葛根素對(duì)氧誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜新生血管模型PECAM-1及VEGF表達(dá)的影響

岑璐莎

葛根素對(duì)氧誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜新生血管模型PECAM-1及VEGF表達(dá)的影響

岑璐莎

目的 觀察葛根素對(duì)氧誘導(dǎo)大鼠玻璃體血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和視網(wǎng)膜血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（PECAM-1）表達(dá)的影響，探討其對(duì)新生血管的抑制作用。方法 初生SD大鼠12只，建立氧誘導(dǎo)初生大鼠新生血管模型，隨機(jī)分成空白組、葛根素小劑量組及葛根素大劑量組，每組4只。通過熒光素眼底血管造影觀察各組新生血管滲漏區(qū)域改變，免疫熒光染色觀察PECAM-1表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定玻璃體VEGF表達(dá)量。結(jié)果 新生血管滲漏程度、PECAM-1、VEGF表達(dá)隨葛根素劑量增加而減少；與空白組比較，葛根素小劑量組、大劑量組玻璃體液中VEGF表達(dá)均明顯降低[（56.58±0.89）pg/mL、（50.72±0.67）pg/mL比（89.11±1.93）pg/mL，P＜0.01]。結(jié)論葛根素可通過抑制VEGF及PECAM-1表達(dá)，抑制氧誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜新生血管增生。

大鼠；視網(wǎng)膜新生血管;葛根素；VEGF；PECAM-1

視網(wǎng)膜新生血管是由眼內(nèi)疾病引起的，可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜水腫、出血、脫離等嚴(yán)重影響視力的并發(fā)癥，常見于糖尿病視網(wǎng)膜病變[1]。既往相對(duì)有效的治療手段包括眼底光凝及玻璃體腔注射抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等，均存在治療周期長(zhǎng)、治療費(fèi)用昂貴、治療效果不確切等缺點(diǎn)[2-3]。葛根素為中藥豆科葛屬植物野葛中提取的異黃酮類有效成分，具有血管保護(hù)和改善循環(huán)的作用[4]。我們建立大鼠視網(wǎng)膜新生血管模型，通過眼底血管造影觀察視網(wǎng)膜新生血管情況，觀察葛根素對(duì)氧誘導(dǎo)大鼠玻璃體VEGF及視網(wǎng)膜血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（platelet endothelial cell adhesion mole-cule-1，PECAM-1）表達(dá)的影響，初步探討葛根素對(duì)視網(wǎng)膜新生血管的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD初生大鼠12只，SPF級(jí)，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0004。

1.2 試劑及儀器 葛根素（四川省玉鑫藥業(yè)有限公司）、熒光素鈉鹽（Sigma Aldrich，中國(guó)上海）、PECAM-1抗體（Affinity，中國(guó)江蘇）、ELISA VEGF試劑盒（欣博盛，中國(guó)深圳）、海德堡眼底激光造影儀（海德堡，德國(guó)）、5415D 型離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）、水浴恒溫箱（DK-8）、電子顯微鏡（6V30W）、電熱恒溫孵育箱（DNP-9082）（上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠視網(wǎng)膜新生血管模型的建立[5]SD初生大鼠氧氣飼養(yǎng)箱選用30L玻璃干燥器，出口外接三通管。進(jìn)氣管給予特定濃度的氮氧混合氣體，控制氣流量0.75～0.85L/min，使容器內(nèi)氧氣分壓保持穩(wěn)定。初生當(dāng)天給予氧含量為50%的氮氧混合氣體，第二天換為10%的氮氧混合氣，如此交替更換至出生后第14天，母鼠和乳鼠放回常氧環(huán)境飼養(yǎng)。造模期間用測(cè)氧儀檢測(cè)容器內(nèi)氧的濃度，控制室溫在23℃±2℃，每天打開一次容器更換墊料，加食，換水，替換正?？諝猸h(huán)境下的母鼠。出生后第18天即到正?？諝獾牡?天時(shí)，進(jìn)行鼠尾靜脈注射20%熒光素鈉0.03mL/kg。使用熒光素眼底血管造影（fluorescein fundus angiography，F(xiàn)FA）經(jīng)眼底照相觀察動(dòng)物模型眼底視網(wǎng)膜新生血管情況，確認(rèn)視網(wǎng)膜新生血管形成，確定大鼠視網(wǎng)膜新生血管模型構(gòu)建成功。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 模型建立成功后，12只大鼠隨機(jī)分為空白組、葛根素小劑量組、葛根素大劑量組，各4只，分別予生理鹽水5mL/（kg·d）、葛根素250mg/（kg·d）、葛根素500mg/（kg·d）灌胃，1天1次，給藥時(shí)間為4周。

