三維共培養(yǎng)模型下人臍靜脈內(nèi)皮細胞對鼻咽癌CNE2細胞侵襲、遷移及增殖能力的影響

梁 霞高 超唐 勇▲劉翰楠吳健勇李宇虹龐 波陳 玉

1.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院放療科，廣西南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科，廣西南寧 530021

三維共培養(yǎng)模型下人臍靜脈內(nèi)皮細胞對鼻咽癌CNE2細胞侵襲、遷移及增殖能力的影響

梁 霞1高 超2唐 勇2▲劉翰楠2吳健勇2李宇虹2龐 波2陳 玉2

1.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院放療科，廣西南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科，廣西南寧 530021

目的探討三維共培養(yǎng)下人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）對CNE2細胞侵襲、遷移及增殖能力的影響。方法采用Transwell小室對HUVEC細胞和CNE2細胞進行共培養(yǎng)，CCK-8法比較兩組實驗中CNE2細胞增殖能力，細胞計數(shù)法比較細胞遷移能力，以及Matrigel膠法比較侵襲能力。結(jié)果HUVEC與CNE2共培養(yǎng)條件下，共培養(yǎng)組遷移能力顯著高于非共培養(yǎng)組（P＜0.01）。共培養(yǎng)組侵襲能力顯著高于非共培養(yǎng)組（P＜0.01）。在增殖實驗中，共培養(yǎng)組和非共培養(yǎng)組的OD值第3天，第4天及第5天，共培養(yǎng)組的細胞增殖率顯著高于非共培養(yǎng)組（P＜0.05）。結(jié)論在三維共培養(yǎng)條件下，HUVEC對CNE2鼻咽癌細胞的侵襲、遷移及增殖能力有促進作用。

三維共培養(yǎng)模型；CNE2鼻咽癌細胞；人臍靜脈內(nèi)皮細胞；增殖；遷移；侵襲

鼻咽癌是我國南方地區(qū)常見的惡性腫瘤之一，其中廣東、廣西、湖南等地發(fā)病率最高，具有顯著的地域和種族聚集特點[1-2]。手術(shù)根治難度較大，放療是其主要治療手段[3]，但放療后復發(fā)率仍然較高，中晚期患者的五年生存率僅為50%[4]。影響鼻咽癌預后的主要因素是腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移程度，但其具體機制仍然不是十分清楚。而腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移與細胞的異常運動有關(guān)[5]，是癌細胞粘附、降解、運動及新生血管形成等多種生物學行為相互作用的結(jié)果，因此研究鼻咽癌細胞微環(huán)境對其復發(fā)及轉(zhuǎn)移的分子機制研究顯得十分重要。

血管內(nèi)皮細胞已被證實是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分[6]，本實驗主要利用三維共培養(yǎng)模型，模擬體內(nèi)鼻咽癌微環(huán)境，將人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）和人鼻咽癌細胞（human nasopharyngeal carcinoma cell，CNE2）共培養(yǎng)，探索HUVEC對CNE2的侵襲、轉(zhuǎn)移及增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

人鼻咽癌CNE2細胞系為低分化鱗狀細胞癌細胞系，以及人臍靜脈內(nèi)皮細胞均購自中科院上海細胞庫；Matrigel基質(zhì)膠、RPMI-1640、胎牛血清（FBS）、胰酶EDTA、Transwell小室（3μm和8μm）、24孔培養(yǎng)培養(yǎng)板、96孔板（美國corning公司）；PBS緩沖液（北京索萊寶公司）；CCK-8試劑（日本同仁公司）；吉姆薩染劑、4%多聚甲醛（北京碧云天公司）；細胞培養(yǎng)箱、酶標儀（美國THERMO公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)及傳代

CNE2和HUVEC常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI-1640中，于5% CO2、37.5℃飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，每2天換1次液（PBS沖洗后放入新培養(yǎng)液），2d后在倒置顯微鏡下觀察，當細胞鋪滿整個瓶壁底部約75%時用0.25%胰蛋白酶（EDTA）消化，待細胞變圓吹打混勻并傳代。

