體重220～280g）隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組和脂氧素A4干預(yù)組。阻斷左肺門45min后再灌注2h建立肺缺血再灌注損傷模型，脂氧素A4干預(yù)組在大鼠恢復(fù)血供前5min股靜脈注射脂氧素A4 0.1mg/kg。收集標(biāo)本，檢測肺組織的濕/干重量（W/D）比值、支氣管肺泡灌洗液的蛋白總量（TP）、檢測肺組織勻漿中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性。結(jié)果缺血再灌注組肺組織W/D比值、MDA水平和支氣管肺泡灌洗液中總蛋白均較假手術(shù)組明顯升高，而SOD活性較假手術(shù)組明顯降低（P＜0.05）。脂氧素A4干預(yù)組的上述指標(biāo)高于明顯低于缺血再灌注組，而SOD活性較缺血再灌注組明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論脂氧素A4對大鼠肺缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是脂氧素A4清除自由基抗氧化作用。

脂氧素A4；氧自由基；氧化損傷；肺缺血再灌注損傷

肺缺血再灌注損傷（lung ischemia reperfusion injury,LIRI）常發(fā)生在肺移植、肺栓塞和體外循環(huán)等多種臨床情況下，是限制肺移植成功與否的重要因素[1]。LIRI的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，其中已被證實(shí)大量氧自由基釋放與缺血再灌注損傷的過程密切相關(guān)[2]。脂氧素A4（lipoxins,LXA4）作為內(nèi)源性脂質(zhì)抗炎和促炎癥消退介質(zhì)，被譽(yù)為炎癥反應(yīng)的“剎車信號”，且有減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用[3-4]。目前有關(guān)LXA4對大鼠肺缺血再灌注氧化損傷影響的研究報(bào)道尚少，在本研究中，通過建立大鼠在體肺缺血再灌注模型，探討新型抗炎藥物-脂氧素A4對肺缺血再灌注損傷氧化損傷的作用。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和分組

清潔級雄性SD大鼠36只，體重220～280g，由牡丹江醫(yī)學(xué)院動物中心提供，使用許可證號：SKXY（黑）2015-007。 動 物 實(shí) 驗(yàn)室 溫 度20～24℃，濕度40%～70%。隨機(jī)均勻?yàn)榧偈中g(shù)組、缺血再灌注組和脂氧素A4干預(yù)組，每組12只。

假手術(shù)組：大鼠只開胸而不進(jìn)行左肺缺血再灌注；缺血再灌注組：大鼠行左肺缺血再灌注，即開胸游離左肺門后，阻斷左肺門45min，而后松開血管夾形成再灌注；脂氧素A4干預(yù)組：阻斷左肺門前5min股靜脈給予脂氧素A40.1mg/kg，而后阻斷左肺門45min，松開血管夾形成再灌注。

1.2 動物模型的制備

參照Eppinger等[5-6]在體大鼠肺缺血再灌注模型的制作方法并進(jìn)行改進(jìn)。大鼠術(shù)前4h禁食，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛3mL/kg麻醉后，氣管切開后插管，連接55-7058型動物呼吸機(jī)（美國哈佛儀器）行機(jī)械通氣（吸入氧濃度100%，呼吸頻率60次/min，潮氣量單側(cè)肺通氣8～10mL/kg，雙側(cè)肺通氣15～20mL/kg）。行右股靜脈置管，連接微量輸液泵，開放靜脈。然后經(jīng)胸骨左緣第5肋間開胸，離斷周圍組織，游離左肺門，股靜脈注射50U肝素，5min后于呼氣末用無創(chuàng)血管夾夾閉左肺門（左主支氣管和左肺動、靜脈），觀察左肺組織萎陷，通氣時左肺不再膨脹，顏色轉(zhuǎn)為暗紫紅色，表明阻斷成功。阻斷45min后松開止血夾行再灌注，制成LIRI模型。

