大麻素受體1基因多態(tài)性和腸易激綜合征的關(guān)系

李 潔 黎鐘燕 辜金蓮 張 龍

廣州市第一人民醫(yī)院老年病科，廣東廣州 510180

大麻素受體1基因多態(tài)性和腸易激綜合征的關(guān)系

李 潔 黎鐘燕 辜金蓮 張 龍

廣州市第一人民醫(yī)院老年病科，廣東廣州 510180

目的探討大麻素受體1基因（CNR1）多態(tài)性和腸易激綜合征的關(guān)系。方法選取2014年9月～2016年9月我院消化內(nèi)科及老年病科收治的60例腸易激綜合征患者及同期體檢的60例健康患者作為研究對(duì)象，60例腸易激綜合征患者作為觀察組，同期體檢的60例健康患者作為對(duì)照組，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增血清標(biāo)本中的基因組DNA，并對(duì)其進(jìn)行順序的測(cè)定，比較兩組患者常見等位基因及基因型情況，進(jìn)而對(duì)CNR1的多態(tài)性和腸易激綜合征的關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果對(duì)基因組DNA擴(kuò)增的目標(biāo)片段進(jìn)行順序的測(cè)定共發(fā)現(xiàn)8種CNR1等位基因和20種基因型，研究對(duì)象中出現(xiàn)頻率最高的等位基因?yàn)锳AT13，最常見的基因型是13/13，觀察組患者AAT13及13/13基因型出現(xiàn)的頻率分別為51.67%和33.33%，與對(duì)照組（33.33%、16.67%）相比明顯要高；初步得到一定結(jié)果后，以等位基因AAT10分界，觀察組患者等位基因AAT≥10（96.67%）及基因型為≥10/≥10出現(xiàn)的頻率（93.33%）顯著高于對(duì)照組患者等位基因AAT≥10（83.33%）及基因型為≥10/≥10出現(xiàn)的頻率（80.00%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論腸易激綜合征患者CNR1基因的等位基因頻率出現(xiàn)最高的為AAT13，其最廣泛的基因型為13/13，CNR1基因型的多態(tài)性和腸易激綜合征的發(fā)生存在一些聯(lián)系，對(duì)于擁有≥10等位基因及基因型為≥10/≥10的人群更易患腸易激綜合征，這對(duì)腸易激綜合征早期診斷具有極為重要的臨床意義。

大麻素受體1基因；基因多態(tài)性；等位基因；基因型；腸易激綜合征

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）為一種與胃腸功能改變有關(guān)的疾病，臨床表現(xiàn)多為慢性或復(fù)發(fā)性腹痛、腹瀉，腸易激綜合征患者排便習(xí)慣和大便性狀均異于正常人群，在發(fā)病后較容易鑒別[1]。近年來，基因研究發(fā)現(xiàn)腸易激綜合征患者的大麻素受體1基因與健康人群相比具有一定差異性，該項(xiàng)研究的發(fā)現(xiàn)為腸易激綜合征的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療提供了極高的臨床參考價(jià)值[2-3]。因此，我院為進(jìn)一步探討分析大麻素受體1基因（CNR1）多態(tài)性和腸易激綜合征的關(guān)系，特選取2014年9月～2016年9月我院消化內(nèi)科及老年病科收治的60例腸易激綜合征患者及同期體檢的60例健康患者作為研究對(duì)象，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2014年9月～2016年9月我院消化內(nèi)科及老年病科收治的60例腸易激綜合征患者及同期體檢的60例健康人作為研究對(duì)象，其中男55例，女65例，年齡38～85歲，平均（45.4±13.4）歲。60例腸易激綜合征患者作為觀察組，同期體檢的60例健康人作為對(duì)照組，觀察組男27例，女33例，年齡39～83歲，平均（44.9±14.1）歲，體重60～79kg，平均（69.70±15.18）kg；腸易激綜合征類型分類：便秘型腸易激綜合征17例，腹瀉型腸易激綜合征19例，混合型腸易激綜合征24例。對(duì)照組男38例，女32例，年齡38～85歲，平均（45.4±13.0）歲，體重59～81kg，平均（70.28±18.32）kg。兩組患者的年齡、性別、體重等情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。兩組間研究對(duì)象的年齡、性別、體重及疾病類型等情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)癥狀至少6個(gè)月，且近3個(gè)月病情活動(dòng)，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作性腹痛或腹部不適，在最近3個(gè)月，＞3天/月，排便后疼痛和不適可改善，發(fā)作時(shí)伴有排便次數(shù)和（或）大便性狀改變。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)實(shí)驗(yàn)室及鋇餐、X射線等輔助檢查確診為腸易激綜合征；（2）患者意識(shí)清楚、神智正常，能對(duì)事物進(jìn)行清晰的表達(dá)；（3）能主動(dòng)配合調(diào)查，各項(xiàng)生命體征平穩(wěn)；（4）本組研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施，本人及家屬對(duì)本組治療方案均已詳細(xì)了解，并主動(dòng)簽署知情同意書，患者的臨床資料均不公開，充分尊重患者的隱私性。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）全身感染、其他全身性疾病的患者；（2）心、肝、腎功能嚴(yán)重?fù)p、精神異常的患者；（3）甲亢、糖尿病、子宮肌瘤、膽囊結(jié)石等疾病的患者；（4）不愿參加本研究者。

