兩株芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)和血清非特異性免疫指標(biāo)的影響研究*

王 苓， 田相利， 董雙林， 汪 多

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

兩株芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)和血清非特異性免疫指標(biāo)的影響研究*

王 苓， 田相利**， 董雙林， 汪 多

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

為研究芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)生長(zhǎng)指標(biāo)和血清非特異性免疫指標(biāo)的影響。以初始體重 (4.00±0.03) g的凡納濱對(duì)蝦為對(duì)象，在對(duì)蝦飼料中分別添加濃度為1×107、1×109和1×1011cfu/kg的蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，以對(duì)蝦商品飼料為對(duì)照組，養(yǎng)殖42 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)定凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)情況和血清非特異性免疫指標(biāo)。研究表明：各組對(duì)蝦的成活率均在90%以上，且組間差異不顯著(P>0.05)；除了枯草芽孢桿菌1×107cfu/kg添加組，其余添加組中凡納濱對(duì)蝦的體重、特定生長(zhǎng)率、飼料效率和消化率(P<0.05)顯著提高，在添加濃度為1×109cfu/kg時(shí)各指標(biāo)取得最大值。飼料中添加益生菌可提高凡納濱對(duì)蝦的超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、溶菌酶、總一氧化氮合酶、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶活性和血清蛋白濃度等血清非特異性免疫指標(biāo)，且均在添加濃度為1×109cfu/kg時(shí)各指標(biāo)取得最大值。研究結(jié)果表明，飼料中添加適當(dāng)濃度的益生菌可有效促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)，提高其血清非特異性免疫水平。當(dāng)益生菌的添加濃度為1×109cfu/kg時(shí)，效果最顯著。

凡納濱對(duì)蝦；芽孢桿菌；生長(zhǎng)；免疫

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)俗稱南美白對(duì)蝦，原產(chǎn)于太平洋沿岸水域，以南美洲居多[1]。它于1988年由張偉權(quán)教授引進(jìn)中國，因其具有抗逆性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、耐高密度等特點(diǎn)，迅速成為我國對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)中養(yǎng)殖范圍最廣的品種。但隨著對(duì)蝦集約化養(yǎng)殖模式的迅猛發(fā)展，殘餌糞便等有機(jī)污染物的積存致使大量有害菌群滋生繁殖，養(yǎng)殖水體的生態(tài)環(huán)境持續(xù)惡化，嚴(yán)重降低了對(duì)蝦的抗病力，使得對(duì)蝦疾病頻發(fā)，大量抗生素及違禁藥品被用于病害防治，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)及對(duì)蝦體內(nèi)藥物殘留等問題，嚴(yán)重制約著對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[2-5]。因此，在對(duì)蝦養(yǎng)殖中，尋找綠色環(huán)保的抗生素等藥物的替代品，解決養(yǎng)殖病害和食品安全等問題，成為目前大量研究工作的焦點(diǎn)[6-7]。

益生菌是可以對(duì)宿主產(chǎn)生有益作用的活性微生物的統(tǒng)稱，因其具有調(diào)節(jié)生物菌群平衡，抑制有害菌株的繁殖，減少毒性物質(zhì)的釋放[4,8]；改善水質(zhì)，降低氨氮[8-9]；提高養(yǎng)殖對(duì)象的適應(yīng)能力，增強(qiáng)免疫力[10-11]；提高生物體內(nèi)的消化酶活性，促進(jìn)其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[12-13]等作用，越來越多的益生菌被應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)中，并取得了良好的效果。本研究比較了潛在益生菌蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能及血清非特異性免疫指標(biāo)的影響，以期為這2株益生菌在凡納濱對(duì)蝦中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 益生菌

蠟樣芽孢桿菌(B.cereus，編號(hào)：CD)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis，編號(hào)：BL)均來源于中國海洋大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)實(shí)驗(yàn)室篩選、保存的菌種。

