淚糖與血糖的相關性及淚糖監(jiān)測的研究進展

阮佳莉 錢韶紅

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·綜 述·

淚糖與血糖的相關性及淚糖監(jiān)測的研究進展

阮佳莉 錢韶紅

糖尿病是一種慢性系統(tǒng)性疾病，目前臨床上多采用末端指尖采血監(jiān)測糖尿病患者的血糖控制水平。近年來諸多研究致力于實現(xiàn)葡萄糖監(jiān)測的實時性和無創(chuàng)性，依托淚液良好的穩(wěn)定性及易獲取性，淚液中葡萄糖含量的測定成為了炙手可熱的研究方向。部分研究表明淚糖與血糖存在一定的線性相關性，同時淚糖較之血糖的改變有一定的延時性。淚糖監(jiān)測的精準性主要受淚液分泌量、淚糖含量、淚液成分影響。目前對淚糖的在體監(jiān)測原理主要分為電化學和物理光譜2類。電化學方法主要依托葡萄糖氧化酶反應產(chǎn)生電流，物理光譜又可分為熒光光譜和光子晶體2大類。本文總結了淚糖監(jiān)測的不同方式的研究進展。(中國眼耳鼻喉科雜志，2017，17：217-221)

淚糖；淚液；電化學；物理熒光；光子晶體

近年來，糖尿病患病率逐年上升。截至2016年1月，全球范圍內(nèi)已有3億5千萬糖尿病患者，其主要表現(xiàn)為機體葡萄糖水平的異常波動，血糖控制不良會加速病程進展，并導致一系列并發(fā)癥，嚴重者可威脅生命[1-2]。目前臨床上大多采用末端指尖采血的方式評估糖尿病患者的血糖控制水平，雖已具有較好的時效性，但仍是一種有創(chuàng)而間斷的方式。近年來諸多學者致力于研究葡萄糖的實時、無創(chuàng)監(jiān)測，淚液、尿液、汗液作為體表可以獲取的體液成分備受關注，而其中，淚液以其良好的穩(wěn)定性及易獲取性成為當下研究熱點。利用角膜接觸鏡良好的生物相容性，借助于電化學或物理光譜的方式，為實現(xiàn)糖尿病患者葡萄糖水平的無創(chuàng)實時監(jiān)測提供了可能。

1 淚糖含量及其與血糖的相關性

在正常機體狀態(tài)下，淚液作為眼球表面的水性膜結構，既負責潤滑眼表，又起著營養(yǎng)角膜的作用。葡萄糖作為淚液的重要成分，從1930年開始，就有學者通過提取人和動物的淚液來測定其葡萄糖濃度[3-7]，但由于技術條件有限，各研究結果之間存在較大的差異(Ridley- 3.6 mmol/L；Borsellino- 1.5 mmol/L；Giardini- 0.14 mmol/L；Gasset- 0.23 mmol/L)。而近幾年，隨著技術的進步及測量方式的改進，不同研究結果中淚糖值趨于近似。2006年，Lane等[8]發(fā)現(xiàn)，在正常人群中，空腹狀態(tài)下淚糖濃度波動范圍為 0.1～0.6 mmol/L，均值為(0.16 ± 0.03) mmol/L；而在糖尿病患者中，淚糖的波動范圍較大，均值為(0.35±0.04) mmol/L。2014年，La Belle等[9]發(fā)現(xiàn)在淚糖值為0.44 mmol/L。2016年，Chen等[10]發(fā)現(xiàn)在血糖值為5.3 mmol/L時，淚糖值為(0.14 ± 0.03)mmol/L；而在血糖值為18.2 mmol/L時，淚糖值為(1.28±0.05)mmol/L。

無論在糖尿病患者還是正常人群組，血糖與淚糖之間存在一定的正性相關性。Lane等[8]將其表示為f= y0 +a×x(a為相關系數(shù))，但其實驗中兩群組的相關系數(shù)存在一定差異；Daun等[11]提出淚糖和血糖的相關系數(shù)(r)為 +0.53；Jeffery等[9]發(fā)現(xiàn)在血糖波動范圍為4.16～8.88 mmol/L時，淚糖波動在0.22～1.11 mmol/L范圍內(nèi)，其相關性表示為TG=0.1723BG(R2=0.754 4，mg/dL)，其中TG表示淚糖，BG表示血糖。必須指出，不同監(jiān)測方式對相關系數(shù)產(chǎn)生了比較大的影響，而相關系數(shù)反映了兩者的相關性，根據(jù)不同的檢驗條件，需達到一定的界值。如何進一步提高兩者的相關系數(shù)，將是接下來的研究需要完善的。另外，有學者將 0.61 mmol/L作為定義餐后糖尿病患者的淚糖界限值[12]。

