化橘紅對大鼠糖尿病心肌病的防治作用及其機制研究

郭潤民 吳子君 黃瑞娜 劉 暢 梁國標(biāo) 李上海 莫海亮 閆 海 游 瓊 吳 鏗

廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東湛江 524001

化橘紅對大鼠糖尿病心肌病的防治作用及其機制研究

郭潤民 吳子君 黃瑞娜 劉 暢 梁國標(biāo) 李上海 莫海亮 閆 海 游 瓊 吳 鏗▲

廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東湛江 524001

目的探討化橘紅提取物（extract of exocarpium citri grandis）對鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)大鼠糖尿病心肌病的防治作用及其機制。方法SD大鼠建立實驗性2型糖尿病心肌病模型，隨機分為模型對照組、化橘紅高、中、低劑量治療組、PPARγ激動劑吡格列酮治療組(每組各15只)，正常大鼠15只作為正常對照。觀察不同劑量化橘紅口服10、20、40mL/（kg·d）治療對心肌結(jié)構(gòu)功能損傷程度的影響；HE染色檢測心肌組織結(jié)構(gòu)改變，免疫印跡法檢測心肌組織p 38 MAPK和cleaved caspase-3的表達(dá)，透射電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果與正常對照組比較，模型組大鼠心臟組織心肌凋亡增多，HE染色可見心肌肥大、膠原沉積，心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷顯著；化橘紅干預(yù)組能減輕心肌凋亡、心肌肥大、膠原沉積等，同時能明顯抑制p-p 38 MAPK和cleaved caspase-3的表達(dá)。結(jié)論化橘紅能防治糖尿病心肌病心肌結(jié)構(gòu)功能損傷，其機制可能與抑制心肌p38 MAPK信號通路有關(guān)。

化橘紅；p38 MAPK；糖尿病心肌??；凋亡

化橘紅（pummelo peel）作為嶺南道地藥材，長期以來被當(dāng)做止咳化痰圣藥[1]。近年來，本課題組開始運用中醫(yī)藥辯證論治糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM），前期研究提示，化橘紅及其有效成分（柚皮苷和柚皮素）可防治DCM心肌損傷[2]，但其確切的分子機制有待深入研究。高糖、炎癥等均能誘導(dǎo)p38絲裂原活化蛋白激酶（p38-Mitogen-Activated Protein Kinases，p38MAPK）激活而促進心肌細(xì)胞凋亡[2-4]；我們前期研究證實，柚皮苷可通過抑制p38 MAPK[4]和瘦素通路[5]保護心肌細(xì)胞對抗高糖引起的損傷。但是，化橘紅在體是否通過抑制p38 MAPK 途徑對抗DCM心肌損傷尚不明確？為此，本研究首先觀察化橘紅對STZ誘導(dǎo)的DCM大鼠心肌損傷的干預(yù)效果，繼而探討p38MAPK信號通路在DCM及及化橘紅干預(yù)中的作用及機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

健康雄性SD大鼠，SPF級，80只，4～5周齡，體重130～150g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。飼養(yǎng)于廣東醫(yī)學(xué)院實驗動物中心動物實驗部屏障環(huán)境實驗室進行，飼養(yǎng)條件為恒溫20～25℃，相對濕度40%～70%，換氣次數(shù)10～15次/h，空氣潔凈度10 000級，落菌數(shù)≤3個/皿，噪音≤60dB，晝夜明暗交替時間12/12h，飼養(yǎng)環(huán)境符合實驗動物環(huán)境設(shè)施要求。

1.2 主要試劑

Naringin、鏈 脲 佐 菌 素、Hoechst 33258、p38MAPK通 路 抑 制 劑SB203580購 自Sigma-Aldrich（St Louis，MO，USA），細(xì)胞計數(shù)試劑盒8（cell counter kit-8，CCK-8）購自Dojindo Lab（日本）。DMEM培養(yǎng)基購于Hyclone公司（USA），胎牛血清（FBS）購自Gibco BRL（USA）?？筩aspase-3抗體和抗p38MAPK抗體購自Cell Signaling technology Inc（CST）。

化橘紅藥材由廣東省橘鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供，由廣東醫(yī)科大學(xué)天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室巫鑫博士鑒定為化橘紅，細(xì)胞實驗干預(yù)采用化橘紅提取物（extract of Exocarpium Citri Grandis）參考文獻方法制備[4-5]，其中柚皮苷12.8%，柚皮素0.13%，10μg/mL 5年倉儲化橘紅為萃取產(chǎn)物最大濃度。動物實驗干預(yù)采用化橘紅水煎液，50g化橘紅加水煎至200mL。吡格列酮片劑，購自杭州中美華東制藥有限公司（H20050500），將吡格列酮溶解在蒸餾水中，按1g/L藥物濃度配制。

