濱海河口區(qū)黑藻的耐鹽堿性及氮磷凈化效果?

李楊楊， 陳友媛,2**， 孫 萍， 陳廣琳(. 中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院，山東 青島 26600； 2. 中國海洋大學海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島 26600)

濱海河口區(qū)黑藻的耐鹽堿性及氮磷凈化效果?

李楊楊1， 陳友媛1,2**， 孫 萍1， 陳廣琳1
(1. 中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院，山東 青島 266100； 2. 中國海洋大學海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島 266100)

濱海河口區(qū)水體鹽堿含量高，生態(tài)景觀蕭條，亟需篩選既能耐鹽堿又能有效去除氮磷的植物。采用實驗室水培實驗，分析黑藻(Hydrillaverticillata)在鹽堿混合脅迫下的生長狀況、生理響應以及對鹽堿水體中氮磷去除效果。結果表明：黑藻在pH =7、pH= 8和pH =9脅迫下，能耐受的最高鹽度分別為9、6和3。在其耐鹽堿范圍內，植株長勢良好，含水率與對照組相比降幅在5%以內，酶活性穩(wěn)定，在鹽度小于6刺激下葉綠素含量略有升高；在其鹽堿耐受范圍外，黑藻細胞膜透性變大，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性下降，滲透物質調節(jié)能力差，脯氨酸與Na+含量最高可達對照組的4.67和9.13倍，此時黑藻生長受阻，對氮、磷的凈化效果較差。

黑藻；鹽堿混合脅迫；生理響應；氮磷凈化；濱海河口區(qū)

青島市李村河下游河道受到海水的潮汐、往復運動的影響，導致該地區(qū)的水體鹽度及pH過高。高鹽堿度使許多植物受到滲透傷害和離子毒害，產生生理干旱，從而長勢變差，最終死亡甚至消亡[1]，致使濱海地區(qū)景觀蕭條。

鹽堿會對植物產生滲透脅迫、氧化脅迫、離子毒害，造成植物營養(yǎng)虧缺、破壞物質-能量平衡[2]，使不耐鹽堿植物的生長受到抑制，降低了植物去除氮磷的能力。植物的成活率、相對生長速率、含水量可直觀地反映植物耐鹽堿性強弱[3]；葉綠素含量、膜滲透性、酶活性等生理指標能更準確的表征植物耐鹽堿程度[4]。而鹽堿脅迫產生的大量活性氧(ROS)導致細胞膜脂過氧化作用加劇，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性顯著降低。而在鹽堿脅迫下，有些植物可通過脯氨酸、甘露糖醇，果聚糖，海藻糖等有機小分子的合成以及Na+、K+、Cl-等無機離子的積累調節(jié)滲透平衡[5]，提高植物的鹽堿適應能力，進一步增加植物對鹽堿環(huán)境中氮、磷等營養(yǎng)鹽的吸收。

植物由于可同化吸收營養(yǎng)鹽而被廣泛應用于生態(tài)浮島以修復地表水體和污水[6]。目前國內外的關于耐鹽堿植物的研究主要集中在堿蓬[7]、羊草[8]、堿地膚[9]等耐鹽性較好的鹽生植物以及苧麻[10]、水稻[11]、燕麥[12]等具有經濟價值的作物，黑藻繁殖能力強，生長速度快，對鹽堿的耐受性較好，且有一定的攝取營養(yǎng)鹽的能力，是一種理想的凈化污水沉水植物[13]。研究表明，黑藻對水體中氨氮和磷具有較高的去除率，經過黑藻的凈化，水體中磷和氮的濃度達到規(guī)定標準而且顯著地提高了水體中溶解氧水平，說明黑藻具有明顯改善水質的特性[14-15]。

本研究選用濱海地區(qū)較為常見的黑藻(Hydrillaverticillata)為研究對象，針對其最敏感的幼苗期，通過測量黑藻生長、生理指標以及分析其對水體中氮磷的去除效率，探討了 (1)黑藻在鹽堿脅迫下生長狀況和耐鹽堿性；(2)鹽堿脅迫下黑藻的細胞膜脂過氧化反應和滲透調節(jié)作用；(3)黑藻對鹽堿水體中氮磷的凈化效果。皆在為濱海高鹽堿水體的污染防治提供一種優(yōu)選物種，同時對我國河口退化的生態(tài)系統的恢復與重建提供一定參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗植物