1.2 實(shí)驗(yàn)飼料

1.2.1 益生菌活化、培養(yǎng) CD株和BL株活化后分別接種于2216E液體培養(yǎng)基中，140 r/min、28 ℃培養(yǎng)24 h至對(duì)數(shù)期，經(jīng)檢測(cè)活菌含量為1×109cfu/mL。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中以5 000 r/min離心10 min，棄上清液，收集菌體，用無菌生理鹽水重懸備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)飼料制作

對(duì)照組飼料 由凡納濱對(duì)蝦商品飼料(購于南通正大有限公司，南美白對(duì)蝦2號(hào)飼料)表面直接包裹一層褐藻酸鈉(3.15 g/500g)和魚油(4.2 mL/500g)制成[14](記為Control)。

實(shí)驗(yàn)組飼料 按一定比例將菌液均勻噴灑在凡納濱對(duì)蝦商品化飼料的表面，揉搓陰干，再在其表面直接包裹一層褐藻酸鈉和魚油(比例同對(duì)照組飼料)，制成蠟樣芽孢桿菌的活菌添加量為1×107、1×109和1×1011cfu/kg(分別記為CD7、CD9和CD11)和枯草芽孢桿菌的活菌添加量為1×107、1×109和1×1011cfu/kg(分別記為BL7、BL9和BL11)的6種實(shí)驗(yàn)飼料。待飼料陰干后，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦及飼養(yǎng)管理

凡納濱對(duì)蝦購于青島市寶榮水產(chǎn)科技發(fā)展有限公司對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)，養(yǎng)殖用水鹽度為21，運(yùn)回后于實(shí)驗(yàn)室玻璃鋼水箱中暫養(yǎng)10 d。暫養(yǎng)期間，投喂凡納濱對(duì)蝦商品化飼料，養(yǎng)殖用水鹽度由21每2天升高2度，逐漸馴化至鹽度30后，穩(wěn)定2天用于養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。

暫養(yǎng)結(jié)束后饑餓1天，選取健康無病、規(guī)格相近、體重在4 g左右的凡納濱對(duì)蝦，隨機(jī)分為7組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10尾蝦，在50 L的玻璃水族箱中進(jìn)行42天的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間，每日分別于8：00和17：00兩次投喂，日投喂量為蝦體質(zhì)量的4%～5%之間，每次投喂前吸出殘餌和糞便，60 ℃下烘干保存；每天換水1次，日換水量為1/3～2/3，水溫在23 ℃左右，鹽度30，pH=8.0±0.1，連續(xù)微量充氣，保持溶氧在5 mg/L以上，每日檢查并記錄對(duì)蝦的攝食和死亡情況。

1.4 樣品采集與處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，饑餓24 h，稱量并記錄蝦的末體重。用1 mL無菌注射器從凡納濱對(duì)蝦腹部血竇中抽取血淋巴置于1.5 mL離心管中，然后置于4 ℃冰箱中靜置一夜，之后3 000 r/min離心10 min，取上層血清置于-80 ℃冰箱中保存。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 生長(zhǎng)指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)，分別對(duì)各處理組對(duì)蝦進(jìn)行計(jì)數(shù)和稱重，并記錄實(shí)驗(yàn)過程中各處理組的投餌量、殘餌量及排泄量，計(jì)算各生長(zhǎng)指標(biāo)。

成活率 =(實(shí)驗(yàn)后對(duì)蝦數(shù)量/實(shí)驗(yàn)前放養(yǎng)數(shù)量)×100%；

特定生長(zhǎng)率(SGR)= [(lnW末- lnW初)/t]×100%；

飼料效率(FER)=(W末-W初)/W餌×100%；

消化率(ADR)=(Cw-Fw)/Cw×100%。

式中：W初、W末分別為初體重(g)和末體重(g)；t為養(yǎng)殖時(shí)間(d)；W餌為實(shí)驗(yàn)期間投入的飼料量；Cw為以重量表示的對(duì)蝦的攝食量；Fw為糞便質(zhì)量。

