• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    谷胱甘肽的高效液相色譜及色譜聯(lián)用檢測方法進展*

    2017-01-12 11:00:53徐瑩瑩王燕一
    關(guān)鍵詞:還原型巰基谷胱甘肽

    徐瑩瑩 王燕一

    谷胱甘肽的高效液相色譜及色譜聯(lián)用檢測方法進展*

    徐瑩瑩 王燕一

    谷胱甘肽(glutathione,GSH)是一種含有巰基的三肽化合物。機體內(nèi)谷胱甘肽主要以還原型的狀態(tài)存在,氧化應(yīng)激后形成氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG),后者在谷胱甘肽還原酶的作用下再形成還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)。還原型谷胱甘肽具有保護細(xì)胞免遭氧化損傷的重要作用。幾乎所有哺乳動物體內(nèi)都有谷胱甘肽。研究機體內(nèi)還原型谷胱甘肽以及氧化型谷胱甘肽的含量,可以評價機體的氧化應(yīng)激情況和疾病發(fā)生的風(fēng)險。雖然很多學(xué)者都對體內(nèi)的氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽進行了檢測,但是檢測結(jié)果差異較大。這是由于GSH發(fā)生自氧化從而造成GSH的低估,及GSSG的高估和(或)GSH/GSSG的低估。本文主要對GSH的色譜以及色譜聯(lián)用例如:液質(zhì)聯(lián)用(liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS)等方法進行綜述。

    谷胱甘肽;色譜法, 高效液相

    谷胱甘肽于1921年由學(xué)者Hopkins FG命名為“Glutathione”[1]。從結(jié)構(gòu)上看,谷胱甘肽是一個由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的三肽化合物。在谷氨酸的側(cè)鏈的羧基組和半胱氨酸的氨基組之間以肽鍵相連[2]。谷胱甘肽有兩個特征結(jié)構(gòu):谷酰基鏈和巰基(-SH)組。這些結(jié)構(gòu)促進其參與多種生理功能。機體內(nèi)谷胱甘肽以兩種形式存在,即GSH和GSSG。GSH-GSSH是真核細(xì)胞中重要的氧化還原緩沖配對。在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起基礎(chǔ)性作用。對GSH-GSSH定性或定量分析都是反應(yīng)機體氧化損傷的重要指標(biāo)。

    1.谷胱甘肽概述

    1.1谷胱甘肽的臨床意義 GSH是一種重要的抗氧化劑,抗氧化體統(tǒng)功能減弱時,活性氧和活性氮對組織造成不同程度損傷,導(dǎo)致一些慢性疾病發(fā)生,Dalle-Donne等對此作了系統(tǒng)的綜述[3]。谷胱甘肽能夠保護紅細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)的巰基處于還原狀態(tài),防止溶血,還可以持續(xù)其正常發(fā)揮運輸氧的能力;能夠與進入機體的有毒化合物(如:丙烯腈、 氟化物、一氧化碳)、重金屬離子等直接結(jié)合,將其轉(zhuǎn)化為無害的物質(zhì)并排泄出體外,起到中和解毒的作用。GSH與睡眠相關(guān)[4]。GSH對神經(jīng)元興奮性中毒也有緩解作用;可以用于緩解惡性腫瘤患者化療所致的毒副反應(yīng);治療白內(nèi)障及控制角膜和視網(wǎng)膜等眼部疾病;治療糖尿病神經(jīng)病變、糖尿病脂肪肝等并發(fā)癥;抑制乙醇侵害肝臟產(chǎn)生脂肪,減輕病毒性肝炎、肝炎肝硬化以及藥物性肝損傷癥狀;谷胱甘肽還具有抗艾滋病病毒的功效。唾液、尿液、全血、血漿、腦體液等體液中谷胱甘肽的含量都具有重要的臨床意義[5]。

    1.2谷胱甘肽的代謝反應(yīng) GSH可在谷胱甘肽過氧化酶的作用下轉(zhuǎn)化為GSSG,同時在谷胱甘肽還原酶與還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)的共同作用下再生成GSH[6][7]。生理上GSH和NADPH的作用下使得GSSG:GSH的比值為持在1:1000到1:100的范圍內(nèi)[8]。機體氧化應(yīng)激水平增加或者谷胱甘肽還原酶的活性受限(例如6-磷酸葡萄糖脫氫酶的缺乏導(dǎo)致NADPH合成受限)時,導(dǎo)致GSSG、GSSG/GSH增加。大量的GSSG參與細(xì)胞內(nèi)、外的代謝而消耗。細(xì)胞內(nèi)的GSSG轉(zhuǎn)化為GSH[9]。GSH由細(xì)胞內(nèi)移向細(xì)胞外與肝臟和其他組織一起參與各器官之間的代謝反應(yīng)[10]。