黑藻：俗稱溫絲草，是水鱉科、黑藻屬單子葉多年生沉水植物，莖細長直立、葉帶呈披針形，葉緣較小為鋸齒形，無葉柄喜生于湖泊，池塘等淡水水體[16]。黑藻由于其具有生存范圍廣，生長繁殖快[17]，富集營養(yǎng)鹽能力強以及有效維持水下生態(tài)系統結構的穩(wěn)定[14]等優(yōu)點而被廣泛用于治理富營養(yǎng)化的污水[18]。

本實驗黑藻采自江蘇省并用塑料袋運回實驗室。試驗前將黑藻幼苗用蒸餾水反復沖洗干凈，并將幼苗水培半個月，使其能夠適應無土環(huán)境，溫度為(20 ± 4)℃，自然光照。

1.2 試驗方案

1.2.1 試驗設計 采用鹽度和pH值混合交互脅迫的方式進行全面實驗。其中，采用優(yōu)級純NaCl來調整蒸餾水的鹽度到0、3、6、9、12、15；NaHCO3與Na2CO3按照0:0、1:0、10:1的比例調整水體pH依次為7、8、9(由于用堿性鹽NaHCO3與Na2CO3調節(jié)水體pH值，故本文將pH脅迫簡稱為堿脅迫)。每個鹽堿交互脅迫組設3個重復。其中，pH為7實驗組定義為單獨鹽脅迫組；pH為8、pH為9實驗組定義為鹽堿混合脅迫組；鹽度為0，pH為7的實驗組為對照組，并設無植物的空白對照。實驗水質及鹽堿梯度(見表1)參考李村河下游監(jiān)測斷面的實測水質，水體中其余營養(yǎng)元素參考Hoagland營養(yǎng)液[19]配置。

Note：①Experiment water quality；②Water quality of the licun river

1.2.2 實驗方法 選取長勢一致、分枝相同的黑藻幼苗，用蒸餾水反復沖洗干凈，用濾紙吸干表面水分，移植到實驗容器中(高20 cm，直徑10 cm的塑料量杯，內盛1 L實驗用水)，保持每個實驗組幼苗種植密度為(5±0.1) g·L-1。為避免植株的鹽激效應，采用每天遞增3鹽度、0.5 pH的方式對植株進行馴化，逐步增加實驗水體中鹽度與pH，直到達到設定值為止。實驗期間，每日用蒸餾水補充蒸發(fā)的水分。在脅迫前后，選取植株相同位置測量各生長、生理指標。

1.2.3 檢測項目和方法 植物生長及生理指標：鮮重含水率采用烘干稱重法測定[20]；相對電導率采用浸泡法測定[20]；葉綠素含量采用乙醇提取法測定[21]；丙二醛含量采用三氯乙酸提取分光光度法測定[22]；SOD活性采用氮藍四唑光化還原法[23]；POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[23]；CAT活性采用分光光度法測定[23]。脯氨酸含量采用酸性茚三酮比色法測定[20]；可溶糖含量采用蒽酮比色法測定[20]；甜菜堿含量采用雷氏鹽比色法測定[24]；無機離子K+、Na+、Cl-含量采用離子色譜法[26]。

水質指標：氨氮采用納氏試劑分光光度法測定[26]；硝氮采用紫外分光光度計法測定[26]；總氮采用紫外分光光度法測定[26]；總磷采用鉬酸銨分光光度法測定[26]。

儀器采用TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析，中國)，ICS-3000離子色譜儀(戴安，中國)。

1.2.4 計算公式 鮮重含水率的計算公式見(1)：

W=(FW-DW)/FW×100%。

(1)

式中：W表示鮮重含水率，單位為%；Fw指植物鮮重，單位為g；Dw指植物干重，單位為g。

平均相對生長速率(RGR)計算公式見(2)：

RGR=(lnW2-lnW1)/(t2-t1)。

(2)

式中：RGR表示每天每克植物的生長量，單位為mg·(g·d)-1；W1指初始時刻t1植物的干重，單位為mg；W2指終止時刻t2植物的干重，單位為mg。

對營養(yǎng)鹽的去除效率計算公式見(3)：

E=(C1-C2)×V/FW/(t2-t1)。

(3)