1.2 方法

取所有研究對(duì)象2mL靜脈血，經(jīng)EDTA抗凝后30min，離心加速分離血液標(biāo)本中的血漿和血細(xì)胞，離心速度定在3000r/min，時(shí)間為5min，經(jīng)分離后將離心的血液標(biāo)本置于-84℃的冰箱中為進(jìn)一步檢測(cè)大麻素受體1基因做前期準(zhǔn)備；采用美國QIAGEN公司QIamp DNA Blood MiniKi試劑盒提取基因組DNA，生產(chǎn)批號(hào)201308132。一切準(zhǔn)備就緒后，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）擴(kuò)增基因組DNA：（1）模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；（2）模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；（3）DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。然后采用2%的瓊脂糖凝膠（西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司， LXROSE-20160318）電泳檢測(cè)基因組DNA擴(kuò)增的目標(biāo)片段，并對(duì)其進(jìn)行順序的測(cè)定，計(jì)數(shù)CNR1基因3`側(cè)翼區(qū)存在的AAT重復(fù)序列而進(jìn)行CNR1基因多態(tài)性的分析與研究。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海英俊公司測(cè)序，記錄基因翼區(qū)擴(kuò)增片段的AAT三聯(lián)重復(fù)序列個(gè)數(shù)進(jìn)行基因型分析，首先對(duì)兩組患者常見等位基因及基因型情況進(jìn)行評(píng)估分析，初步得到一定結(jié)果后，以等位基因AAT10分界，比較兩組患者等位基因AAT≥10及基因型為≥10/≥10之間的差異。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩組患者常見等位基因及基因型情況，對(duì)基因組DNA擴(kuò)增的目標(biāo)片段進(jìn)行順序的測(cè)定，分析研究對(duì)象中出現(xiàn)頻率最高的等位基因及最常見的基因型，并比較兩組患者的差異。初步得到一定結(jié)果后，以等位基因AAT10分界，比較兩組患者等位基因AAT≥10及基因型為≥10/≥10之間的差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)樣本的群體代表性，以保證本研究中各對(duì)象基因頻率已達(dá)到了遺傳學(xué)上的平衡。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，荃因型和等位基因片段以百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因頻率遺傳學(xué)上平衡情況

對(duì)所有研究對(duì)象應(yīng)用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)后，確定所有樣本具有群體代表性，本研究中各對(duì)象基因頻率已達(dá)到了遺傳學(xué)上的平衡，能夠進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)與研究。

2.2 兩組患者常見等位基因及基因型情況比較

對(duì)基因組DNA擴(kuò)增的目標(biāo)片段進(jìn)行順序的測(cè)定共發(fā)現(xiàn)8種CNR1等位基因和20種基因型，8種CNR1等位基因中出現(xiàn)頻率最高的等位基因?yàn)锳AT13，20種基因型中最常見的基因型是13/13。觀察組患者AAT13及13/13基因型出現(xiàn)的頻率分別為51.67%和33.33%，與對(duì)照組（33.33%、16.67%）相比明顯要高，初步說明CNR1的多態(tài)性和腸易激綜合征的發(fā)生具有一定相關(guān)性。見表1。

