糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的研究進(jìn)展*

張賢梅 江 波 孫勤國

武漢市第三醫(yī)院中醫(yī)科，武漢 430060

·文獻(xiàn)綜述·

糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的研究進(jìn)展*

張賢梅 江 波 孫勤國△

武漢市第三醫(yī)院中醫(yī)科，武漢 430060

據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會(huì)2015年發(fā)布《糖尿病地圖》：目前，全球估計(jì)有4.15億糖尿病患者，其中75%的糖尿病人群生活在中低收入國家，每6秒就有1人因糖尿病死亡，糖尿病消耗全球12%醫(yī)療費(fèi)用，推測到2040年，全球糖尿病患病人數(shù)將達(dá)到42億，其相關(guān)費(fèi)用將突破8 020億美元，中國患病人數(shù)將達(dá)1.1億[1-2]。面對(duì)如此嚴(yán)峻的形式，必須做好糖尿病的三級(jí)預(yù)防，大家在探究最佳管理模式、最佳用藥方案的同時(shí)，發(fā)病機(jī)制及新藥的研究將是未來研究的主要方向之一，不論是發(fā)病機(jī)制探討還是新藥的開發(fā)都離不開實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立，目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的糖尿病模型建立標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過程中多根據(jù)糖尿病臨床表現(xiàn)、胰島素依賴性、遺傳特性等來建立糖尿病的近似實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型?，F(xiàn)就近幾年相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)建立糖尿病動(dòng)物模型的常用相關(guān)要點(diǎn)進(jìn)行綜述，期望在此有所參考。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

1.1 自發(fā)性模型動(dòng)物

自發(fā)性糖尿病模型動(dòng)物是指由于先天性或遺傳因素在自然條件下可發(fā)生糖尿病的動(dòng)物，其發(fā)生、發(fā)展近似人類糖尿病病理改變過程。這些動(dòng)物包括小鼠、大鼠、地鼠、非人靈長類動(dòng)物、新西蘭白兔、犬等，其中小鼠包括KK-Ay、ob/ob、db/db等單基因突變鼠、新西蘭肥胖(New Zealand obese，NZO)小鼠、NSY(Nagoya-Shibata-Yasuda)小鼠等；大鼠包括GK(Goto Kakizaki)大鼠、Zucker(fa/fa)大鼠和OLETF(Otsuka Long-Evans Tokushima fatty)大鼠等；地鼠以中國地鼠(Chinese hamster)為主，非人靈長類動(dòng)物有獼猴、食蟹猴和樹鼩等。常用類似人類1型糖尿病模型動(dòng)物包括非肥胖糖尿病(non-obese diabetic，NOD)小鼠、BB(bio breeding)大鼠、LETL(Long-Evans Tokushima lean)大鼠、新西蘭白兔(New Zealand white rabbit)、荷蘭毛獅犬(Keeshond dog)、中國倉鼠(Chinese hamster)等，其中以NOD小鼠、BB大鼠最多。ob/ob、db/db、Zucker、GK、KK-Ay等動(dòng)物因具有高血糖、高胰島素血癥、高三酰甘油血癥、胰島素抵抗等類似人類2型糖尿病過程的主要特征[3]常被用于2型糖尿病模型動(dòng)物。自發(fā)性的非人靈長類動(dòng)物糖尿病病癥非常類似人類2型糖尿病，但因其非常難得，很難廣泛應(yīng)用。這類動(dòng)物因價(jià)格昂貴，飼養(yǎng)要求高，個(gè)體差異大在國內(nèi)較少應(yīng)用。