1.3 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測

各組大鼠于再灌注120min后采集標(biāo)本。取一部分肺組織，稱其濕重（W），置于烤箱（70℃，48h），烘烤至恒重，稱其干重（D），計(jì)算肺組織的濕/干重（W/D）比值；采集大鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF），采用考馬斯亮藍(lán)染色法對其蛋白總量（TP）進(jìn)行測定；取一部分凍存肺組織制成10%組織勻漿，按照試劑盒步驟要求，檢測肺組織SOD活性、MDA含量；

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠W/D比值和支氣管肺泡灌洗液中TP比較

與假手術(shù)組比較，脂氧素A4干預(yù)組大鼠再灌注120min后，W/D比值和BALF中TP含量均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與缺血再灌注組比較，脂氧素A4干預(yù)組大鼠W/D比值和BALF中TP含量均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組大鼠W/D比值和支氣管肺泡灌洗液中TP比較，見表1。

2.2 大鼠肺組織MDA含量、SOD活動測定結(jié)果

與假手術(shù)組相比，脂氧素A4干預(yù)組大鼠肺組織中MDA含量顯著升高（P＜0.05），而SOD活性顯著降低（P＜0.05）；與缺血再灌注組相比，脂氧素A4干預(yù)組大鼠MDA含量顯著降低（P＜0.05），SOD活性顯著升高（P＜0.05）。大鼠肺組織中MDA含量、SOD活性的結(jié)果見表2。

表1 各組大鼠W/D比值和支氣管肺泡灌洗液中TP比較（）

表1 各組大鼠W/D比值和支氣管肺泡灌洗液中TP比較（）

注：與假手術(shù)組比較，t1=2.375 ，t2=2.218,*P＜0.05；與缺血再灌注組比較，t1=2.307，t2=2.553，#P＜0.05

組別 n TP （g/L） W/D比值假手術(shù)組 12 0.38±0.10 4.02±0.28缺血再灌注組 12 1.21±0.12 6.12±0.35脂氧素A4干預(yù)組 12 0.78±0.14*# 4.95±0.30*#F11.72 11.34P＜0.05 ＜0.05

表2 大鼠肺組織中MDA含量、SOD活性的結(jié)果（）

表2 大鼠肺組織中MDA含量、SOD活性的結(jié)果（）

注：與假手術(shù)組比較，t3=2.75，t4=3.09,*P＜0.05；與缺血再灌注組比較，t3=2.43，t4=3.725,#P＜0.05

MDA（nmol/L）假手術(shù)組 12 12.39±0.96 0.57±0.13缺血再灌注組 12 6.49±0.65 1.52±0.12脂氧素A4干預(yù)組 12 8.97±0.77*# 0.99±0.10*#F13.41 22.84P＜0.05 ＜0.05組別 n SOD（U/mg·prot）

3 討論

LIRI可導(dǎo)致肺血管阻力和肺血管通透性的增加等一系列病理生理改變，肺水腫是缺血性肺損傷的并發(fā)癥之一[7]。肺組織W/D比值的增高和BALF中TP含量的增加均反映了肺微血管通透性增加。本實(shí)驗(yàn)中觀察到，缺血再灌注組再灌注后，肺組織W/D比值和BALF中TP含量含量較假手術(shù)組顯著增加，給與LXA4再灌注2h后，含量較假手術(shù)組升高，但比較缺血再灌注組卻顯著降低（P＜0.05）。這提示脂氧素A4干預(yù)組大鼠應(yīng)用LXA4后可明顯降低肺組織水分含量，減輕水腫，減輕缺血再灌注后肺微血管通透性，而對肺組織具有保護(hù)作用。

LIRI的確切機(jī)制尚未闡明，目前認(rèn)為，活性氧（ROS）的產(chǎn)生增多并釋放是其重要的因素之一[8]。且機(jī)體內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)不能清除過量的ROS，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化系統(tǒng)及抗氧化系統(tǒng)失衡。因此，對抗通過清除自由基對抗氧化應(yīng)激作為LIRI治療的手段之一[9]。