1.3 細胞侵襲實驗

配膠：Matrigel：1640培養(yǎng)液按1：6的比例配置，每個小室內(nèi)每孔鋪體積為60μL的基質(zhì)膠，37℃過夜成膠備用。共培養(yǎng)組在24孔板的下室放入含HUVEC細胞（2×104個）的完全培養(yǎng)液500μL，設(shè)置3個復孔。非共培養(yǎng)組放入等體積的不含HUVEC的完全培養(yǎng)液作為對照組處理。將此24孔板放在37.5℃、5% CO2的細胞溫箱中過夜。24h后，在兩組Transwell小室內(nèi)分別加入10×104個CNE2鼻咽癌細胞（體積200μL），然后放入37.5℃、5% CO2的細胞溫箱中培養(yǎng)48h。最后，小室背面的細胞用4%的多聚甲醛固定，然后用吉姆薩染色劑染色，用光學顯微鏡計算細胞數(shù)量。本實驗重復3次，每次設(shè)置3個復孔。

1.4 細胞遷移實驗

共培養(yǎng)組在24孔板的下室放入含HUVEC細胞（2×104個）的完全培養(yǎng)液500μL。設(shè)置3個復孔。非共培養(yǎng)組放入等體積的不含人臍靜脈內(nèi)皮細胞的完全培養(yǎng)液作為對照組處理。將這24孔板放在37.5℃、5% CO2的細胞溫箱中過夜。24h后，在兩組Transwell小室內(nèi)分別加入1×104個的CNE2細胞（體積200μL），然后放入37.5℃、5% CO2的細胞溫箱中培養(yǎng)48h。最后，小室背面的細胞用4%的多聚甲醛固定，吉姆薩染色劑染色，放在光學顯微鏡下計算細胞數(shù)目。本實驗重復3次，每次設(shè)置3個復孔。

1.5 細胞增殖實驗

采用CCK-8法檢測CNE2增殖能力，共培養(yǎng)組下室內(nèi)每孔放入含有0.5×104個HUVEC的培養(yǎng)液（體積900μL）。非共培養(yǎng)組下室放入900μL的10% FBS的培養(yǎng)液作為對照組。培養(yǎng)24h后，分別在兩組小室內(nèi)（孔徑為3μm）每孔放入0.2×104個的CNE2細胞（體積為200μL）。將這兩組放入37.5℃、5% CO2細胞溫箱中過夜。分別檢測培養(yǎng)第1～5天的OD值，測量兩個組別OD值計數(shù)，并繪制生長曲線（圖3）。本實驗重復3次，每次設(shè)置3個復孔。

1.6 統(tǒng)計學方法

運用SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以（表示，兩組獨立樣本比較用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞侵襲能力比較

HUVEC與CNE2共培養(yǎng)48h后固定染色并計數(shù)侵襲細胞數(shù)，共培養(yǎng)組CNE2侵襲數(shù)為（37.3±22.0），顯著高于非共與培養(yǎng)組（5.98±5.76），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1。

圖1 共培養(yǎng)組和非共培養(yǎng)組CNE2侵襲能力比較

2.2 細胞遷移能力比較

HUVEC與CNE2培 養(yǎng)48h后，共 培 養(yǎng) 組CNE2細胞遷移數(shù)（74.00±29.40），非共培養(yǎng)組為（20.38±17.41），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 共培養(yǎng)組和非共培養(yǎng)組CNE2遷移數(shù)目比較

2.3 增殖能力實驗

采用CCK-8法檢測CNE2細胞增殖能力，結(jié)果顯示共培養(yǎng)組和非共培養(yǎng)組的OD值第3天、第4天及第5天分別為（1.321±0.036 & 1.174±0.015，P＜ 0.05）、（1.924±0.033 & 1.666±0.088，P＜0.05）、（2.111±0.117 & 2.003±0.081，P＜0.05），提示共培養(yǎng)組CNE2細胞增殖率高于非共培養(yǎng)組（見圖3、表1）。