1.2 轉(zhuǎn)基因模型動(dòng)物

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物主要是指用實(shí)驗(yàn)方法敲除內(nèi)源基因或轉(zhuǎn)入外源基因，在染色體組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動(dòng)物，這些敲除或者突變的基因會(huì)導(dǎo)致胰島素受體的敏感性下降及胰島素抵抗的發(fā)生。MKR小鼠因骨骼肌特異性胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)功能的缺失在出生5周后表現(xiàn)為明顯胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞功能紊亂及脂代謝紊亂等，且其存活率高，是一種研究2型糖尿病的極好模型動(dòng)物；GK/IRS-1為雙基因剔除小鼠，表現(xiàn)2型糖尿病癥狀，既有胰島素抵抗又有糖耐量異常；青幼年發(fā)病的成年型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young，MODY)是2型糖尿病的一個(gè)亞型，有5種蛋白質(zhì)的基因缺失或突變；MC4R(melanocortin 4 receptor)通過敲除MC4R基因建立的動(dòng)物模型，可以用來研究具有肥胖、高胰島素、高瘦素、貪食等特征的2型糖尿病[4-5]。這類動(dòng)物因技術(shù)水平要求高，操作復(fù)雜，精密儀器配備齊全，價(jià)格非常昂貴，目前國內(nèi)尚處于摸索階段。

1.3 誘發(fā)性模型動(dòng)物

誘發(fā)方法包括手術(shù)誘導(dǎo)、化學(xué)藥物誘導(dǎo)和飲食誘導(dǎo)。手術(shù)誘導(dǎo)是切除全部或部分胰腺，造成糖尿病模型，狗、豬、兔和大鼠切除70%或90%胰腺能夠造成糖尿病模型。化學(xué)藥物誘導(dǎo)是通過鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、四氧嘧啶(alloxan，ALX)等藥物注射至模型動(dòng)物，破壞動(dòng)物的胰島功能而產(chǎn)生高血糖、胰島素抵抗等，這些動(dòng)物包括SD、Wistar大鼠，C57BL/6J小鼠、KM小鼠、長爪沙鼠、新西蘭兔、恒河猴、Beagle犬、樹鼩、云南省版納微型豬等。至于這些種屬區(qū)別，比較研究報(bào)道不多：35 mg/kg STZ一次性腹腔注射法顯示W(wǎng)istar大鼠造模結(jié)果優(yōu)于SD大鼠[3]；70 mg/kg一次性尾靜脈注射法顯示ICR小鼠在成模率及血糖值方面均優(yōu)于KM、NIH小鼠[6]；同等條件下STZ對(duì)C57比KM小鼠作用要緩慢[7]；C57BL/J6小鼠造模成功率較KM、ICR和BALB/c小鼠高[8]。特殊膳食誘導(dǎo)主要是給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物過量的食物或高蛋白、高脂、高糖飲食，使動(dòng)物胰島β細(xì)胞負(fù)荷過重發(fā)生萎縮而引發(fā)糖尿病，沙鼠、土古鼠和小非洲刺毛鼠是重要的膳食誘導(dǎo)的肥胖模型和2型糖尿病模型[9]。這類動(dòng)物因價(jià)格相對(duì)便宜，耗時(shí)短，易于操作，現(xiàn)為國內(nèi)較普遍的模型動(dòng)物選擇。手術(shù)誘導(dǎo)因手術(shù)操作復(fù)雜、耗時(shí)長、切除后胰島的再生難以控制等，現(xiàn)已很少應(yīng)用，目前國內(nèi)外最常用的誘發(fā)方法為化學(xué)藥物聯(lián)合飲食誘導(dǎo)。

1.4 動(dòng)物性別、體重的選擇

夏旋等[10]認(rèn)為雄鼠對(duì)STZ更敏感，發(fā)現(xiàn)8周齡雄大鼠成模率最高，小鼠性別對(duì)STZ敏感性依次為：雄小鼠>去勢雄小鼠=去勢雌小鼠>雌小鼠。李莉等[11]通過對(duì)SD大鼠腹腔注射STZ也得出雄鼠造模優(yōu)于雌鼠的結(jié)論，分析認(rèn)為這與性激素有關(guān)。葉華虎等[12]研究認(rèn)為雌性動(dòng)物較雄性動(dòng)物對(duì)ALX更敏感，在使用ALX復(fù)制糖尿病模型時(shí)，雄性動(dòng)物較雌性動(dòng)物所需劑量通常要高20%左右。王曉琳等[13]則認(rèn)為雄鼠對(duì)STZ的敏感性高于雌鼠，同時(shí)還得出不同性別大鼠可能建立不同類型糖尿病模型的結(jié)論，Wistar大鼠通過高脂飼料加腹腔注射25 mg/kg STZ造模，雌性大鼠可建立2型糖尿病模型，雄性大鼠則更類似1型糖尿病模型，明確提出低劑量STZ加膳食誘導(dǎo)方法要準(zhǔn)確制備出2型糖尿病模型，必須選擇雌性大鼠。奚清麗等[14]通過優(yōu)化組合認(rèn)為體重27～29 g的雄性小鼠腹腔注射ALX后成模率較高、死亡率較低，是血糖持續(xù)較穩(wěn)定的糖尿病小鼠模型。劉鷗飛等[15]研究認(rèn)為體重在151～200 g的大鼠對(duì)ALX的敏感性最高，造模成功率最大，死亡率最低。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飲食