1.5.2 血清非特異性免疫指標(biāo) 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutse, SOD)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase, ACP)、總一氧化氮合酶(Total Nitric Oxide Synthase, TNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase, iNOS)、溶菌酶(Lysozyme, LSZ)及血清蛋白濃度的測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定，并參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 21軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan's多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)指標(biāo)

2.1.1 生長(zhǎng)與成活率 由表1可知，飼料中添加的2種芽孢桿菌均可促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)。除BL7組外,其它各實(shí)驗(yàn)組的末體重均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；2種芽孢桿菌處理組的末體重均在中濃度(CD9和BL9)取得最大值，且CD9顯著高于BL9(P<0.05)；各處理組對(duì)蝦成活率均在90.0%～97.5%之間，且與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

2.1.2 特定生長(zhǎng)率 由圖1可知，飼料中添加2種芽孢桿菌均可以提高凡納濱對(duì)蝦的特定生長(zhǎng)率。除BL7組外，其它各實(shí)驗(yàn)組的特定生長(zhǎng)率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；BL7與BL11差異不顯著(P>0.05)，CD7、CD11、BL9、BL11差異不顯著(P>0.05)；CD9的特定生長(zhǎng)率最高且顯著高于BL9(P<0.05)。

2.1.3 飼料效率 由表1可知，飼料中添加的2種芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦飼料效率的影響與對(duì)其特定生長(zhǎng)率的影響變化規(guī)律基本一致。除BL7組與對(duì)照組之間差異不顯著以外(P>0.05)，其余各實(shí)驗(yàn)組飼料效率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且2種芽孢桿菌的中濃度實(shí)驗(yàn)組(CD9和BL9)均顯著高于低濃度(CD7和BL7)和高濃度實(shí)驗(yàn)組(CD11和BL11)(P<0.05)，而低濃度和高濃度實(shí)驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05)； CD9的飼料效率顯著高于BL9(P<0.05)。

2.1.4 消化率 由表1可知，飼料中添加的2種芽孢桿菌均可以提高凡納濱對(duì)蝦的消化率。其中， CD7、CD9、CD11組的消化率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，CD9顯著性高于CD7和CD11(P<0.05)，CD7組略高于CD11組，但差異不顯著(P>0.05)； BL7、BL9、BL11的消化率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，BL9與BL11組差異不顯著(P>0.05)而與BL7組差異顯著(P<0.05)；CD9組的消化率顯著高于BL9組。

注：同一列數(shù)據(jù)標(biāo)有不同字母的表示相互之間差異顯著(P<0.05)。

Note: Data with different letters at the same column mean significant difference with each other(P<0.05).

(圖中柱上不同字母的表示相互之間差異顯著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference with each other(P<0.05).)

圖1 飼料中添加芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦特定生長(zhǎng)率(SGR)的影響

Fig.1 Effects ofBacilluson the specific growth rate(SGR) ofL.vannamei

2.2 血清非特異性免疫指標(biāo)

2.2.1 超氧化物歧化酶 由圖2可知，飼料中添加2種不同濃度的芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清超氧化物歧化酶(SOD)活性影響不同。其中，CD7、CD9、CD11組的活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，CD9組達(dá)到最大值，且顯著高于CD7和CD11(P<0.05)，CD7組活性高于CD11，但差異不顯著(P>0.05)； BL7、BL9、BL11的SOD活性也均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，BL9組顯著高于BL7和BL11，BL7組活性略低于BL11組，差異不顯著(P>0.05)。

(圖中柱上不同字母的表示相互之間差異顯著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference with each other(P<0.05).)