表1 兩組患者常見等位基因及基因型情況的比較[n（%）]

2.3 兩組患者等位基因AAT≥10及基因型為≥10/≥10的情況

初步得到一定結(jié)果后,以等位基因AAT10分界,觀察組患者等位基因AAT≥10出現(xiàn)的頻率（96.67%）及基因型為≥10/≥10出現(xiàn)的頻率（93.33%）顯著高于對(duì)照組患者等位基因AAT≥10出現(xiàn)的頻率（83.33%）及基因型為≥10/≥10出現(xiàn)的頻率（80.00%）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組患者等位基因AAT≥10及基因型為≥10/≥10之間的差異[n（%）]

3 討論

腸道易激綜合征是一種常見的腸道功能紊亂性疾病，中青年女性發(fā)病較多[4]。隨著現(xiàn)代快節(jié)奏的生活，加之人們飲食習(xí)慣的改變，腸道易激綜合征的發(fā)病率逐年攀升，對(duì)其盡快的診斷與治療對(duì)提高患者日常生活質(zhì)量有著極高的臨床應(yīng)用價(jià)值[5]。腸易激綜合征根據(jù)“羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)”可分為便秘型腸易激綜合征、腹瀉型腸易激綜合征及混合型腸易激綜合征三類，臨床主要表現(xiàn)為腹痛和排便異常，缺乏形態(tài)學(xué)、微生物學(xué)和生化學(xué)異常[6-7]。反復(fù)的腹痛、腹瀉及便秘給患者日常生活與工作帶來了極大的不便[8]。另外，該病癥確切病因尚不清楚，這就給臨床上提高評(píng)估腸道易激綜合征發(fā)病可能性帶來了很大的不便。

本研究在近年各位學(xué)者研究的基礎(chǔ)上，從靜脈血標(biāo)本基因入手，經(jīng)EDTA抗凝后30min，進(jìn)行離心分離對(duì)目標(biāo)基因采用PCR技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA，并對(duì)其進(jìn)行順序的測(cè)定，計(jì)數(shù)CNR1基因3`側(cè)翼區(qū)存在的AAT重復(fù)序列而進(jìn)行CNR1基因多態(tài)性的分析與研究。研究結(jié)果顯示，研究對(duì)象中出現(xiàn)頻率最高的等位基因?yàn)锳AT13，最常見的基因型是13/13，觀察組患者AAT13及13/13基因型出現(xiàn)的頻率與對(duì)照組相比明顯要高，初步說明CNR1的多態(tài)性和腸易激綜合征的發(fā)生具有一定相關(guān)性[9]。CNR1是參與大麻素系統(tǒng)生理病理的重要物質(zhì)，大麻素受體有兩種亞型：CNR1和CNR2[10]。研究發(fā)現(xiàn)[11]，敲除小鼠CNR1基因后，可使其血中胰島素與瘦素水平降低，并改善胰島素和瘦素抵抗，表明CNR1在飲食誘導(dǎo)及腸道功能方面起這十分重要的作用，且與機(jī)體能量的消耗密切相關(guān)。CNR1基因存在基因多態(tài)性，CNR1基因3`側(cè)翼區(qū)存在的AAT重復(fù)序列是造成基因多態(tài)性的主要原因，AAT重復(fù)序列可在DNA內(nèi)部形成Z型結(jié)構(gòu)，從而影響DNA轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致AAT重復(fù)序列對(duì)的DNA轉(zhuǎn)錄收到影響，最終影響大麻素正常功能的發(fā)揮[12]?？梢?，對(duì)CNR1基因多態(tài)性的研究具有十分重要的臨床意義，提示臨床上可以采用模擬DNA的轉(zhuǎn)錄，達(dá)到治療腸易激綜合征的目的，進(jìn)而提高患者生活質(zhì)量[13]。

