組織蛋白酶S與惡性腫瘤

張智郭鵬肖藝孫興徐靜彭濤吳曙粵黃海

作者單位：530022 南寧1南寧市第一人民醫(yī)院肝膽腺體外科；530021 南寧2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科；530022 南寧3南寧市第一人民醫(yī)院兒科；530021 南寧4廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔外科

綜述

組織蛋白酶S與惡性腫瘤

張智1郭鵬4肖藝1孫興1徐靜2彭濤2吳曙粵3黃海1

作者單位：530022 南寧1南寧市第一人民醫(yī)院肝膽腺體外科；530021 南寧2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科；530022 南寧3南寧市第一人民醫(yī)院兒科；530021 南寧4廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔外科

組織蛋白酶S（Cathepsin S，Cat S）是一種半胱氨酸蛋白酶，屬于木瓜蛋白酶家族成員之一，不僅在多種生物體中表達，而且參與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，Cat S與肝癌、肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移以及預(yù)后等密切相關(guān)，推測其有望成為多種腫瘤臨床診治的新靶點。本文就Cat S與這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系、調(diào)控分子機制、診斷和治療等相關(guān)研究進展作一綜述。

腫瘤；組織蛋白酶S；診斷；治療

惡性腫瘤的發(fā)生率及病死率較高，嚴重危害人類健康，因此，探索新的、特異性的腫瘤預(yù)后標志物是目前臨床研究的熱點。組織蛋白酶（Cathepsin）屬于木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶，參與編碼人類基因組2.8%的蛋白，同時還參與細胞內(nèi)異常蛋白質(zhì)的降解［1］，調(diào)控細胞內(nèi)信號通路、受體活性及趨化因子、細胞因子的活性［2］。研究表明組織蛋白酶和阿爾茨海默病、哮喘、肺纖維化、癌癥等疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3-5］。

人類組織蛋白酶包括十五名成員，根據(jù)活性位點分為三組：（1）絲氨酸（Cat A和G）；（2）天門冬氨酸（Cat D和E）；（3）半胱氨酸蛋白酶（Cat B、C、F、H、K、L、O、S、V、W和X）。此外，半胱氨酸組織蛋白酶還可以根據(jù)蛋白水解活性分成以下兩組：（1）主要表達內(nèi)切肽酶活性的Cat S、K、V、F和L；（2）同時表達內(nèi)切和外切肽酶活性的Cat B、H、X和C［6］。研究表明，Cat S是半胱氨酸蛋白酶家族中的重要成員，主要在淋巴結(jié)抗原呈遞細胞、脾臟和其他免疫細胞中表達，參與細胞外基質(zhì)、抗血管生成肽和黏附蛋白的降解，促進新生血管形成和腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移［7］。

近年研究顯示，Cat S在肝癌、肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤中呈高表達，與這些腫瘤的生物學(xué)特性及發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，本文就Cat S與這些腫瘤關(guān)系的相關(guān)研究進展作一綜述。

1 Cat S的基因結(jié)構(gòu)與腫瘤血管形成的相關(guān)機制

Kregar等［8］和Turnsek等［9］首次將Cat S從牛淋巴組織（1975年）和脾臟（1980年）中分離純化出來，并且命名為Cathepsin S。1992年Shi等［10］通過PCR技術(shù)首次從人肺泡巨噬細胞中提取了人類Cat S基因的cDNA，并且證實其與牛Cat S基因cDNA堿基序列有85%高度相似性，并因此而命名。Cat S屬半胱氨酸蛋白水解酶，分子質(zhì)量為24 kDa。1998年，McGrath等［11］通過X線技術(shù)證實了其晶體結(jié)構(gòu)圖。Cat S通常分布在淋巴結(jié)、脾臟、心臟及抗原提呈細胞，分別與Cat L、Cat H、Cat B有57%、41%、31%的序列同源性［10］。研究證明腫瘤細胞可將Cat S從溶酶體分泌到腫瘤微環(huán)境中［12］，在中性pH環(huán)境下參與細胞外蛋白水解作用［13］。