式中：E表示植物對營養(yǎng)鹽的去除效率，單位 mg·(g·d)-1；C1指初始時刻t1的營養(yǎng)鹽含量，單位mg·L-1；C2指終止時刻t2的營養(yǎng)鹽含量，單位mg·L-1；V指實驗水體體積，單位 L；Fw指植物鮮重，單位 g。

1.2.5 數據處理 實驗數據用Origin 9.0進行繪圖，SPSS 22.0軟件進行統計分析。顯著性水平設置為P<0.05。在圖表中±后數值表示3個平行之間的標準偏差，數據后不同字母表示在P<0.05水平上有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 鹽堿脅迫下黑藻的生長狀況

鹽堿脅迫下黑藻的RGR見表2。在單獨鹽脅迫中，鹽度為0、3、6時，黑藻的RGR無顯著變化，最高降幅為5.48%；在鹽堿混合脅迫中，鹽度分別為6、pH=8和鹽度為6、pH=9時，黑藻的RGR顯著下降(P<0.05)，降幅分別為對照組的24.96%、38.08%。混合鹽堿脅迫下RGR明顯低于單一鹽脅迫實驗組。說明較高的pH值對植物細胞造成了較大的傷害，限制了黑藻的生長。

鹽堿脅迫下黑藻的含水率見表2。黑藻含水率均隨著鹽度的升高呈下降趨勢。鹽脅迫中，鹽度為0、3、6、9時，黑藻的含水率變化不顯著；pH為8、pH為9脅迫下，鹽度分別為6、3時，黑藻含水率顯著下降(P<0.05)，降幅分別為對照組的3.18%、5.17%。鹽度較高(12～15)時，植株出現爛根現象，與對照組相比，含水率最高降幅可分別達38.71%。鹽堿共同作用下，植物細胞質pH較高，離子流進流出較快使得植物細胞失水，從而含水率下降。

2.2 鹽堿脅迫下黑藻的生理響應

鹽脅迫和堿脅迫對植物造成的傷害首先表現在細胞膜透性方面，相對電導率、丙二醛含量越高表示其受到的傷害越大，細胞膜透性越差；葉綠素作為主要的光合色素，其含量能夠較為直觀地反映植物在鹽堿脅迫下的生長情況；SOD、POD、CAT可有效清除活性氧，保護細胞結構的完整性與細胞膜的功能性；脯氨酸、可溶性糖、甜菜堿、無機離子等滲透調節(jié)物質的積累與合成是植物體抵抗?jié)B透脅迫、避免離子毒害的有效方式之一。因此可通過測定上述生理指標并結合植物生長狀況，確定黑藻的耐鹽堿能力。

2.2.1 相對電導率和葉綠素 黑藻在鹽堿脅迫下相對電導率的規(guī)律見圖1(a)。單獨鹽脅迫下，當鹽度達到12時，黑藻的相對電導開始顯著上升(P<0.05)，而鹽堿混合脅迫下黑藻的相對電導率的增速明顯高于單一鹽脅迫實驗組，當鹽度為9、pH=8和鹽度為6、pH=9時，相對電導率顯著升高(P<0.05)，分別為對照組的2.12、2.01倍，此時植物生長狀況較為良好。

鹽堿脅迫下黑藻組織內葉綠素含量的變化見圖1(b)。在單獨鹽脅迫和pH=8脅迫下，鹽度6以內對葉綠素的合成具有促進作用；pH=8 和pH=9鹽堿脅迫下，鹽度分別為9、6、6時，葉綠素含量顯著降低(P<0.05)，與對照組相比最高降幅在40%以內，此時植物的生長可維持正常狀態(tài)；隨著鹽度的繼續(xù)升高，植物出現萎黃現象。鹽堿混合脅迫光合作用抑制程度較大，不利于黑藻的生長。

2.2.2 丙二醛與酶活性 黑藻在鹽堿脅迫下的丙二醛變化規(guī)律見圖2(a)所示。單獨鹽脅迫下，鹽度為0、3、6時，黑藻組織中的丙二醛含量變化不顯著，細胞發(fā)生緩慢氧化反應，在鹽度為9時，丙二醛含量顯著升高(P<0.05)；鹽堿混合脅迫下，鹽度分別為6、pH=8和鹽度為6、pH=9時，黑藻相對電導率顯著升高(P<0.05)，分別為對照組的1.63、2.03倍，隨著鹽度的升高，丙二醛含量迅速增加，黑藻受到較為嚴重的傷害，取樣時發(fā)現植物根際腐爛，植物發(fā)黃，說明該鹽堿梯度已超出了植物所能耐受的范圍。