多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道高脂飲食更能模擬糖尿病模型特點(diǎn)，認(rèn)為高脂食物調(diào)控FOXA2和HNFlA兩個(gè)關(guān)鍵蛋白，擾亂胰島素分泌β細(xì)胞和監(jiān)控血糖濃度的能力，通過高脂飲食造成外周組織對(duì)胰島素不敏感，還有高血脂，再加小劑量化學(xué)誘導(dǎo)劑導(dǎo)致胰島的病理改變，造成胰島損傷，最終導(dǎo)致高血糖癥的發(fā)生。其配方是在普通飼料基礎(chǔ)上加一定比例的豬油、蔗糖、膽固醇、蛋黃粉、膽酸鹽、奶粉等。喂養(yǎng)時(shí)間一般是4～12周，因種屬差別、飼料配方比例不同而有差異，最長有云南省版納微型豬喂養(yǎng)達(dá)12個(gè)月之久。朱超等[3]認(rèn)為高脂高糖飼養(yǎng)時(shí)間長短與STZ劑量大小關(guān)系很大，考慮到動(dòng)物的年齡及造模后續(xù)的實(shí)驗(yàn)時(shí)間，建議高脂高糖飼養(yǎng)時(shí)間4周左右為宜。王保偉等[16]給予大鼠高脂飼料喂養(yǎng)4周后腹腔注射STZ 30 mg/kg，成模率高達(dá)85%，喂養(yǎng)8周后腹腔注射相同體質(zhì)量STZ，死亡率達(dá)65%，10周后體重增長速度明顯降低。蔡爽等[17]則認(rèn)為高脂高糖飲食飼養(yǎng)6周后小劑量STZ注射效果最好。孫麗華等[18]研究強(qiáng)調(diào)單純注射STZ或高脂高糖飲食不能復(fù)制理想的糖尿病模型，二者對(duì)血糖異常具有相互促進(jìn)作用，同樣認(rèn)為高糖高脂膳食6周后血糖升高顯著，血清胰島素水平降低。