圖2 飼料中添加芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦超氧化物歧化酶(SOD)的影響

Fig.2 Effects of Bacillus on superoxide dismutse(SOD) in serum ofL.vannamei

2.2.2 堿性磷酸酶 由圖3可知，飼料中添加2種不同濃度的芽孢桿菌均可以提高凡納濱對(duì)蝦的血清堿性磷酸酶(AKP)活性。其中， CD7、CD9、CD11組的AKP活性均顯著性高于對(duì)照組(P<0.05)，且CD9組又顯著高于CD7和CD11組(P<0.05)，CD7組AKP活性高于CD11組，但差異不顯著(P>0.05)；投喂枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)組除了BL7組外，均顯著性高于對(duì)照組(P<0.05)，BL9組顯著高于BL11(P<0.05)，BL11組又顯著高于BL7(P<0.05)，BL7略高于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)。

(圖中柱上不同字母的表示相互之間差異顯著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference with each other(P<0.05).)

圖3 飼料中添加芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦堿性磷酸酶(AKP)的影響

Fig.3 Effects of Bacillus on alkaline phosphatase(AKP) in serum ofL.vannamei

2.2.3 酸性磷酸酶 由圖4可知，飼料中添加2種不同濃度的芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦的血清酸性磷酸酶(ACP)活性影響不同。CD7和CD9組的ACP活性均顯著高于CD11和對(duì)照組(P<0.05)，CD9組又顯著高于CD7組(P<0.05)，CD11和對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)； BL9組的活性顯著性高于BL7、BL11和對(duì)照組(P<0.05)，其中，BL7組高于對(duì)照組，低于BL11組，但三者之間差異不顯著(P>0.05)。

(圖中柱上不同字母的表示相互之間差異顯著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference with each other(P<0.05).)

圖4 飼料中添加芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦酸性磷酸酶(ACP)的影響

Fig.4 Effects of Bacillus on acid phosphatase(ACP) in serum ofL.vannamei

2.2.4 總一氧化氮合酶 由圖5可知，飼料中添加2種不同濃度的芽孢桿菌均可以提高凡納濱對(duì)蝦的血清總一氧化氮合酶(TNOS)活性。投喂蠟樣芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)組中，CD9組活性最高，且顯著性高于對(duì)照組(P<0.05)，CD7組活性低于CD9組，高于CD11組，但三者之間差異不顯著(P>0.05)，CD7和CD11組活性都高于對(duì)照組，但同樣未達(dá)到顯著性差異水平(P>0.05)；投喂枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)組中，BL9組的活性顯著高于其它各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(P<0.05)，BL11組活性高于BL7組，差異不顯著(P>0.05)，BL7組高于對(duì)照組，同樣未達(dá)到顯著性差異水平(P>0.05)。

(圖中柱上不同字母的表示相互之間差異顯著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference with each other(P<0.05).)

圖5 飼料中添加芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦

總一氧化氮合酶(TNOS)的影響

Fig.5 Effects of Bacillus on total nitric oxide synthase(TNOS)

in serum ofL.vannamei

2.2.5 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 由圖6可知，飼料中添加2種不同濃度的芽孢桿菌均可以提高凡納濱對(duì)蝦的血清誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活性。投喂蠟樣芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)組中，CD9組活性最高，并顯著性高于CD11和對(duì)照組(P<0.05)，與CD7組差異不顯著(P>0.05)，CD7組活性高于CD11，但未達(dá)到顯著性差異水平(P>0.05)，CD11活性與對(duì)照組相比較高，但差異不顯著(P>0.05)；投喂枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)組中，BL9組活性顯著高于其它實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(P<0.05)，BL11組活性又顯著性高于BL7和對(duì)照組(P<0.05)，BL7組活性雖高于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)。

(圖中柱上不同字母的表示相互之間差異顯著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference with each other(P<0.05).)