3 討論

圖3 共培養(yǎng)組和非共培養(yǎng)組CNE2生長曲線的比較，*P＜0.05

表1 共培養(yǎng)組與非共培養(yǎng)組CNE2細胞OD值比較（

表1 共培養(yǎng)組與非共培養(yǎng)組CNE2細胞OD值比較（

時間（d） 共培養(yǎng)組 非共培養(yǎng)組 t P1 0.207±0.008 0.105±0.139 19.13 0.00 2 0.605±0.242 0.428±0.152 1.86 0.09 3 1.321±0.036 1.174±0.015 11.36 0.00 4 1.924±0.033 1.666±0.088 8.20 0.00 5 2.111±0.117 2.003±0.081 2.27 0.04

鼻咽癌是一種源自鼻黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，其解剖位置隱匿，病理類型又多為低分化級別，且具有較高的侵襲轉(zhuǎn)移能力，是治療失敗和致患者死亡的主要原因，嚴重困擾著臨床醫(yī)生和科研工作者。腫瘤細胞的惡性能力是由相鄰內(nèi)皮細胞和細胞外基質(zhì)中的信號進行調(diào)節(jié)的，統(tǒng)稱為腫瘤細胞微環(huán)境[7]。研究表明腫瘤微環(huán)境中的細胞，尤其是周圍的內(nèi)皮細胞、巨噬細胞及炎癥相關(guān)細胞等分泌因子，通過系列的化學信號通路作用于癌細胞，促進或抑制腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移[8]。Battiston等[9]研究表明腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞之間可通過細胞外基質(zhì)的自分泌、旁分泌、雙向分泌可溶性生物因子介導復雜生物信號通路，以及通過細胞與細胞間直接接觸作用，互相影響彼此的發(fā)生發(fā)展。亦有文獻報道，腫瘤細胞可通過與相鄰的血管內(nèi)皮細胞相接觸，可引發(fā)新血管生成[10]。越來越多的研究證實腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞之間存在密不可分的關(guān)系，彼此之間有促進和依賴作用[11]。

二維細胞培養(yǎng)體系改變了細胞原有生長形態(tài)，引起細胞喪失一些原本特性，使體外實驗研究受到了一定限制，而三維共培養(yǎng)模型能模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，較好地模仿人體的細胞外基質(zhì)，進而更好的研究細胞間的相互作用[12]。Wang等[13]研究亦指出三維共培養(yǎng)在探討靜脈內(nèi)皮細胞和另一種細胞間相互作用的研究中具有重要價值，目前三維共培養(yǎng)倍受關(guān)注。

Transwell小室共培養(yǎng)是以聚碳酸酯膜分隔上、下室，因聚碳酸酯膜具有通透性，從而可以研究下層細胞或其分泌的特定因子對上室細胞的影響，進而構(gòu)建一種不直接接觸法研究一種細胞對另一種細胞影響的共培養(yǎng)模型。眾所周知腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤中危害最大生物學特性之一，可直接導致腫瘤患者的死亡。而腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，首要步驟是先穿過組織基膜，Transwell小室則可以較好地模擬體內(nèi)環(huán)境，觀察細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的改變[14]。