3 誘導(dǎo)劑的應(yīng)用

3.1 誘導(dǎo)劑的選擇及優(yōu)化

目前常用誘導(dǎo)劑有STZ和ALX，亦有較少文獻(xiàn)報(bào)道金硫葡萄糖(gold thioglucose，GTG)、D-半乳糖、谷氨酸鈉、地塞米松、氫化可的松等。STZ致糖尿病的基本機(jī)制可能在于β細(xì)胞通過胞膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體2(GLUT-2)攝取STZ，STZ可能通過氧化氨和(或)甲基化損傷DNA，NO可以誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡，DNA損傷使得多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)過度激活而使β細(xì)胞因能量衰竭而死亡和伴發(fā)糖尿病神經(jīng)、心肌并發(fā)癥，STZ更可能通過抑制氮乙酰葡萄糖胺糖苷酶(OGN)使得乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)堆積，影響胰島素的釋放[8]。聯(lián)合煙酰胺或抑制醛糖還原酶效果更好，劉斌等[19]應(yīng)用STZ聯(lián)合煙酰胺(腹腔注射煙酰胺60 mg/kg，15 min后腹腔注射STZ 65 mg/kg)誘導(dǎo)糖尿病Wistar大鼠成功率比單獨(dú)誘導(dǎo)組(腹腔注射與煙酰胺等量的生理鹽水，15 min后腹腔注射65 mg/kgSTZ)高，死亡率低，認(rèn)為煙酰胺可以保護(hù)胰島功能，使胰島素功能部分保留，使動(dòng)物最大程度的產(chǎn)生中等的、穩(wěn)定的高血糖癥。梁佳欣[20]認(rèn)為抑制醛糖還原酶對(duì)小劑量多次注射STZ誘導(dǎo)的l型糖尿病小鼠模型有顯著保護(hù)作用。ALX導(dǎo)致糖尿病機(jī)制認(rèn)為是其游離氧基能氧化β細(xì)胞的DNA單鏈，使染色體發(fā)生異常，引起細(xì)胞畸變，并能抑制β細(xì)胞的多種代謝，增強(qiáng)其細(xì)胞膜的通透性而破壞β細(xì)胞。有研究[21]認(rèn)為以STZ聯(lián)合ALX(40 mg/kg×4 d+100 mg/kg×1 d)可提高造模成功率，單獨(dú)使用ALX(220 mg/kg)造模成功率較低，單獨(dú)使用STZ(40 mg/kg×4 d)造模成功率居中，而總膽固醇偏高。綜合比較，STZ造模優(yōu)于ALX，STZ半衰期較長(15 min)，具有造模穩(wěn)定、快速、種屬選擇性不強(qiáng)(豚鼠只能用STZ造模)、組織毒性相對(duì)較小、致死率較低等優(yōu)點(diǎn)，但其價(jià)格較ALX貴[7]。二者緩沖液均用PH 4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液作溶媒，較生理鹽水作溶媒的成模率明顯增高，要求現(xiàn)配，避光，冰浴保存[22]。

3.2 誘導(dǎo)劑的干預(yù)方式及時(shí)間

誘導(dǎo)劑的干預(yù)方式有腹腔注射和靜脈注射2種，其中靜脈注射包括耳緣靜脈(兔)、尾靜脈(鼠)、下肢淺靜脈(犬)。一般認(rèn)為靜脈給藥效果優(yōu)于腹腔給藥，何學(xué)令等[23]以3%ALX靜脈給藥較腹腔給藥表現(xiàn)出明顯的“三多一少”癥狀，ALX的血漿半衰期僅1～2 min，故注射越快成模率越高。注射STZ時(shí)，鹽水導(dǎo)入(即尾靜脈給藥前先導(dǎo)入鹽水再推STZ溶液)可以大幅度降低STZ尾靜脈注射造模時(shí)的死亡率(6.52%)，提高成模率(73.9%)。干預(yù)時(shí)間，一般認(rèn)為空腹給藥效果好，空腹給藥可以增加胰島細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)劑的敏感性，用較低的藥物劑量就可以破壞胰島功能。一般禁食時(shí)間10～16 h為宜[24-27]。

3.3 誘導(dǎo)劑的給予頻次

綜合文獻(xiàn)分析，不管是ALX還是STZ，小劑量多次注射和大劑量單次注射均能獲得糖尿病模型，但單次大劑量注射造成的生理變化和血糖波動(dòng)比小劑量多次注射更為劇烈[28]。韋立順等[29]用1%STZ溶液按照150 mg/kg一次性腹腔注射35～40 g雄性昆明種小鼠，造模成功率83.3%，血糖在1～8周內(nèi)均維持在較高水平，且胰腺和腎臟出現(xiàn)組織形態(tài)變化。70 mg/kg×5 d STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型成功率高，死亡率低，且很穩(wěn)定，至少可以維持12周[30]。孟建波等[31]用5%ALX給新西蘭兔連續(xù)2次小劑量(第1次按80 mg/kg，24 h后按120 mg/kg)經(jīng)耳緣靜脈快速注射給藥，其效果優(yōu)于一次性(150 mg/kg)高劑量給藥。此外，有報(bào)道[32]采用大劑量一次性注射的給藥方法，建立的大鼠模型與人類l型糖尿病相似，采用小劑量分次給藥的方法，建立的大鼠模型與人類2型糖尿病相似。