隨著血糖的改變，淚糖的變化存在一定延時性。Lane等[8]發(fā)現(xiàn)，在空腹糖耐量試驗中，正常群組的淚糖峰值較血糖峰值有60 min的延時性，而糖尿病組的淚糖存在2個峰值，分別出現(xiàn)在試驗進行30 min和90 min時，血糖峰值出現(xiàn)在試驗60 min時。更多的研究表明淚糖較血糖改變的時間差約為30 min[9, 13-14]，其中La Belle等[9]發(fā)現(xiàn)血糖和淚糖之間存在著一個約13 min的時間差，淚糖改變較血糖改變滯后。由于檢測方式的差異，各研究間存在一定差異。

盡管近幾年對淚糖的研究依賴不同的檢測方式和技術水平已經(jīng)有了長足的進步，對其正常值和波動范圍以及其與血糖之間的關系有了初步的認識，但如何進一步明確淚糖在更大樣本量乃至人群的標準值及提高其與血糖間相關性的可信性，仍需要做更多的工作。

2 淚糖測定的影響因素

2.1 淚液的總量 淚液是主要由淚腺分泌的一種水樣液體,通過瞬目運動覆蓋在眼表形成淚膜[15-16]。 正常清醒狀態(tài)下,結膜囊內(nèi)淚液的體積為 (7±2) μL，角膜表面的體積為 7.0 μL；滲透壓為 295～309 mOsm/L；pH范圍為5.20～8.35,平均為7.35。分泌速率為16 h分泌 0.5～0.6 mL淚液，即 1.2 μL /min[17]。然而，淚液的分泌存在基礎分泌和反射分泌之分，并且兩者差異主要為水含量明顯增加，可相差數(shù)十倍：副淚腺受副交感神經(jīng)支配，主要負責基礎淚液中的水性成分分泌，同時也可反射性分泌；主淚腺受交感神經(jīng)支配，負責反射性和心因性淚液分泌；結膜上皮細胞會根據(jù)結膜表面電解質(zhì)和代謝物的情況分泌水分和離子，淚液流量可達 1～2 μL /min ，在基礎淚液的產(chǎn)生中占到相當大的比例，可達25%。淚液總量小，并且遇刺激后水含量明顯增多，為淚糖監(jiān)測的精確性增大了難度。

2.2 淚液的成分 淚液作為一種復雜的體液成分，除了水和電解質(zhì)外，還含有含氮物質(zhì)、糖類、寡核苷酸、甾醇、有機酸、維生素、酶類和脂類,其中水分占98%～99%[18]。電解質(zhì)主要為Na+(120～170 mmol/L)、K+(6～26 mmol/L)、Cl-(100 mmol/L)[4]，Asher等[19]利用3-氨基苯硼酸晶膠陣列測定葡萄糖濃度時發(fā)現(xiàn)只有在水溶液中發(fā)生響應，而在加入Na+(150 mmol/L)的緩沖液中則無法產(chǎn)生響應。淚液中含有乳糖，乳糖較葡萄糖對硼酸羥基有更好的親和力。在血液中其濃度為葡萄糖的1/10。Badugu等[20]認為這種關系同樣存在于淚液中，可不將乳糖作為重要的誤差因素。由此，在采用不同測定原理時必須充分考慮淚液相關成分的影響。

2.3 淚膜的穩(wěn)定性 淚液在角鞏膜表面形成穩(wěn)定的淚膜，傳統(tǒng)意義上，淚膜分為3個部分：表層脂質(zhì)層 0.1 nm(瞼裂開放時)，中間水樣層 7 μm，最內(nèi)層黏蛋白層 20～50 nm。最近的研究[8]認為淚膜厚約 40 μm。淚膜結構的穩(wěn)定對維持淚液中水分含量十分關鍵，表層的脂質(zhì)層由瞼板腺分泌的甾醇脂等組成，可防止下層水分蒸發(fā)及提供光滑光學面。瞼板腺功能障礙會導致淚膜中水分蒸發(fā)，從而影響淚液的滲透壓及淚液中葡萄糖的含量。