圖6 飼料中添加芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦

誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的影響

Fig.6 Effects of Bacillus on inducible nitric oxide

synthase(iNOS) in serum ofL.vannamei

2.2.6 溶菌酶 由圖7可知，飼料中添加2種不同濃度的芽孢桿菌均可以提高凡納濱對(duì)蝦的血清溶菌酶(LSZ)活性。投喂蠟樣芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)組中，CD9組活性顯著高于CD7、CD11和對(duì)照組(P<0.05)，CD7組活性高于CD11組，差異不顯著(P>0.05)，CD11組活性高于對(duì)照組，但也無顯著性差異(P>0.05)；投喂枯草芽孢桿菌的各實(shí)驗(yàn)組活性均顯著性高于對(duì)照組(P<0.05)，其中，BL9組又顯著性高于BL7和BL11組(P<0.05)，BL11組活性雖高于BL7組，但差異不顯著(P>0.05)。

(圖中柱上不同字母的表示相互之間差異顯著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference with each other(P<0.05).)

圖7 飼料中添加芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦溶菌酶(LSZ)的影響

Fig.7 Effects of Bacillus on lysozyme(LSZ ) in

serum ofL.vannamei

2.2.7 血清蛋白濃度 由圖8可知，飼料中添加2種不同濃度的芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦的血清蛋白濃度也有不同影響。CD7、CD9、CD11組的濃度均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中，CD9組顯著性高于CD7組(P<0.05)，CD7組又顯著性高于CD11組的濃度(P<0.05)；投喂枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)組中，BL9和BL11組的濃度均顯著性高于BL7和對(duì)照組，BL9組濃度最高，且又顯著性高于BL11組(P<0.05)，BL7組與對(duì)照組相比無顯著性差異(P>0.05)。

(圖中柱上不同字母的表示相互之間差異顯著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference with each other(P<0.05).)

圖8 飼料中添加芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清蛋白的影響

Fig.8 Effects of Bacillus on the protein in serum ofL.vannamei

3 討論

3.1 飼料中添加芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)的影響

迄今，關(guān)于益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用已有較多研究，主要種類包括弧菌屬、芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、假單胞桿菌屬[15-16]。本研究中，選用2種芽孢桿菌屬細(xì)菌做為添加菌。從結(jié)果中可以看出2種芽孢桿菌均能顯著提高對(duì)蝦的末體重和特定生長(zhǎng)率，這與石廣舉[17]、丁賢[13]等的研究結(jié)果相類似。益生菌可以調(diào)節(jié)養(yǎng)殖動(dòng)物腸道的菌群平衡，促進(jìn)有益菌株優(yōu)勢(shì)種的形成，提高機(jī)體的消化酶活性，從而提高了飼料效率和消化率[18]，本結(jié)果也證實(shí)了這一觀點(diǎn)，2種芽孢桿菌均可以提高飼料效率和消化率，且最佳實(shí)驗(yàn)濃度組均與對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，由于養(yǎng)殖對(duì)象、養(yǎng)殖環(huán)境和益生菌添加的種類不同，益生菌的適宜添加濃度也不相同，一般添加濃度在1×106～1×109cfu/kg之間[19]；本研究得到的2種芽孢桿菌的最佳添加濃度均為1×109cfu/kg，這與劉泓宇等人關(guān)于枯草芽孢桿菌在凡納濱對(duì)蝦飼料中適宜的濃度為5×1010cfu/kg[18]的研究結(jié)果略有不同，這可能是因?yàn)轲B(yǎng)殖水體溫度、鹽度、酸堿度以及養(yǎng)殖密度等不同造成的。所以即使同一種菌添加到同一種養(yǎng)殖對(duì)象的飼料中，也會(huì)因?yàn)楦鞣N因素的影響，造成適宜添加益生菌的濃度有所差別。因此，在益生菌的實(shí)際應(yīng)用過程中，為了保證應(yīng)用效果，應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)整益生菌的用量。