1.3.3 活體熒光素眼底血管造影（FFA）檢測(cè) 三組最后一次給藥后12h，鼠尾靜脈注射20%熒光素鈉0.03mL/kg，進(jìn)行活體FFA的檢測(cè)，方法同前。

1.3.4 視網(wǎng)膜鋪片免疫熒光染色檢測(cè)PECAM-1 大鼠麻醉后，立即摘除眼球，用4%多聚甲醛溶液固定24～48h，剪開鞏膜，去掉眼前節(jié)和玻璃體，將眼后段平均分成4份，在水中輕輕漂取視網(wǎng)膜；清水漂洗2～3h，將視網(wǎng)膜放入3%胰蛋白酶消化液中，在37℃恒溫箱中孵育2～3h，將視網(wǎng)膜輕輕移入蒸餾水中，輕輕吹打，使殘余的視網(wǎng)膜神經(jīng)成分及內(nèi)界膜完全脫去，剩下一層透明的視網(wǎng)膜血管膜，再置于0.1%TritonX-100中4℃孵育過夜。移到載玻片上鋪平，用PBS沖洗2×5min，加1滴PECAM-1抗體，室溫下孵育1h，用PBS沖洗3×5min，滴加一滴TRITC標(biāo)記的驢抗兔IgG二抗，室溫下避光孵育1h，用PBS沖洗3×5min，封片，觀察結(jié)果。

1.3.5 ELISA檢測(cè)玻璃體液VEGF含量 取各組大鼠眼球，用纖維眼科剪去除大鼠眼球前節(jié)，剪開眼球，分離玻璃體部分，30μL微量注射器吸取玻璃體液，10 000rpm離心30s，采用ELISA試劑盒檢測(cè)玻璃體液VEGF的含量，具體步驟按說明書進(jìn)行。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組大鼠VEGF表達(dá)量以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠FFA檢測(cè)比較 FFA檢測(cè)結(jié)果顯示，新生血管滲漏程度隨葛根素劑量增加而減少（圖1，插頁(yè)）。以視盤為界將視網(wǎng)膜劃分為四個(gè)象限，空白組（圖1A，插頁(yè)）：白色滲漏區(qū)域顏色濃密，范圍累及全視網(wǎng)膜；葛根素小劑量組（圖1B，插頁(yè)）：滲漏區(qū)顏色變淡，隱約可見新生血管走行，范圍累及約3/4視網(wǎng)膜；葛根素大劑量組（圖1C，插頁(yè)）：上方周邊部視網(wǎng)膜見片狀新生血管滲漏灶，色淡，范圍累及小于1/4視網(wǎng)膜。

2.2 三組大鼠視網(wǎng)膜鋪片免疫熒光染色檢測(cè)PECAM-1比較 免疫熒光結(jié)果顯示，空白組血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（PECAM-1）表達(dá)明顯，葛根素大劑量組熒光表達(dá)明顯降低，但小劑量組熒光強(qiáng)度無明顯下降（圖2，插頁(yè)）。

2.3 三組大鼠玻璃體血管VEGF表達(dá)比較 模型建立后大鼠玻璃體液中VEGF表達(dá)較高，經(jīng)過葛根素灌胃的大鼠玻璃體液中VEGF表達(dá)明顯降低，葛根素小劑量組（56.58±0.89）pg/mL、葛根素大劑量組（50.72±0.67）pg/mL，與空白組（89.11±1.93）pg/mL 比較明顯減低（P＜0.01）。