1.3 方法

1.3.1 DCM大鼠模型建立 使用常規(guī)SPF級全價營養(yǎng)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)兩天，隨機取10只作為正常對照組，實驗過程中始終給予常規(guī)SPF級全價營養(yǎng)飼料喂養(yǎng)。其余50只大鼠喂以高脂高糖飼料4周，空腹16～18h后按30mg/kg的劑量一次性腹腔注射STZ。以72h后連續(xù)2次禁食8h血糖值≥11.1mmol/L者，為糖尿病大鼠模型。選取模型動物50只，分別為DCM模型組[0.5%枸櫞酸鈉，1mL/（100g·d）]、化橘紅低劑量組[10mL/（kg·d）]、化橘紅中劑量組[20mL/（kg·d）]、化橘紅高劑量組[40mL/（kg·d）]、吡格列酮組（5mg/kg·d），每組10只。每日灌胃給藥，給藥時間10：00～11：00 Am，每周給藥6d，共8周。實驗期間模型大鼠繼續(xù)給予高糖高脂飼料（實驗時間總共12周）。于實驗結(jié)束時禁食12h，麻醉，腹主動脈采血后迅速取出心臟，留取新鮮冰凍和固定組織備檢測相關(guān)指標(biāo)，糖尿病模型組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)異常改變確認(rèn)認(rèn)為DCM建模成功?；偌t與吡格列酮給藥濃度參照我們和其他學(xué)者的報道。

1.3.2 H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng) H9c2心肌細(xì)胞由中山大學(xué)實驗動物中心提供。H9c2心肌細(xì)胞來源于大鼠胚胎期心臟組織，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃的溫箱中培養(yǎng)。

1.4 觀察指標(biāo)的檢測

1.4.1 HE染色光鏡及電鏡檢測心肌組織結(jié)構(gòu)改變 動物處死后，取各組大鼠心臟組織的相同部位（一般厚度不超過0.5cm）于10 %中性福爾馬林液浸泡固定，石蠟包埋，做HE染色，光鏡下觀察心肌組織結(jié)構(gòu)改變和脂質(zhì)沉積情況，透射電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，每張切片觀察10個視野。

1.4.2 Western blot法 測 定 心 肌 p38MAPK和caspase-3蛋白的表達(dá) 留取部分心肌組織迅速裝入凍存管放入液氮中速凍，后轉(zhuǎn)移到 -80℃保存，供免疫印跡蛋白測定；將H9c2心肌細(xì)胞接種于35mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至80%滿時，各實驗組給予不同的處理因素后，用預(yù)冷的PBS洗3次，加入裂解液，4℃靜置30min，12000r/min離心10 min，取上清，然后采用BCA法進行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉60min，隨后分別加入抗caspase-3抗體（1∶1 000）和p38MAPK抗體（1∶1 000），4℃過夜，然后用TBST洗3次，5min/次。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色，暗室曝光到X線片上，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。重復(fù)5次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究所有實驗數(shù)據(jù)均使用SPSS19.0軟件建立數(shù)據(jù)庫和進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)描述采用（）表示，統(tǒng)計推斷主要采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較用LSD-t進行，檢驗水準(zhǔn)均為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 化橘紅對大鼠心肌形態(tài)學(xué)的干預(yù)

2.1.1 光鏡結(jié)果與電鏡結(jié)果 與正常對照組大鼠比較，DCM組可見大部分心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂，部分心肌肌纖維斷裂，纖維組織局灶性增生，部分心肌細(xì)胞呈灶性壞死，細(xì)胞核固縮、裂解，細(xì)胞間隙增大，心肌間質(zhì)內(nèi)可見大量排列失去規(guī)律性的膠原纖維增生，心肌細(xì)胞間及毛細(xì)血管壁可見大量炎性細(xì)胞局灶浸潤?；偌t干預(yù)后可以明顯抑制糖尿病大鼠心肌重構(gòu)，減輕心肌間質(zhì)纖維化及心肌炎癥（圖1）。

透射電鏡結(jié)果顯示：與正常對照組大鼠比較，DCM組心肌纖維走行紊亂，可見部分肌絲斷裂，肌節(jié)結(jié)構(gòu)模糊，難以辨認(rèn)，線粒體明顯腫脹，部分線粒體嵴斷裂消失、細(xì)胞膜破損，線粒體基質(zhì)溶解、消失，細(xì)胞間質(zhì)纖維增生，閏盤斷裂模糊，部分融合后形成高密度電子斑塊，微血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹；肌漿網(wǎng)擴張。吞飲泡明顯減少。化橘紅干預(yù)后可以明顯改善糖尿病心肌病大鼠的心肌重構(gòu)（圖1）。