本研究利用Transwell小室構(gòu)建HUVEC和CNE2的三維共培養(yǎng)模型，結(jié)果顯示HUVEC對CNE2的侵襲和遷移活動有明顯促進作用。研究表明內(nèi)皮細胞可通過直接作用于癌細胞及其產(chǎn)生的細胞因子等影響腫瘤干細胞的生物學行為[15]。Cheng等[16]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞與膠質(zhì)瘤干細胞共培養(yǎng)情況下，增強了膠質(zhì)瘤干細胞的侵襲遷移能力。另有研究表明，腫瘤細胞增長到一定體積后，會分泌血管相關(guān)因子，而血管內(nèi)皮細胞主動攝取由腫瘤細胞分泌的含有表皮生長因子受體的微泡，從而激活內(nèi)皮細胞，啟動VEGF/VEGFR2信號通路，促進腫瘤新生血管生成[17]。Nikolia等[18]在HUVEC和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87MG細胞共培養(yǎng)實驗中，檢測到HUVEC的基因表達發(fā)生了改變，出現(xiàn)了Tie-2受體、VEGF-1受體、FGF-2受體等腫瘤血管內(nèi)皮細胞特有基因。而腫瘤血管生成能力是惡性腫瘤侵襲周圍組織，發(fā)生腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的重要條件之一。進一步研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞分泌的VEGF和bFGF通過刺激MMP-2和MMP9的分泌，可促進細胞外基質(zhì)降解，加速腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[19-20]。

在本研究中我們亦發(fā)現(xiàn)在三維共培養(yǎng)模型下，HUVEC促進了CNE2細胞的增殖，提示腫瘤微環(huán)境中HUVEC有利于維持CNE2細胞的活力。Bidarra等[21]研究顯示共培養(yǎng)中骨髓間充質(zhì)干細胞的細胞數(shù)量增長一直延續(xù)到第21天，且在后兩周共培養(yǎng)者的增殖率明顯高于單獨培養(yǎng)組，提示HUVE具有刺激骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的潛力。

越來越多的研究證明，內(nèi)皮細胞是癌癥進展的推進器，可以增強癌細胞自發(fā)的侵入周圍組織[22-23]，而腫瘤微環(huán)境是一個復雜多變的體系，HUVEC細胞是CNE2細胞外重要的組成成分，HUVEC與CNE2共培養(yǎng)體系中是通過何種方式誘導了鼻咽癌細胞的侵襲、遷移和增殖，仍有待進一步深入研究。

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Influence of human umbilical vein endothelial cells under the three-dimensional co culture model to invasion， migration and proliferation of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE2

LIANG Xia1GAO Chao2TANG Yong2LIU Hannan2WU Jianyong2LI Yuhong2PANG Bo2CHEN Yu2

1.Department of Radiotherapy,Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021,China;
2.Department of Urology Surgery, Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021,China

ObjectiveTo explore the influence of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC) under the three-dimensional co culture model to invasion, migration and proliferation of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE2.MethodsTranswell was used to give co culture of HUVEC cells and CNE2 cells.CCK-8 was used to compare the CNE2 cell proliferation.Cell counting method was used to compare the cell migration ability.Matrigel method was used to compare the invasive ability.ResultsUnder the co culture condition of CNE2 and HUVEC,the migration ability of co culture group was significantly higher than that of non co culture group(P＜ 0.01).The invasive ability of the co culture group was significantly higher than that in the non co culture group(P＜ 0.01).In the proliferation experiment,On the third day,fourth day and fifth day,the cell proliferation rate was significantly higher than that of non co culture co culture group(P＜0.05).ConclusionUnder three dimensional co culture conditions,HUVEC can promote the invasion,migration and proliferation of CNE2 nasopharyngeal carcinoma cells.

Three-dimensional co culture model;CNE2 nasopharyngeal carcinoma cell;Human umbilical vein endothelial cells;Proliferation; Migration;Invasion

R737.31

A

2095-0616（2016）19-36-05

2016-07-27）

國家自然科學基金資助項目（81560428）；廣西自然科學基金資助項目（2011GXNSFC018020，2012GXNSFAA053163）；廣西科學研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目（桂科攻1355005-3-11）；廣西醫(yī)療衛(wèi)生適宜技術(shù)研究與開發(fā)課題（S201301-06）；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳科研課題（Z2011226）。

▲通訊作者