3.2 飼料中添加芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫的影響

已有研究表明，超氧化物歧化酶、磷酸酶、溶菌酶、血清蛋白濃度和一氧化氮合酶等均在對(duì)蝦免疫防御中起著重要作用，并可以反映對(duì)蝦的免疫能力[20]。SOD可以清除蝦體內(nèi)多余的自由基，使機(jī)體維持正常的平衡[21-22]；溶菌酶在最前沿防御機(jī)制中有重要作用，并且主要針對(duì)革蘭氏陽性菌發(fā)揮作用[23]；對(duì)蝦機(jī)體啟動(dòng)免疫反應(yīng)后，體內(nèi)的一氧化氮合酶會(huì)被激活，并會(huì)受體內(nèi)免疫物質(zhì)的誘導(dǎo)激發(fā)釋放出大量的NO，而NO會(huì)參與一系列的免疫反應(yīng)，對(duì)病原生物產(chǎn)生殺滅作用[24]。李桂英等人的研究表明添加益生菌可以顯著提高凡納濱對(duì)蝦的溶菌酶和一氧化氮合酶的活性[12]，本研究中添加的兩種芽孢桿菌也均可以顯著提高對(duì)蝦的溶菌酶和一氧化氮合酶的活性，且均與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。飼料中添加的不同濃度的2種芽孢桿菌均可以不同程度的提高對(duì)蝦的超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、溶菌酶、一氧化氮合酶活性及血清蛋白濃度等血清非特異性免疫指標(biāo)；從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，當(dāng)2種芽孢桿菌添加濃度為1×109cfu/kg時(shí)，各免疫指標(biāo)均取得最大值，顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組，且與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。

關(guān)于益生菌的作用，目前已有較多研究[12-14]。當(dāng)益生菌添加到養(yǎng)殖水體中后，可通過營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、位點(diǎn)爭(zhēng)奪、分泌抑菌物質(zhì)等抑制有害細(xì)菌的繁殖[4,8]，保持養(yǎng)殖水體微生態(tài)的穩(wěn)定，維持有益菌群的優(yōu)勢(shì)地位，刺激養(yǎng)殖動(dòng)物免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)其抗病力[10,25]，同時(shí)，也進(jìn)一步保證了養(yǎng)殖動(dòng)物處于較佳的生理狀態(tài)，有助于提高其攝食、消化以及對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，從而達(dá)到促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)的效果。本研究中，凡納濱對(duì)蝦在2種芽孢桿菌的不同添加濃度下的生長(zhǎng)指標(biāo)和免疫指標(biāo)變化規(guī)律基本上是一致的，印證了上述推想。本研究中的枯草芽孢桿菌的最佳添加濃度為1×109cfu/kg時(shí)，各項(xiàng)非特異性免疫指標(biāo)均達(dá)到最大值，而這一結(jié)果與陸家昌等人的研究結(jié)果不同，其研究結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌的最佳添加濃度為1.25×104cfu/kg[26]，這可能是因?yàn)槌龑?duì)蝦養(yǎng)殖條件、水體溫度以及鹽度等因素不同以外，還可能是由枯草芽孢桿菌的菌種以及其活性的不同所造成。因此，即使同屬于一個(gè)菌屬的細(xì)菌對(duì)同一個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象的非特異性免疫指標(biāo)的影響也存在差異，應(yīng)該根據(jù)具體的養(yǎng)殖情況和菌種活性進(jìn)行適當(dāng)?shù)挠昧空{(diào)整，這樣才能更好的提高對(duì)蝦的非特異性免疫能力。

4 結(jié)語

本研究結(jié)果表明，芽孢桿菌作為一類益生菌制劑，以適宜的添加量添加到對(duì)蝦飼料中，可有效促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)，提高其血清非特異性免疫能力。實(shí)驗(yàn)中，2種芽孢桿菌飼料添加濃度為1×109cfu/kg時(shí)，對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)和免疫的促進(jìn)效果最顯著，可以作為其在凡納濱對(duì)蝦飼料添加中的參考劑量。