圖1 化橘紅與吡格列酮干預(yù)對DCM大鼠心肌病理以及超微結(jié)構(gòu)變化的影響（HE×200）

2.1.2 化橘紅抑制高糖對心肌細(xì)胞p38MAPK通路的活化 我們前期研究結(jié)果顯示，化橘紅有效成分柚皮苷具有抑制高糖引起的心肌細(xì)胞p38MAPK通路活化作用，并且發(fā)現(xiàn)可能為其保護作用機制之一，但是，化橘紅是否具有相似的作用與機制呢？為了驗證化橘紅的心臟保護作用是否通過抑制p38 MAPK途徑，化橘紅處理STZ誘導(dǎo)的DCM大鼠，觀察對心肌細(xì)胞p38MAPK通路的影響。

圖2 化橘紅干預(yù)對DCM大鼠心肌p38 MAPK激活的影響

圖2的Western blot結(jié)果顯示，DCM大鼠心肌磷酸化p38 MAPK顯著增加（表明被激活），與對照組比較，均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），但是，化橘紅提取物處理卻明顯地抑制心肌細(xì)胞磷酸化p38 MAPK表達(dá)，提示化橘紅能抑制DCM心肌細(xì)胞p38 MAPK的激活。

3 討論

糖尿病是全球流行性疾病，而心血管疾病是其主要死因，70%以上糖尿病患者死于心血管疾?。ê乃ィ?，是非糖尿病人群的2～5倍[6]。糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）與糖尿病患者心血管疾病的高發(fā)生率和高死亡率密切相關(guān)，它是糖尿病獨立于高血壓、冠心病、原發(fā)性心肌病等的慢性并發(fā)癥，是因糖、脂代謝紊亂等引起的以心臟重構(gòu)和心功能障礙為臨床特征的心血管并發(fā)癥，在糖尿病患者中發(fā)病率達(dá)16.9%[7]。然而，目前DCM 的發(fā)病機制尚未完全明了，早期特異性診斷困難，臨床上尚無有效的防治措施。因此，深入探討其發(fā)病機制和尋找有效的治療措施是當(dāng)下迫切解決的問題。

近年本課題組證實，化橘紅有效成分之一柚皮苷（naringin，NRG）可防治DCM心肌損傷，對炎癥反應(yīng)具有良好的調(diào)節(jié)作用，也能通過p38 MAPK 途徑抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[8-13]。但是化橘紅是否具有類似的心臟保護作用、是否通過抑制p38MAPK信號通路對抗DCM心肌損傷尚不明了。

為了驗證此科學(xué)問題，本研究首先觀察化橘紅對STZ誘導(dǎo)的DCM大鼠及高糖引起心肌損傷的干預(yù)效果。本研究結(jié)果顯示：STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠8～12周可引起心肌損傷改變，表現(xiàn)為：廣泛性、彌漫性心肌肥厚、變性、灶性壞死、纖維化。電鏡下，心肌纖維走行紊亂，可見部分肌絲斷裂，肌節(jié)結(jié)構(gòu)模糊，難以辨認(rèn)，線粒體明顯腫脹，部分線粒體嵴斷裂消失、細(xì)胞膜破損，線粒體基質(zhì)溶解、消失，細(xì)胞間質(zhì)纖維增生，閏盤斷裂模糊，部分融合后形成高密度電子斑塊，微血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹；肌漿網(wǎng)擴張。吞飲泡明顯減少?；偌t干預(yù)能減輕上述DCM心肌損傷。以上整體動物模型結(jié)果顯示：化橘紅提取物具有對抗糖尿病心肌病的心肌保護作用。繼而為了探討p38MAPK信號通路在DCM及化橘紅干預(yù)中的作用及機制，觀察到化橘紅干預(yù)能對DCM心肌損傷，能抑制DCM心臟p38 MAPK通路的激活，提示了化橘紅可能通過抑制p38 MAPK途徑DCM心肌損傷。

綜上所述，本研究首次驗證了嶺南道地中藥材化橘紅對糖尿病心肌病的防治作用，并且此心臟保護作用與調(diào)控DCM心肌細(xì)胞p38 MAPK通路的激活密切相關(guān)。因此本研究為進一步闡明化橘紅及其有效成分防治DCM的分子機制，為進一步產(chǎn)業(yè)化開發(fā)嶺南道地中藥材化橘紅提供理論依據(jù)，具有重大的臨床現(xiàn)實意義。

[1] 邱仕君.鄧鐵濤醫(yī)案與研究[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：86-87.

[2] 游瓊，吳鏗.柚皮苷的心血管藥理作用[J].廣東醫(yī)學(xué)，2010，31（22）：3006-3008.