2.4 淚液的采集方式 研究表明，麻醉狀態(tài)可通過影響神經(jīng)系統(tǒng)信號傳遞抑制淚液的分泌，全身麻醉和結膜局部麻醉后淚液分泌量劇減,而全身麻醉時淚流率甚至近于零。由于淚液存在基礎分泌和反射分泌，在淚糖的體外監(jiān)測中，淚液的采集方式顯得尤為重要。目前，我們將其分為3種方式[21-23]。①物理刺激(淚糖值最高)：通過吸收淚液的材料對結膜或角膜的刺激獲取淚液,主要包括濾紙、纖維海綿和棉棒；②化學刺激：可用催淚的物質(zhì)通過刺激以獲取淚液,例如洋蔥、氨水、甲醛等；③非刺激性：毛細管吸取。目前較多采用毛細管吸取以避免人為刺激淚液分泌產(chǎn)生的誤差。

2.5 眼局部疾病及全身疾病 眼部的疾患，如干眼癥、眼表的炎癥、角結膜的疾患、眼前段的術后狀態(tài)(如小梁切除術后的濾過泡的存在)均會影響淚液的含量、成分，或者淚膜的穩(wěn)定性或涂布，從而影響淚糖含量。Schargus等[24-25]研究發(fā)現(xiàn)干眼癥患者淚膜滲透壓發(fā)生改變，其相關系數(shù)為R=0.727。淚液中的蛋白質(zhì)可為諸多眼部疾病提供預警[26]，淚腺分泌蛋白和炎癥反應蛋白在干眼癥患者中發(fā)生改變，在瞼板腺疾病(meibomian gland disease, MGD)患者熱敷治療后發(fā)現(xiàn)，其淚液中一些兩性的脂類增加；而研究表明，這些分子在維持淚膜穩(wěn)定方面有重要的作用。

淚液作為體液的一部分，在保持自身穩(wěn)態(tài)的同時，也參與全身體液的循環(huán)代謝，所以一些全身疾病也可影響淚液，從而影響血糖。研究[24]發(fā)現(xiàn)，在類風濕關節(jié)炎患者中，淚液的滲透壓和金屬蛋白酶-9(MMP-9)發(fā)生改變。當然，全身系統(tǒng)十分復雜，不同疾病對淚液的影響仍需進一步研究。

3 淚糖監(jiān)測

3.1 淚液葡萄糖體外監(jiān)測 隨著測量技術的革新和一些高精度設備的出現(xiàn)，淚液體外監(jiān)測方式不斷改進。1982年，Daum等[11]采用葡萄糖脫氫法，原理為利用葡萄糖脫氫酶(GHD)特異催化β-D葡萄糖和NAD+(NADP+)生成D-葡萄糖酸內(nèi)酯和NADH(NADPH),后者在 340 nm吸光度發(fā)生改變，淚液需量為 5 μL，測得正常人群淚糖均值(0.42±0.36) mmol/L。1983年，Mediratia等[27]采用葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, GOD)法，淚液樣本 13 μL，測得正常人群淚糖為(0.19±0.04) mmol/L，糖尿病組淚糖為(1.10±0.26) mmol/L。該方法的原理為利用GOD和過氧化物酶(POD)兩步反應后生成紅色醌類物質(zhì)與葡萄糖含量成正比。2006年Song等[28]采用高效液相色譜(HPLC)-脈沖安培電流法,淚液進樣量為 5 μL，測得正常人群淚糖為(0.16±0.03) mmol/L，糖尿病組淚糖為(0.35±0.04) mmol/L。2007年，Baca等[29]采用電噴霧電離質(zhì)譜法(ESI-MS),淚液進樣量為 1 μL，測得正常人群淚糖均值0.028 mmol/L。2009年，Schierbeek等[30]采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)，最小進樣量為 20 μL，測得正常人群淚糖為(0.081±0.027)mmol/L，糖尿病組淚糖為(0.460±0.204)mmol/L。2016年，Chen等[10]利用熒光共振技術測定鼠在5.8 mmol/L血糖值時淚糖為(0.14 ± 0.03) mmol/L，進樣量為2 μL。在體外的監(jiān)測下，淚液樣本量少對實現(xiàn)淚糖精準性起了非常重大的影響。淚液的體外監(jiān)測仍有很大的局限性：其一，采集足夠的淚液需要花費一定的時間，而淚糖與血糖低變化存在時間差；其二，淚糖的濃度較低，并不是所有方法均可提供足夠的可靠性。