人類Cat S屬于單基因表達產(chǎn)物，其基因定位于人染色體I q21，包含5個外顯子和5個內(nèi)含子，上游調(diào)控序列包含SP I結(jié)合位點2個，API結(jié)合位點18個，GC含量占40%，但不包含TATA或CMT盒子［14］。具有酶活性的Cat S為單鏈蛋白，由331個氨基酸組成，含一個信號域，包含3個a螺旋，分別位于氨基酸位點25～40、50～56及68～78；另外還含有一個前肽域，包括6個0折疊片及一個a螺旋。兩個結(jié)構(gòu)域之間形成具有催化活性的狹長裂隙，由25～40位點的a螺旋、157～161及130～133位點的0折疊片構(gòu)成，含有S1、S2、S3 3個底物結(jié)合口袋，內(nèi)含具有催化活性的Cys25、Hisl59及Asnl75三聯(lián)子，可以與底物相結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)活性［11］。

目前關(guān)于Cat S生物學(xué)功能的研究主要集中在以下兩個方面：（1）通過調(diào)節(jié)MHCCII抗原遞呈，誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)；（2）誘導(dǎo)新生血管形成，促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移［15］。本文重點綜述Cat S誘導(dǎo)腫瘤血管形成促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機制。

研究表明，Cat S影響腫瘤血管生成包括以下兩方面：（1）參與細胞外基質(zhì)酶的降解。Cat S的底物廣泛，其對高彈性蛋白水解活性的降解成為研究的熱點。Cat S的底物-細胞外彈力蛋白與新生血管形成、腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［16］。Cat S的退化產(chǎn)物促進了新生血管形成，彈力蛋白-腫瘤細胞相互作用促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，Cat S可與MMPs、絲氨酸蛋白酶等相互作用，參與細胞外基質(zhì)的降解［17］。有學(xué)者［18-19］通過低密度脂蛋白受體和Cat S雙陰性的小鼠動物模型發(fā)現(xiàn)動脈斑塊形成和彈力層碎片減少，這提示Cat S參與了細胞外彈性蛋白的降解。此外，腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中誘導(dǎo)產(chǎn)生VEGF、bFGF等血管生成因子作用于內(nèi)皮細胞，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞活化，進一步誘導(dǎo)Cat S分泌，參與基底膜和周圍的細胞外基質(zhì)降解，促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［20］。（2）抑制抗血管生成肽的分泌。Shi等［21］通過培養(yǎng)內(nèi)皮細胞，加入VEGF血管生成因子，通過ELSA實驗檢測細胞培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)VEGF可促進Cat S的表達，而Cat S抑制劑Cystatin C可明顯抑制血管的生成。恰當?shù)幕|(zhì)降解是內(nèi)皮細胞遷移和毛細血管形成所必需的，同時可以誘導(dǎo)血管新生物質(zhì)如堿性成纖維細胞生長因子的分泌，使他們具有血管新生活性從而誘導(dǎo)腫瘤新生血管形成。Wang等［22］通過構(gòu)建Cat S陰性的胰島細胞瘤裸鼠模型，發(fā)現(xiàn)沉默Cat S基因后可明顯抑制腫瘤新生血管形成，抑制腫瘤生長。其可能的分子機制是Cat S刺激層黏連蛋白產(chǎn)生血管生成前體γ2碎片，并且抑制IV型膠原來源的抗血管生成肽增殖，從而促進血管生成。Burden等［23］研究發(fā)現(xiàn)靶向Cat S的單克隆抗體Fsn0503可以顯著抑制結(jié)腸癌HCT116細胞外Cat S對蛋白的水解作用，抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖、腫瘤和新生血管形成。以上研究結(jié)果均提示Cat S在誘導(dǎo)血管生成，促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。

2 Cat S與惡性腫瘤

越來越多的證據(jù)表明，Cat S通過促進細胞外基質(zhì)（層黏連蛋白、纖連蛋白、彈性蛋白和膠原蛋白）的降解，參與VEGF等生長因子分泌而促進新生血管形成，從而促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［24-26］。Cat S與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，其在組織和血清中的含量對腫瘤診療等方面可能具有重要的臨床應(yīng)用價值，已成為目前研究的熱點之一。