    GSH與內(nèi)源性集團發(fā)生反應(yīng),生成具有生物活性的內(nèi)源性谷胱甘肽加合物[9,11]。雖然有些加合物可直接生成,但谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶GST介導(dǎo)的反應(yīng)通常占主導(dǎo)地位。GSH的活性部位是半胱氨酸的巰基。高親和性的巰基使GSH在生理條件發(fā)揮清除自由基的作用[12]。GSH與谷胱甘肽過氧化酶共同作用分解過氧化氫和有機過氧化物[2]。GSH有助于機體其他抗氧化劑的生成,例如維生素E、維生素C等。

    GSH通過名為谷胱甘肽化(S-Glutathionylation)的途徑與蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基結(jié)合。谷胱甘肽化可以被逆轉(zhuǎn),這一反應(yīng)在細(xì)胞信號調(diào)節(jié)機制中也有重要作用[8,13]。谷胱甘肽化在氧化應(yīng)激下有保護不穩(wěn)定巰醇的作用;通過此過程儲存GSH,以防止在氧化應(yīng)激時GSH的減少。已有文獻報道谷胱甘肽化反應(yīng)異??赡芘c糖尿病、心血管疾病、肺部疾病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生相關(guān)[14]。

    2.GSH和GSSG的測定分析

    從20世紀(jì)50年代起,研究者就開始建立谷胱甘肽的各種測定方法,至今仍然有很多改進方法和新穎技術(shù)方案不斷涌現(xiàn)。隨著分析技術(shù)的不斷進步,在檢測技術(shù)的精確度、準(zhǔn)確度、靈敏度和速度等方面都有明顯提高??v觀谷胱甘肽的測定方法,形式多樣,原理也不盡相同??梢姺止夤舛确ā⒚阜?、熒光分光光度法、高效液相色譜法等是最主要和常用的方法,其它如差熱掃描(DSC)、紅外檢測等方法雖然不常用,但是在研究工作中也有一定價值。從上世紀(jì)70年代 起,高效液相色譜法法和以上幾種方法結(jié)合進行測定就開始被報道,此后出現(xiàn)了HPLC-UV、HPLC-ECD(high performance liquid chromatography-electrochemical detection)、HPLC- OPA、HPLC- GR、HPLC- MS、LC-MS/MS等一系列方法。這些測定方法主要原理是以HPLC為分離手段,以質(zhì)譜或其它檢測方法為鑒定和測定手段聯(lián)合使用檢測化合物。本文主要對高效液相色譜法(high performance liquid chromatography;HPLC)、LC-MS等相關(guān)方法進行綜述。高效液相色譜法具有分離效率高、選擇性好、分析速度快、檢測靈敏度高、操作自動化和應(yīng)用范圍廣的特點。對于谷胱甘肽而言還具有可同時檢測出GSH和GSSG的優(yōu)點。

    樣品中GSH的準(zhǔn)確測量較為困難,這是由于固體狀態(tài)下的GSH較為穩(wěn)定,液體樣品中的GSH易被氧化為GSSG。GSH與GSSH間存在著氧化還原間的動態(tài)平衡。準(zhǔn)確測量樣品中的GSH和GSSG,避免因GSH被氧化造成的GSSG高估,及GSSG被還原造成的GSSG低估,至關(guān)重要。此外GSH的其它存在形式如GSSX、PROSSG等也會影響到檢測的準(zhǔn)確性。通過研究機體內(nèi)GSH以及GSSG的含量以及他們的關(guān)系對于評價GSH-GSSG氧化還原系統(tǒng)的功能意義重大。因而準(zhǔn)確測量樣品中GSH、GSSG成為目前的研究熱點之一。