3.4 誘導(dǎo)劑的給予劑量

至于劑量則因種屬差異、飲食搭配、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、模型判定標(biāo)準(zhǔn)不同而不同。成雪等[33]研究認(rèn)為50 mg/kgALX為制備Beagle犬糖尿病模型的一次性腹腔注射的最佳劑量。在高脂飼料喂養(yǎng)4周基礎(chǔ)上，125 mg/kgSTZ一次性腹腔注射雌性KM小鼠造模效果最佳[34]。45 mg/kg是短期高糖高脂飲食聯(lián)合STZ腹腔注射建立2型糖尿病Wistar大鼠模型的最佳注射劑量[35]。50 mg/kg的STZ注射雄性恒河猴，雖成模率不如70 mg/kg，但可使該動(dòng)物模型疾病病程延長，其維持高血糖狀態(tài)達(dá)1年余[36]。在高糖高脂飼料喂養(yǎng)5周后，25 mg/kg×2 d STZ腹腔注射SD大鼠，可建立大鼠2型糖尿病模型[37]。樊志奇等[38]研究認(rèn)為50 mg/kg×3 d尾靜脈注射1%ALX是18～22 g小鼠最佳制備小鼠糖尿病模型的方法。高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周后，認(rèn)為70 mg/kg的STZ為KM鼠和C57鼠最佳腹腔注射劑量[5]。

4 成模標(biāo)準(zhǔn)的判定

目前，國內(nèi)外對(duì)糖尿病模型成功標(biāo)準(zhǔn)尚無統(tǒng)一規(guī)定，多數(shù)除了觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物“三多一少”癥狀外，根據(jù)文獻(xiàn)或設(shè)置空白對(duì)照組進(jìn)行比較，有用空腹血糖≥6.1 mmol/L，和(或)隨機(jī)血糖或OGTT 2 h≥11.1 mmol/L，以隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L居多，且持續(xù)4～12周，作為模型成功的標(biāo)準(zhǔn)，單純研究模型還可測定血清胰島素、血脂、尿糖或鏡下觀察模型動(dòng)物胰腺組織形態(tài)學(xué)變化，與空白組對(duì)照來判定模型成功與否。具體則因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的飲食、禁食時(shí)間、動(dòng)物種屬等的差異而有所不同。韋立順等[29]以小鼠禁食12 h尾尖取血測血糖≥16.7 mmol/L，并鏡下觀察胰腺及腎臟組織形態(tài)學(xué)變化為標(biāo)準(zhǔn)探索實(shí)驗(yàn)性糖尿病模型的建立方法。王嘉惠等[39]在高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)SD大鼠，以空腹血糖≥7.0 mmol/L作為模型成功標(biāo)準(zhǔn)，并以O(shè)GTT、胰島素敏感指數(shù)等評(píng)價(jià)模型穩(wěn)定性和有效性。

5 展望

糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立是研究糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制、藥學(xué)代謝及作用機(jī)制等的基礎(chǔ)，也是實(shí)驗(yàn)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。根據(jù)目前研究報(bào)道，多數(shù)選擇小劑量多次腹腔注射STZ誘導(dǎo)高脂飲食4～6周的SD、Wistar大鼠及C57BL/6J、KM小鼠的造模方式。在具體研究過程中，常有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬、誘導(dǎo)方法、實(shí)驗(yàn)條件以及技術(shù)等的差別和限制，無法確定同一種屬在特定條件下使用誘導(dǎo)劑的量、方式、時(shí)間以及最終成模情況。在此，有望在糖尿病模型研究方面有統(tǒng)一的參考方法和判定標(biāo)準(zhǔn)，為糖尿病及其并發(fā)癥相關(guān)方面的研究奠定更穩(wěn)固的基石。

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10.3969/j.issn.1674-4616.2017.02.018

*湖北省武漢市衛(wèi)計(jì)委科研項(xiàng)目(No.WZ14A02)

2017-01-21)

△通信作者，Corresponding author，E-mail：sunqg0919@qq.com