2.1 Cat S與肺癌

研究發(fā)現(xiàn)，CL1-5細胞過表達Cat S基因，沉默Cat S基因可以明顯抑制肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移，此外過氧化氫（H202）可明顯抑制細胞克隆形成并且呈時間（50μmol H2O2作用0.5 h、1 h、2 h、4 h和6 h）和劑量依賴性（2.5～50μmol H2O2分別作用24 h）［27］。Kos等［28］選擇73例肺癌患者（62例原發(fā)性非小細胞肺癌、11例轉(zhuǎn)移性肺癌），通過W estern blot分析Cat S的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺癌組織Cat S的表達是正常肺組織的2倍，更為重要的是原發(fā)性肺癌組織Cat S的表達量高于繼發(fā)性肺癌組織（P=0.01）；Cat S表達和肺癌TNM分期無關(guān)，但與生存率呈正相關(guān)。由此推測Cat S在肺癌組織中的表達有望作為一個獨立預(yù)測因子，成為肺癌治療和評估預(yù)后的指標。

2.2 Cat S與結(jié)直腸癌

Small等［29］通過RNA干擾技術(shù)沉默結(jié)直腸癌MC38細胞的Cat S基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可明顯抑制其侵襲（62%，P=0.0001），同時伴隨金屬蛋白酶2（matrix metallo proteinase 2，MMP2）和MMP9蛋白的下降，提示Cat S可能通過調(diào)控MMP2和MMP9參與結(jié)直腸癌的發(fā)生。Vazquez等［16］通過MTT實驗分析表明，靶向Cat S的單克隆抗體FSN0503h可明顯抑制人結(jié)直腸癌Colo-205細胞增殖（P＜0.05），進一步提示Cat S與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，認為可將CatS作為結(jié)直腸癌治療的重要靶向蛋白，為結(jié)直腸癌治療提供新的策略。

2.3 Cat S與前列腺癌

Lindah l等［30］通過Western blot實驗檢測9例前列腺癌根治性手術(shù)的標本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和正常組織相比，前列腺癌組織標本Cat S表達明顯增高（P=0.023），提示Cat S在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。

2.4 Cat S與乳腺癌

研究表明慢性炎癥與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切［31］。Basu等［32］利用RT-PCR技術(shù)分析69例乳腺癌患者和719例正常人外周血的超敏C-反應(yīng)蛋白（high-sensitivity C-reaction protein，hsCRP）與Cat S的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cat S和hsCRP表達同時增高的人群乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險（OR=0.46；95%CI=0.23～0.92；P=0.02）低于僅hsCRP增高的人群（OR=2.01；95%CI=1.02～3.95；P=0.04），提示Cat S和hsCRP關(guān)系密切，但相關(guān)機制尚未進一步驗證。

2.5 Cat S與胃癌

Liu等［33］通過ELISA實驗檢測119例胃癌患者和99例正常人外周血Cat S的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和正常人相比胃癌患者Cat S的表達明顯增高（P＜0.001），術(shù)后比術(shù)前明顯下降（P＜0.001），利用免疫組化和Western blot實驗進一步驗證胃癌組織和SGC7091、MGC803、AGS胃癌細胞也得出相同的結(jié)論。作者還發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中，Cat S的表達水平與年齡、性別、吸煙、飲酒無關(guān)，而與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)（P＜0.001）。通過Kaplan-Meier分析患者5年生存率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cat S的表達和患者生存期呈負相關(guān)，檢測的敏感性為60.7%，特異性為90.0%。由此表明，檢測胃癌組織中Cat S的表達可作為胃癌治療和評估預(yù)后的有用指標。