3 討論

葛根素主要成分為異黃酮類化合物，被作為血管保護(hù)藥物廣泛應(yīng)用于臨床，治療糖尿病視網(wǎng)膜病變療效顯著。葛根素能改善糖尿病視網(wǎng)膜病變的血液流變學(xué)和血流動(dòng)力學(xué)狀況[6]，既往研究針對(duì)葛根素的分子機(jī)制較少，且多采用糖尿病大鼠模型進(jìn)行研究。葛根素能抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF的表達(dá)[7]，與本研究結(jié)果一致，但是葛根素有降血糖的作用[8]，不能排除是葛根素直接抑制VEGF表達(dá)，還是通過降低血糖從而抑制VEGF表達(dá)。本研究排除血糖因素干擾，采用氧誘導(dǎo)大鼠新生血管模型，該建模方法由Smith等首先提出[5]，具有簡(jiǎn)便、快捷、結(jié)果可靠、重復(fù)性強(qiáng)等特點(diǎn)，經(jīng)過近年來的發(fā)展和改進(jìn)，已成為應(yīng)用最廣泛的視網(wǎng)膜血管新生建模的方法。

視網(wǎng)膜血管新生是一個(gè)多因素參與的過程。VEGF是導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管新生的主要因素[9]。VEGF由視網(wǎng)膜細(xì)胞合成，玻璃體VEGF含量隨著視網(wǎng)膜缺血缺氧的程度加重而增加[10]。臨床研究也表明，在視網(wǎng)膜新生血管疾病如早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變等中，VEGF均有高表達(dá)[11]，且玻璃體VEGF與增生性視網(wǎng)膜病變嚴(yán)重程度有一定相關(guān)性[12]?？筕EGF治療為目前治療視網(wǎng)膜新生血管的重要手段，主要采用玻璃體腔內(nèi)注射抗VEGF藥物?？筕EGF藥物費(fèi)用昂貴，一支藥物自費(fèi)需要近萬元，且抗VEGF的藥物半衰期均短，每4～6周需要重復(fù)治療，治療效果不確切，不能徹底清除新生血管，隨著藥效消失，新生血管可重新出現(xiàn)[13]。玻璃體腔注射為有創(chuàng)治療，會(huì)導(dǎo)致晶體損傷、視網(wǎng)膜脫離、眼內(nèi)炎等并發(fā)癥[13]。本研究表明，葛根素能抑制玻璃體液中VEGF表達(dá)，提示葛根素能夠通過抑制VEGF，抑制視網(wǎng)膜新生血管增生。

血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（PECAM-1）是免疫球蛋白超家族的成員,在內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用和血管發(fā)育中起重要作用[14]。在血管生成過程中，PECAM-1高水平表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面[15]。Dimaio等[16]使用PECAM-1先天缺乏的小鼠建立氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管模型，視網(wǎng)膜新生血管增生程度顯著降低，也間接證實(shí)PECAM-1在血管增生中的重要作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)隨著葛根素劑量增大，PECAM-1表達(dá)也降低，提示葛根素通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞黏附作用來抑制血管新生，與臨床研究發(fā)現(xiàn)葛根素具有降低血液黏稠度，改善微循環(huán)的作用[17]相一致。

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Effect of Puerarin on the Expression of PECAM-1 and VEGF in Hyperoxia-induced Retinopathy of Rats

CEN Lusha

Department of Ophthalmology,Zhejiang Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of puerarin on the expression of vascular endothelial growth fac tor（VEGF） and platelet endothelial cell adhesion molecule 1（PECAM-1） in hyperoxia-inducedretinopathy of rats.MethodsRat models of hyperoxia-induced neovascularization were established（n=12）.Models were divided into blank,small-dose puerarin,and large-dose puerarin groups（n=4,each）.The leakage area was observed using fluorescein fundus angiography,the expression of PECAM-1 and VEGF in vitreum was detected by immunofluorescence staining and ELISA,respectively.ResultsPuerarin administration reduced neovascularization leakage area,inhibited PECAM-1 and VEGF expressions in a dose-dependent manner.Compared with blank,the expression of VEGF in small-dose group and large-dose group were decreased（56.58±0.89pg/mL and 50.72±0.67pg/mL vs 89.11±1.93pg/mL,P＜0.01）.ConclusionPuerarin can inhibit the hyperoxia-induced retinal neovascularization in rats by inhibiting the expression of VEGF and PECAM-1.

rats;retinal neovascularization;puerarin;VEGF;PECAM-1

浙江省中醫(yī)院眼科（杭州 310006）

（收稿：2017-02-20 修回：2017-05-24）