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責(zé)任編輯 朱寶象

Effects of TwoBacilluson Growth Performance and Serum Non-specific Immunity ofLitopenaeusvannamei

WANG Ling, TIAN Xiang-Li, DONG Shuang-Lin, WANG Duo

(The Key Laboratory Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

The experiment was conducted to investigate the effects ofBacilluscereusandB.subtilison the growth performance and serum non-specific immunity ofLitopenaeusvannamei. Three concentrations, 1×107cfu/kg, 1×109cfu/kg and 1×1011cfu/kg, were formulated into six experimental diets CD7, CD9, CD11 and BL7, BL9, BL11. The control was basic diet without probiotic. ShrimpL. vannamei with an average initial weight of (4.00±0.03)g were divided into seven groups，five replications each group, and ten shrimps each replication, and cultured for 42 days. During the experiment, the initial body weight, the quantity and surplus we fed the shrimps, the quantity of their excretion, the number of deaths and the final body weight and calculate survival rate, the specific growth rate, feed efficiency, apparent digestibility were recorded. When the experiment was finished, we weighed the shrimps and collected the hemolymph from the pericardial cavity. Then we determined superoxide dismutse, alkaline phosphatase, acid phosphatase, total nitric oxide synthase, inducible nitric oxide synthase, lysozyme and the protein in serum ofL.Vannameiin different groups with enzyme reagent kits. The enzyme reagent kits were provided by Nanjing Jiancheng Biology Engineering Institute. The experimental data was processed with one-way ANOVA and Duncan multiple range test with SPSS Statistics 21. We analyzed and compared the results of growth performance and serum non-specific immunity of different groups. The results showed that the survival rate of each groups was above 90% with no significant difference (P>0.05) except BL7. Feed supplemented with Bacillus could significantly (P<0.05) increase the final weight, specific growth rate, feed efficiency ratio and apparent digestibility when the concentration of Bacillus was 1×109cfu/kg, at which the growth index got the maximum value and was significantly higher than that at 1×107cfu/kg and 1×1011cfu/kg. Feed supplemented with Bacillus could increase the activities of superoxide dismutse, alkaline phosphatase, acid phosphatase, total nitric oxide synthase, inducible nitric oxide synthase, lysozyme and the concentration of serum protein in varying degrees. Compared with the control group and other addictive concentration of Bacillus, the concentration of 1×109cfu/kg got the maximum value and the differences were significant (P<0.05). The experiment compared also the effects of twoBacilluson growth performance and serum non-specific immunity ofL.Vannamei. It was concluded that feed supplemented with proper concentrations of Bacillus can effectively promote the growth and improve the serum non-specific immunity ofL. vannamei and the concentration of 1×109cfu/kg can produce the most obvious effect.

Litopenaeusvannamei;Bacillus; growth; immunity

國家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD13B03); 山東省杰出青年基金項(xiàng)目( JQ201009)；廣東省海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范專項(xiàng)(GDHY2013-B03-005)； 青島市民生科技計(jì)劃項(xiàng)目(15-9-2-96-NSH)資助

2016-01-27；

2016-04-28

王苓(1990-),女, 碩士生, 主要從事水產(chǎn)微生物學(xué)研究。E-mail:wl1220862521@126.com

** 通訊作者：E-mail: xianglitian@ouc.edu.cn

S917

A

1672-5174(2017)04-014-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20160022

王苓， 田相利， 董雙林， 等. 兩株芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)和血清非特異性免疫指標(biāo)的影響研究[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2017, 47(4): 14-21.

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Supported by National Great Project of Scientific and Technical Supporting Programs (2011BAD13B03), the Program for Excellent Youth Foundation of Shandong Province (JQ201009), the Specialized Project of Regional Demonstration for the Innovation and Development of Marine Economy of Guangdong Province (GDHY 2013-B03-005), and the Scientific and Technical Programs for People's Livelihood of Qingdao (15-9-2-96-NSH).