LXA4是一種內(nèi)源性脂質(zhì)分子，以往的研究證實(shí)其抑制炎癥的作用[10]，但同時也可抑制ROS生成[11]。有研究表明LXA4可以提高多種器官的過氧化物歧化酶活性，減輕缺血再灌注所致的心肌組織自由基損傷，對恢復(fù)機(jī)體的氧化、抗氧化平衡起到積極有效的作用[12-13]。MDA是活性氧脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)的最終產(chǎn)物之一，其含量的變化一定程度上可反映缺血再灌注后氧化應(yīng)激損傷程度[14]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，給予LXA4后肺組織MDA活力較缺血再灌注組卻顯著降低（P＜0.05）。提示LXA4的作用可能通過減少再灌注時ROS的產(chǎn)生，減輕了肺組織的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而對缺血再灌注損傷的肺組織產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。

SOD能夠催化高反應(yīng)性超氧負(fù)離子的歧化作用，保護(hù)細(xì)胞免受損傷[15]。因此，SOD的活性水平間接反映抗氧化能力。本實(shí)驗(yàn)中，給予LXA4后肺組織中SOD活性明顯高于缺血再灌注組（P＜0.05），且肺組織損傷也明顯減輕。說明LXA4可減輕氧化損傷，增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力，從而起到肺保護(hù)的作用。目前研究主要關(guān)注LXA4在LIRI過程中的抗炎方面[11]，抗氧化應(yīng)激方面關(guān)注甚少，本研究通過MDA和SOD水平，證實(shí)其在LIRI抗氧化方面的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，LXA4對大鼠肺缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能為通過清除氧自由基，提高防御性催化酶SOD活性，抑制肺組織MDA水平，增強(qiáng)抗氧化能力和抑制氧化應(yīng)激，減輕肺水腫。該作用對研究LXA4抗LIRI所致的氧化損傷可能是其重要的機(jī)制之一。更確切的機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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Influence of lipoxin A4 administration on oxidative injury induced by lung ischemia reperfusion in rats

LI Chunlai1LIU Yongliang1LI Hongzhi2YUAN Xiaohuan2LI Xingwang3LIU Zaiying1

1.Department of Anesthesiology,Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical College,Mudanjiang 157011,China;
2.Heilongjiang Key Laboratory of Anti-fibrosis Biotherapy,Mudanjiang Medical College,Mudanjiang 157011,China;
3.Department of Anesthesiology,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325027,China

ObjectiveTo investigate the influence of lipoxin A4administration on oxidative stress after lung ischemia reperfusion injury in rats.Methods36 male S-D rats, weighing 220-280g,were randomly divided into sham-operation group (group S), the lung ischemia reperfusion group (group IR) and the lipoxin A4administration group (group LX). 45min ischemia was induced by occluding the hilum of the left lung,followed by a 2h reperfusion by removing occlusion of the hilum, lipoxinA4(0.1mg/kg) was injected intravenously 5 min before reperfusion in group LX. Lung tissues and BALF were collected. W/D, TP in BALF, malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) were determined 2h after reperfusion.ResultsCompared with group S, W/D and MDA in lung tissue and TP in BALF were significantly increased, while the SOD activities were significantly decreased in group IR (P＜0.05). Compared with group IR, W/D and MDA in lung tissue and TP in BALF were significantly decreased, while the SOD activities were significantly increased in group LX (P＜ 0.05).ConclusionLipoxin A4administration has the protective effect on lung ischemia reperfusion injury, and the mechanism may be related to scavenging free radicals.

Lipoxin A4;Oxygen free radical;Oxidative injury;Lung ischemia reperfusion injury

R965

A

2095-0616（2016）19-52-03

2016-07-15）

黑龍江省研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目（2014YJSCX-10）；浙江省溫州市公益性科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20150233）。

▲通訊作者