2.2.3 滲透調節(jié)物質

2.2.3.1 有機溶質 鹽堿脅迫對黑藻組織內脯氨酸含量的影響見圖3(a)。pH=9鹽堿混合脅迫時黑藻脯氨酸含量明顯高于鹽脅迫和pH=8鹽堿混合脅迫的實驗組含量，鹽度達到15時，黑藻幼苗脯氨酸含量最高，為對照組的5.59倍。研究表明，脯氨酸具有清除細胞活性氧、減輕細胞膜脂過氧化、調節(jié)高滲透勢的功能[30]，此時植株葉片枯黃脫落，伴隨爛根現象出現，植物細胞受到傷害較為嚴重，需要分泌大量脯氨酸來進行滲透調節(jié)。

黑藻可溶糖含量在鹽堿脅迫下的變化規(guī)律見圖3(b)。鹽脅迫、pH=8和pH=9鹽堿混合脅迫下，當鹽度分別為6、3、3時，可溶糖含量出現最高值，分別為對照組的5.21、3.69、4.26倍，此時植物生長狀況良好；當鹽度升高時，可溶糖含量開始顯著下降(P<0.05)，此時可溶糖作為糖原而被大量消耗，植物開始出現萎黃現象；隨著鹽度的繼續(xù)升高，可溶性糖不能調節(jié)植株體內的滲透壓，結合黑藻枯萎、發(fā)黃等特征可以說明植物的生長受到傷害。

鹽堿脅迫下黑藻組織內甜菜堿的含量變化規(guī)律見圖3(c)。鹽脅迫、pH=8和pH=9鹽堿混合脅迫下，鹽度分別達到9、9、6時，黑藻組織中甜菜堿含量顯著升高(P<0.05)，最高分別為對照組的1.27、1.26和1.37倍，植物可以通過提升甜菜堿醛脫氫酶的活性，增加細胞質中甜菜堿的積累，平衡細胞內滲透勢，從而提高對鹽堿脅迫的適應性。

2.2.3.2 無機離子 在鹽堿脅迫下，植物根際水勢降低，因此需要吸收一定的鹽離子來維持細胞滲透平衡。無機離子是較為廉價的滲透調節(jié)溶劑，與有機溶劑的合成相比，無機離子的積累需要較少的能量[13,31]。

鹽堿脅迫下黑藻植株中Na+含量如圖4(a)所示。鹽脅迫、 pH=8和pH=9鹽堿混合脅迫下，鹽度分別為9、6、3時，黑藻植物組織中Na+含量增幅較低，與對照組相比最高增幅均低于110%；此后，隨著鹽度的升高，Na+含量快速升高，最高可達對照組的5.56倍；鹽度的升高以及含水率降低導致的細胞脫水是造成植株Na+含量升高的主要因素。

鹽堿脅迫下黑藻植株中K+含量如圖4(b)所示。鹽脅迫、pH=8鹽堿混合脅迫時，鹽度分別為6、3時，與對照組相比黑藻K+含量降幅均在30%以內；pH=9、鹽度高于9的條件對黑藻植株吸收K+有較大的阻礙作用，說明黑藻在逆境條件下可大量吸收K+來維持細胞的穩(wěn)定。

鹽堿脅迫下黑藻植株中Cl-含量如圖4(c)所示。鹽脅迫、pH=8和pH=9鹽堿混合脅迫下，當鹽度分別達到9、9、6時，植物組織Cl-含量顯著升高(P<0.05)，與對照組相比最高增幅分別可達31.07%。鹽堿脅迫對植株進行Cl-吸收有較大的影響。

鹽堿脅迫下黑藻植株中Na+/K+如圖4(d)所示。鹽脅迫、pH=8和pH=9鹽堿混合脅迫下，當鹽度分別達到9、9、6時，植株組織中Na+/K+顯著升高(P<0.05)，分別為對照組2.35、7.82、6.85倍。隨著鹽度的升高，pH=9脅迫下的黑藻植株組織Na+/K+均明顯高于鹽脅迫。植物組織中Na+和K+存在競爭機制，為維持液泡中的離子平衡，Na+/H+轉運蛋白的主動運輸可將Na+隔離到液泡中[32-33]，此時植物通常選擇性吸收Na+、Cl-抑制K+，致使Na+/K+顯著升高(P<0.05)，進一步造成離子毒害[33-34]。