3.2 淚液葡萄糖的在體監(jiān)測 諸多研究試圖建立基于角膜接觸鏡的葡萄糖傳感器，來實現(xiàn)人體葡萄糖濃度的無創(chuàng)且實時監(jiān)測[29]。依托于角膜接觸鏡，一是角膜接觸鏡在臨床上已有廣泛應用，具有生物安全性；同時，角膜接觸鏡方便攜帶，一次利用[20, 31]。目前，角膜接觸鏡被越來越多地用于傳感器的研究，不僅用于研究葡萄糖[32]，也應用于眼壓、電解質(zhì)、蛋白成分等[33]。鑒于日拋式角膜接觸鏡的生物安全性，Domschke等[34]第1次將埋植有傳感器的角膜接觸鏡佩戴在糖尿病患者角膜上，并進行了30 min人體臨床試驗，試配性能良好。試驗結果表明該傳感器可以實現(xiàn)家庭式的實時監(jiān)測?？偨Y來看，基于角膜接觸鏡的淚糖傳感器的發(fā)展可按照監(jiān)測機制分為2個部分：一是基于電化學原理的傳感器[10, 35-39]，二是基于物理光譜原理的傳感器；又可分為熒光光譜法[36, 40-42]和埋植光子晶體的水凝膠法[43-46]。

3.2.1 基于電化學原理的淚糖傳感器 電化學原理簡言之即利用GOD產(chǎn)生反應，產(chǎn)生離子電流，依托電極電路來測定電流，從而測定淚糖濃度[47]。1995年Mitsubayashi等[48]構造了1個可彎曲的電化學傳感器來測定淚液、唾液、汗液中的葡萄糖含量。后來諸多學者[32-33, 36, 49-51]進行了改進。Yao等[36]提出了通過佩戴角膜接觸鏡監(jiān)測人體葡萄糖含量的可能性，并詳細說明了整合安培計的角膜接觸鏡(即探針)的設計、構造及探針葡萄糖測試過程：在聚合物襯底上構建2種物質(zhì)，一是用二氧化鈦溶膠-凝膠膜固定的GOD，用于反應；二是全氟磺酸隔膜，以排除淚液中有關成分可能產(chǎn)生的干擾，如乳酸、抗壞血酸等。然后再將這種聚合物襯底貼附于角膜接觸鏡上，連接外接電路。實驗表明，在淚糖濃度范圍內(nèi)，其電流值與淚糖值存在良好的線性相關性。為了實現(xiàn)機體可適性，Chu等[32]采用可彎曲的電極材料(Pt作為工作電極， Ag/Cl作為參比電極)，將其用聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)，黏附于角膜接觸鏡，同時用PMEH將GOD黏附于電極表面，并將最終的傳感器用于動物實驗。它不僅可以直接貼附于眼球表面，也可以變形后放置于淚囊內(nèi)。后有諸多學者對電極進行了改良，包括氧化物電極、納米電極等。Peng等[37]利用基于葡萄糖酶的電流原理制備微型探針，通過檢測提取的不同時刻的兔淚液(樣本量要求可低至3 μL)，發(fā)現(xiàn)血糖與淚糖值之間存在線性相關性，且R2=0.8603。理想的基于電化學原理的傳感器包含了電源、信號轉換器、電路、探針4個部分[47, 52-53]。它的優(yōu)點在于時效性高，可在20 s內(nèi)進行響應；靈敏度高，最小可監(jiān)測出0.01 mmol/L的物質(zhì)；反應專一，對其他物質(zhì)具有較好的抗干擾能力；同時線性相關性好，重復性好。它的缺點在于外接設備繁復，無法攜帶；同時，目前還無法證實在機體復雜的內(nèi)穩(wěn)態(tài)下其反應不受影響。

3.2.2 基于物理光譜的淚糖傳感器 依托于物理光譜，實際上為一類方法的統(tǒng)稱，已運用的包括近紅外光譜法[46, 54]、光散射法、偏振法[55]、離子強度+晶格光衍射法[46, 56]等。我們將其分為熒光光譜法和光子晶體水凝膠法。

3.2.2.1 基于熒光光譜的淚糖傳感器 熒光光譜法原理：在葡萄糖的作用下，熒光指示劑性質(zhì)發(fā)生改變，產(chǎn)生熒光或熒光淬滅，而其強度與葡萄糖濃度有關[41-42, 57-58]。有研究者[7, 59]首先將光譜應用于眼部研究，他們將2種結合的熒光指示劑(結合狀態(tài)下無熒光)聚合在角膜接觸鏡上，葡萄糖可發(fā)生競爭性的結合，指示劑發(fā)生解離，借助眼前手持的接收器就可以探測到該熒光[36]。另有學者利用葡萄糖競爭反應，觀測熒光配體的淬滅來測定葡萄糖濃度。優(yōu)點在于反應專一、可逆；缺點在于仍需外部設備監(jiān)測熒光的改變，同時其精確度無法實現(xiàn)淚糖濃度范圍內(nèi)的監(jiān)測。