[3] Kim SW，Kim CE，Kim MH.Flavonoids inhibit high glucose-induced up-regulation of ICAM-1 via the p38 MAPK pathway in human vein endothelial cells.Biochem Biophys Res Commun，2011，415（4）：602-607.

[4] 徐文明，陳景福，田麗紅，等.瘦素-p38MAPK通路介導(dǎo)高糖對H9c2心肌細(xì)胞的損傷[J].中國動脈硬化雜志，2014，22（5）：433-437.

[5] Jingfu Chen，Hailiang Mo，Runmin Guo，et al.Inhibition of the leptin-induced activation of the p38 MAPK pathway contributes to the protective effects of naringin against high glucose-induced injury in H9c2 cardiac cells.International Journal of Molecular Medicine，2014，33（3）：605-612.

[6] 吳鏗，黃瑞娜，游瓊，等.柚皮苷對糖尿病心肌病大鼠心肌的保護作用[J].國際心血管病雜志，2012，39（5）：302-305.

[7] 吳鏗，游瓊，黃瑞娜，等.柚皮苷對實驗性2型糖尿病心肌病大鼠模型糖脂代謝的影響[J].廣東醫(yī)學(xué)，2012，33（13）：1863-1866.

[8] 吳鏗，游瓊，黃瑞娜，等.柚皮苷調(diào)控心肌PPARγ表達(dá)對實驗性2型糖尿病心肌病大鼠模型心肌損傷的防治作用[J].中國藥理學(xué)通報，2012，28（4）：526-530.

[9] 游瓊，吳鏗，涂焰明，等.柚皮苷調(diào)控心肌核因子NF-κB炎癥信號通路對糖尿病心肌病大鼠防治作用[J].中國免疫學(xué)雜志，2013，29（2）：121-124.

[10] Xianchu L，Lan PZ，Qiufang L，et al.Naringin protects against lipopolysaccharide-induced cardiac injury in mice.Environ Toxicol Pharmacol.2016,48（9）：1-6.

[11] Jingfu Chen，Runmin Guo，Hai Yan，et al.Naringin inhibits ROS-activated MAPK pathway in high glucoseinduced injuries in H9c2 cardiac cells.Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology，2014，114（4）：293-304.

[12] 劉付貞，潘德茂，陳景福，等.柚皮苷抗高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷作用與抑制STAT3通路有關(guān)[J].中國動脈硬化雜志，2014，22（4）：345-350.

[13] You Q，Wu Z，Wu B，et al.Naringin protects cardiomyocytes against hyperglycemia-induced injuries in vitro and in vivo[J].J Endocrinol，2016，230（2）：197-214.

[14] 儲佳佳，李積東，雷霖，等.柚皮苷對高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及PI3K/AKT/eNOS信號通路的影響[J].中國病理生理雜志，2015，31（4）：625-629.

[15] 翟遠(yuǎn)坤，牛銀波，潘亞磊，等.柚皮苷對體外培養(yǎng)乳鼠顱骨成骨細(xì)胞增殖和分化成熟的影響[J].中國中藥雜志，2013，38（1）：105-111.

Prevention and cure effect of xocarpium Citri Grandis in diabetic cardiomyopathy rats and its mechanisms

GUO Runmin WU Zijun HUANG Ruina LIU Chang LIANG Guobiao LI Shanghai MO Hailiang YAN Hai YOU Qiong WU Keng
Department of Cardiology,The Affiliated Hospital,Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001,China

ObjectiveTo investigate prevention and cure effect of of exocarpium citri grandis (ECG) in streptozocin-induced diabetic cardiomyopathy (DCM) rats and its mechanisms.MethodsSprague-Dawley (SD) Rats were divided into DCM group,control group,ECG group (low, medium, high dose),pioglitazone group.After intragastric administration with different concentrates of ECG,myocardial histopathologic changes were measured using haematoxylin and eosin staining,p 38MAPK and cleaved caspase-3 levels were tested through Western blot assay.Ultrastructure of myocardial tissues were detected by means of electron microscopy.ResultsCompared with control group,myocardial cells apoptosis,hypertrophy,collagen deposit and ultrastructural changes in heart tissues were exacerbated,administration with ECG improved these injured alternations and inhibited expressions of p-p38 MAPK and cleaved caspase-3.ConclusionECG can prevent and treat diabetic cardiomyopathy myocardial structural damage.Its mechanisms might mediate by p 38MAPK signal pathway.

Exocarpium citri grandis;p38 MAPK;Diabetic cardiomyopathy;Apoptosis

R363

A

2095-0616（2016）19-40-04

2016-08-12）

國家自然科學(xué)基金（81670348）；廣東省重大科技專項（2012A080202020）；廣東省湛江市科技計劃項目(2014A01033)。

▲通訊作者