2.3 鹽堿脅迫下黑藻對氮、磷去除效果

2.3.1 對氨氮、硝氮、總氮的去除效果 黑藻對鹽堿水體中氮磷的凈化作用取決于其對鹽堿的耐受能力。鹽堿脅迫下黑藻對氨氮、硝氮、總氮的去除效率見圖5(a)、5(b)、5(c)所示。當鹽度分別為9、6、3，黑藻對3種形態(tài)氮去除效率開始顯著下降(P<0.05)；之后隨著鹽度的繼續(xù)升高，黑藻對3種形態(tài)氮的去除效率迅速降低，此時植株腐爛，向水體中釋放大量的氮素，使得此時水體中氮含量可能高于初始值[35]，黑藻除了消耗部分能量用來抵抗鹽堿脅迫之外，已經沒有足夠的能量去除水體中的氮，導致黑藻對氮的去除效率急劇下降。

3 結論

(1)在pH=7、pH=8和pH=9時，黑藻能耐受的最高鹽度分別9、6、3。高鹽堿脅迫下，RGR和含水率顯著降低(P<0.05)，鹽堿交互脅迫加大了對黑藻的傷害，出現萎黃、爛根現象，植物生長受到抑制。

(2)在鹽堿耐受范圍內，脯氨酸等有機溶質的合成與無機離子的積累可維持細胞滲透平衡，酶促反應良好；鹽堿耐受范圍外，相對電導率和丙二醛含量增加，細胞膜透性增大，質膜受到傷害，Na+、Cl-流入、K+流出，SOD、POD、CAT活性均顯著降低(P<0.05)，植物生長受到較大的阻礙。

(3)黑藻在其鹽堿耐受范圍內對含鹽堿水體中的總氮、總磷具有較好的去除效果，最高可分別達0.083 和0.028 mg·(g·d)-1；當鹽度與pH升高，植物維持自身正常生理活動所需要的能量較大，黑藻對氮、磷的去除效果較差?？傮w上，黑藻是一種凈化高鹽堿水體的優(yōu)選植物。

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責任編輯 龐 旻

The Salt-Alkali Tolerance and Nutrient (N, P) Removal Performance ofHydrillaverticillatain Coastal Estuary Area

LI Yang-Yang1, CHEN You-Yuan1,2, SUN Ping1, CHEN Guang-Lin1

(1. College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China； 2. Key Laboratory of Marine Environment and Ecology, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266100, China).

The high salt-alkali content in coastal estuary resulted in the landscape depression. Screening plants which not only tolerate salt-alkali stress but also effectively remove nitrogen and phosphorus was in need. In this study, seedlings ofHydrillaverticillatawere treated under salt-alkali stress by hydroponic culture. The growth, physiological response and removal efficiency of nitrogen and phosphorus byHydrillaverticillatawere measured. The results showed the limits ofHydrillaverticillata’ salt tolerance were less than 9, 6 and 3, while the corresponding pH values of the water were 7, 8 and 9, respectively. Within the limits, the differences of water content of plants between salt-alkali treated groups and controlled group (without salt or pH stress) were less than 5%. Chlorophyll content was increased slightly at low salinities (<6). Beyond the limits, membrane permeability increased with increasing salinity and pH value. Enzyme activity was reduced sharply. Meanwhile, proline ofHydrillaverticillataand the concentrations of Na+were as 4.67, 9.13 times high as control group in response to salt-alkali stresses. As a result, the growth ofHydrillaverticillatawas inhibited and the removal efficiency for nitrogen and phosphorus reduced significantly.

Hydrillaverticillataseedlings; interactive salt-alkali stress; physiological response; nitrogen and phosphorus purification; coastal estuary region

青島市科技攻關項目(12-4-1-58-HY);青島市政府采購項目(T-20150205-018)資助 Supported by Qingdao Science and Technology Research Projects(12-4-1-58-HY); Qingdao Government Procurement Projects (T-20150205-018)

2016-04-21；

2016-05-24

李楊楊(1991-)，女，碩士生，現從事水資源保護與水污染控制研究。E-mail：776078523@qq.com

?? 通訊作者：E-mail：youyuan@ouc.edu.cn

X522

A

1672-5174(2017)06-034-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20160140

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