3.2.2.2 基于光子晶體水凝膠的淚糖傳感器 埋植光子晶體的水凝膠傳感器原理在于，光子晶體是一種有序排列的晶膠陳列，具有良好的光衍射特性，在入射光為可見光的條件下，衍射光的顏色會隨著其光子帶隙的改變而改變。將含葡萄糖響應基團(多數(shù)為羥基類物質(zhì))的水凝膠填充到光子帶隙中，即實現(xiàn)葡萄糖濃度后，光子帶隙改變，肉眼可見物質(zhì)顏色改變。有研究者[29, 56, 60-62]早在1993年即提出利用光子晶體良好的光衍射特性構建隨葡萄糖濃度改變而改變顏色的傳感器；2003年其構建的傳感器[晶膠陣列(聚苯乙烯)+凝膠(聚苯烯酰胺)+化學修飾]可對 5～20 mmol/L范圍的葡萄糖水溶液產(chǎn)生響應，肉眼可觀傳感器顏色發(fā)生紅移[19]；后改進原料[晶膠陣列(聚苯乙烯)+凝膠(聚苯烯酰胺)+PEG(聚丙烯酰胺)+化學修飾]實現(xiàn)在含Na+( 130 mmol/L)溶液(模擬生理條件)對葡萄糖的監(jiān)測，具有Na+依賴性[56]；2006其通過對晶膠陣列的修飾(正己基丙烯酸酯)，縮短了反應時間,5 mmol/L葡萄糖用時90 s，0.15 mmol/L葡萄糖用時300 s[60]。優(yōu)點在于實時觀測，用肉眼可見的顏色改變來評估葡萄糖水平。缺點在于安全性可疑，過多的化學反應及涉及的單體等；靈敏性差，對低濃度( 0～1 mmol/L)響應能力差；精確性低，肉眼可見顏色的改變只有在葡萄糖濃度波動足夠大時才可觀測。

2013年Hu等[46]利用近紅外晶膠陳列(NIR-PCCA)構建傳感器，隨生理條件下淚糖濃度提高，其近紅外光(波長1 722 nm)強度下降，可被監(jiān)測。提高了光子晶體水凝膠類傳感器的靈敏度，最低響應的葡萄糖濃度為 0.33 mmol/L,但近紅外光段肉眼不可見。

盡管淚糖的在體監(jiān)測的確有許多新的研究成果，但其監(jiān)測難度依然存在。除了考慮上述的影響因素之外，也需要考慮：基于淚糖濃度個體間的差異如何實現(xiàn)傳感器的校正；如何實現(xiàn)傳感器的預警功能，尤其是夜間睡眠狀態(tài)下；同時也需將患者的視覺質(zhì)量和生物安全性納入考量。

4 結語

總之，淚糖和血糖之間存在相關性，借助角膜接觸鏡的在體淚糖傳感器，已具有較好的機體可適性。但同時，如何實現(xiàn)淚糖監(jiān)測的靈敏性、精確性、專一性、時效性、預警系統(tǒng)之間的統(tǒng)一，仍需要做大量的研究工作。對糖尿病患者而言，通過監(jiān)測淚糖以達到無創(chuàng)、實時監(jiān)測機體葡萄糖水平具有一定的潛能。

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(本文編輯 諸靜英)

Relationship between tear glucose and blood glucose and the development of monitoring tear glucose

RUANJia-li,QIANShao-hong.
DepartmentofOphthalmology,EyeEarNoseandThroatHospitalofFudanUniversity,Shanghai200031,China

QIAN Shao-hong, Email: qsh2304@163.com

Diabetes mellitus is a chronic systemic disease. At present, the blood glucose level of diabetic patients is mostly monitored by the end finger blood sampling. In recent years, many researchers have been making efforts in the realization of glucose monitoring both real-time and non-invasive. Relying on the good stability and easy accessibility of tear, the glucose content determination becomes a hot research field. There was a linear correlation between tear glucose and blood glucose, and there was a certain delay in the changes of tear glucose compared with the blood sugar in some researches. Accurate monitoring of tear glucose is mainly affected by the amount of tear secretion, tear sugar content, tear composition. At present, the principle of the measurement of tear glucose in the body is mainly divided into two categories, the electrochemical way and physical spectra. Electrochemical methods mainly rely on the reaction of glucose oxidase to produce electric current, and the physical spectrum can be divided into two categories: fluorescence spectrum and photonic crystal. This paper summarizes the research progress of the different ways of the monitoring of tear glucose. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2017,17:217-221)

Tear glucose; Tear; Electrochemistry; Physical fluorescence; Photonic crystal

復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 上海 200031

錢韶紅(Email: qsh2304@163.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2017.03.020

2016-12-01)