2.6 Cat S與星形細胞瘤

Zhang等［34］通過Cat S抑制劑ZFL（24 h IC50：U251 mg，18.68μmol；U87mg，23.10μmol）作用于人星形膠質(zhì)瘤細胞（U251 mg和U87mg），流式細胞儀檢查顯示：抑制劑ZFL通過自噬誘導(dǎo)U251 mg和U87 mg細胞凋亡，并且呈時間和劑量依賴性，進一步通過Western blot實驗分析發(fā)現(xiàn)，ZFL可抑制星形膠質(zhì)瘤細胞Cat S、p-AKT、mTOR和p70S6K蛋白的表達，提示抑制劑ZFL通過阻斷PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信號通路抑制Cat S表達，進而誘導(dǎo)U251 mg和U87 mg細胞凋亡。Flannery等［35］通過PCR實驗發(fā)現(xiàn)星形細胞瘤Cat S的mRNA表達水平明顯增高，通過免疫組化實驗檢測了31例腦星形細胞瘤（I級5例、Ⅱ級10例、Ⅲ級5例、Ⅳ級11例）Cat S的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其和腫瘤分級呈正相關(guān)。進一步通過細胞侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，Cat S抑制劑LHVS29可明顯抑制星形膠質(zhì)細胞侵襲，并且呈濃度依賴關(guān)系（10 nmol/L和50 nmol/L的LHVS29抑制率分別為49%和61%（P＜0.0001），這提示Cat S可作為預(yù)測星形細胞瘤預(yù)后的指標。

2.7 Cat S與肝癌

Xu等［36］通過免疫組化實驗檢測63例肝癌組織標本（男性58例，女性5例，平均年齡45歲），結(jié)果提示，和正常肝組織相比，肝癌組織Cat S表達增高1.8倍，與Child分級呈正相關(guān)。Fan等［37］通過RNA干擾技術(shù)沉默MHCC97-H肝癌細胞CatS基因的表達，結(jié)果可抑制細胞侵襲、遷移和人臍靜脈細胞小管形成。Wang等［38］通過慢病毒沉默MHCC97-H肝癌細胞Cat S基因的表達，流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn),和正常肝癌細胞相比，沉默Cat S基因后可抑制細胞凋亡（30.07%vs 18.58%）；Western blot實驗發(fā)現(xiàn)沉默Cat S基因后可誘導(dǎo)NF-κB蛋白的表達。Lee等［39］通過免疫組化檢測42例肝癌組織標本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CatS的表達和CD47呈正相關(guān)。此外作者通過RNA干擾技術(shù)沉默Huh-7肝癌細胞Cat S基因表達后可上調(diào)NF-κB蛋白的表達，進而誘導(dǎo)細胞凋亡。Zhang等［40］通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)蜂毒素可調(diào)控CatS誘導(dǎo)肝癌血管生成。作者通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-shRNA-Cat S質(zhì)粒，有效沉默肝癌MHCC97-H細胞Cat S基因表達，結(jié)果提示，和沉默Cat S基因組比較，4μg/mL和8μg/mL蜂毒素作用下可抑制正常MHCC97-H細胞組細胞克隆形成［（36.1±8.7）%vs（6.5±8.9）%，P＜0.05］、細胞遷移［（22.5± 2.1）%vs（1.5±1.9）%，P＜0.05］和細胞侵襲［（42.9±3.9）% vs（5.2±7.4）%，P＜0.05］，并下調(diào)CatS、VEGF-A、p-VEGFR-2、Ras、p-Raf、p-MEK1和p-ERK1/2蛋白的表達，且呈濃度依賴關(guān)系，提示蜂毒素有望成為Cat S抑制劑，為靶向治療與Cat S相關(guān)的肝癌提供新的理論支持。

3 展望

Cat S基因作為一個新的促癌基因，許多研究已顯示該基因過表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有望成為治療惡性腫瘤的新靶點。但仍存在一些問題，如Cat S基因是否為廣譜促癌基因，能否作為腫瘤早期診斷的指標。此外，Cat S基因的促癌分子機制尚不清楚，仍需要進一步研究。盡管如此，該基因仍有望在腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、診斷與治療中發(fā)揮重要的作用。隨著對Cat S基因研究不斷深入，將為腫瘤防治提供新思路和新觀點。

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［2016-10-05收稿］［2016-12-16修回］［編輯 江德吉］

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1674-5671（2017）01-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.01.16

廣西醫(yī)科大學(xué)青年科學(xué)基金資助項目（GXMUYSF201542）；南寧市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃資助項目（20153012，20163130）

黃海。E-mail：Huanghaidr＠163.com