本研究初步得到出現(xiàn)頻率最高的等位基因?yàn)锳AT13，最常見的基因型是13/13這一結(jié)果后，以等位基因AAT10分界，觀察組患者等位基因AAT≥10及基因型為≥10/≥10出現(xiàn)的頻率與對(duì)照組相比明顯要高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?？梢?，對(duì)于擁有≥10等位基因及基因型為≥10/≥10的人群更易患腸易激綜合征，這對(duì)腸易激綜合征早期診斷具有極為重要的臨床意義，在臨床早期診斷過程中，臨床工作人員可以通過患者血清離心分離后對(duì)基因組進(jìn)行研究，根據(jù)其等位基因及基因型出現(xiàn)的頻率評(píng)估該患者是否為腸易激綜合征易感人群，對(duì)于易感人群即可進(jìn)行進(jìn)一步有針對(duì)性的診斷與治療，這不但減少了臨床工作的繁瑣性，還能夠有效提高腸易激綜合征患者診斷的準(zhǔn)確性[14]。另外，腸易激綜合征以中青年女性為高發(fā)人群，對(duì)CNR1多態(tài)性研究還可以細(xì)化到性別之間的等位基因及基因型出現(xiàn)頻率的比較，以便進(jìn)一步評(píng)估不同性別患者不同基因表達(dá)類型患腸易激綜合征的幾率，為臨床早期的診斷及治療提供有說服力的診斷依據(jù)[15]。

綜上所述，腸易激綜合征患者CNR1基因的等位基因頻率出現(xiàn)最高的為AAT13，其最廣泛的基因型為13/13，CNR1基因型的多態(tài)性和腸易激綜合征的發(fā)生存在一些聯(lián)系，對(duì)于擁有≥10等位基因及基因型為≥10/≥10的人群更易患腸易激綜合征，這對(duì)腸易激綜合征早期診斷具有極為重要的臨床意義。

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Relationship between cannabinoid receptor 1 gene polymorphism and irritable bowel syndrome

LI Jie LI Zhongyan GU Jinlian ZHANG Long
Department of Geriatrics,Guangzhou First People's Hospital,Guangzhou 510180,China

ObjectiveTo investigate the relationship between cannabinoid receptor 1 gene （CNR1） polymorphism and irritable bowel syndrome.Methods60 cases of patients with irritable bowel syndrome cured in GI medicine and geriatrics department of our hospital from September 2014 to September 2016 and 60 cases of healthy patients were selected as the research objects.The 60 cases of patient with irritable bowel syndrome were selected as observation group,the 60 cases of patients of health examination during the same period were selected as control group.PCR technology were used to amplify the genomic DNA in serum samples,and its sequence was determined. Common alleles and genotypes of the two groups were compared,and the relationship between CNR1 polymorphism and irritable bowel syndrome were analyzed.ResultsThe genomic DNA amplification of the target fragment sequence determination revealed that there were 8 CNR1 alleles and 20 genotypes.The research object in the highest frequency of the allele was AAT13,the most common genotype was 13/13.The frequencies of AAT13 and 13/13 genotypes in the observation group were 51.67% and 33.33% respectively,which were significantly higher than the control group（33.33%,16.67%）. Some preliminary results,with division of allele AAT10 boundaries,the frequency of allele AAT≥10 （96.67%） and genotype frequency≥10/≥10（93.33%）in observation group were significantly higher than that in control group with allele AAT≥10（83.33%）and genotype frequency≥10/≥10（80%）,with statistically significant(P＜0.05).ConclusionThe patients with irritable bowel syndrome CNR1 gene allele frequency is the highest in AAT13,and the most widely is genotype 13/13.CNR1 genotype polymorphism and irritable bowel syndrome occurred in the presence of some contact with≥ 10 alleles and genotypes≥ 10/≥ 10 people are more likely to suffer from irritable bowel syndrome,and the irritable bowel syndrome early diagnosis has important clinical significance.

Cannabinoid receptor 1 gene;Gene polymorphism;Allele;Genotype;Irritable bowel syndrome

R574.4

2016-08-19）