    2.1色譜柱以及流動相的選擇 未被衍生化的GSH和GSSG是高極性化合物,研究表明GSH可選用極性高的色譜柱進行分離[17]。Dustin Carroll 選用了Luna PFP-2反相色譜柱柱(Phenomenex),獲得了較好的保留[16]。Isabella Squellerio等[17]學(xué)者選用了兩種方法對GSH進行檢測,一種采用高效液相色譜法和電化學(xué)技術(shù)聯(lián)合(HPLC-ECD)檢測,選用Synergy Hydro-RP(150mm×4.6mm,5m)色譜柱,流動相為含1%乙腈的20mM磷酸鉀緩沖液(正磷酸調(diào)整pH值至2.7)。另一種采用液質(zhì)聯(lián)用(LCMS/MS)技術(shù),選用Luna PFP(2)(100mm×2.0mm,3m)色譜柱,質(zhì)譜流動相A相為0.75mM的甲酸銨(甲酸調(diào)節(jié)PH值至3.5),B相為甲醇。兩者比較Isabella Squellerio認(rèn)為GSH的檢測,LC-MS相對于HPLC-ECD具有更高的選擇性,精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度,檢測的穩(wěn)定性也更好。Sophie Robin[18]等 使 用 MODULO CART QS KROMASIL 5C18 (INTERCHIM,F(xiàn)rance)(250mm×2mm×5m)色譜柱,流動相為含0.1%加酸的乙腈/水(50/50, v/v)。 也 有學(xué)者[19]采用Hypercarb的(Thermo Scientific,2.1mm×50mm×5m)色譜柱,流動相A相為含0.1%甲酸的水,B相為0.1%的乙腈,獲得了較準(zhǔn)確的測定結(jié)果。在以往的液相色譜檢測GSH過程中較常用的是反相C18色譜柱,然而認(rèn)為這種色譜柱對極性高的化合物(GSH)保留較低。Yusuke Iwasaki[22]采用了一款更適合檢測高級性化合物的色 譜 柱,HILIC(150mm×2.1mm;Waters, Japan)色譜柱,流動相A相為0.5mM甲酸胺緩沖液(pH 4.0),B相為乙腈,這款色譜柱更容易分離高極性化合物。

    2.2內(nèi)標(biāo)的選擇 由于基質(zhì)效應(yīng)以及其他多方面因素的影響,應(yīng)選用與化合物性質(zhì)較為相似的同位素內(nèi)標(biāo)[19],如GSH(GSH 13C2,15N)、GSSG(GSSG 13C4,15N2)[20]。但同位素內(nèi)標(biāo)具有價格昂貴、不易獲得等缺點。谷胱甘肽乙酯[21],巰基苯甲酸[15],谷?;劝彼醄22],阿昔洛韋等[23]也可作為內(nèi)標(biāo)使用。

    2.3樣品預(yù)處理 GSH樣品預(yù)處理過程中最為關(guān)鍵的是防治其發(fā)生氧化。當(dāng)PH>7時,GSH易發(fā)生非酶促的氧化反應(yīng),酶促的GSH轉(zhuǎn)化的中介是γ -谷?;D(zhuǎn)肽酶,在中性PH值時其表現(xiàn)出最佳活力。因而建議將PH控制在酸性范圍內(nèi)。Rossi 和Caussé[24-26]已經(jīng)對此進行了論證。此外GSH可以與蛋白質(zhì)結(jié)合,形成結(jié)合物glutathionylated protein。在樣品處理中加入含三丁基磷的二甲基甲酰胺10%(V/V)能有效的將其分離[5]。在測量全血、紅細(xì)胞[25]和血漿以及尿液[26]中GSSG時應(yīng)避免由于GSH氧化所造成的GSSG的高估。為了準(zhǔn)確測量GSH以及GSSG,樣品收集、防止氧化、沉蛋白以及對巰基的衍生化反應(yīng)等意義重大。

    2.3.1樣品收集 樣品收集過程對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要,在全血和血漿中紅細(xì)胞溶血和儲存溫度等因素都對GSH和GSSG化驗的結(jié)果造成潛在影響。樣品收集后應(yīng)盡早冷藏,以減少由于樣品發(fā)生自氧化以及蛋白質(zhì)水解對檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的干擾[27]。在抽血過程中防止發(fā)生溶血以及控制儲存溫度對樣品的準(zhǔn)確測量非常重要,血漿收集后建議盡早離心分離[26,27]。溶血的血漿中GSH的易被高估,這是由于紅細(xì)胞中的GSH約為血漿中GSH的500倍。另外,建議采用EDTA抗凝的血液采集管。EDTA不但有抗凝的功能還具有絡(luò)合金屬離子(例如Fe2+)的功能,因而可以防止氧化反應(yīng)的發(fā)生[26,27]。diethylenetriaminopentaacetic acid(DETAPAC)也可作為非常重要的鐵離子螯合劑[28]。

    2.3.2.防止 發(fā) 生 氧 化 GSH易 被 氧 化 成GSSH。然而衍生化試劑N-乙基馬來酰亞胺(N-ethylmaleimide,NEM)[29,30],碘乙酸(iodoacetic acid,IAA)的加入使其轉(zhuǎn)化為較為穩(wěn)定的衍生物將有效的避免這一現(xiàn)象。衍生化試劑的選擇對實驗分析的結(jié)果有很大影響。二硫赤蘚糖醇,二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、等巰基還原劑的使用都給GSH檢測結(jié)果帶來負(fù)面影響,這是由于他們與一些熒光試劑發(fā)生了競爭反應(yīng)。MBB和鄰苯二醛會導(dǎo)致熒光化合物干擾物的形成。

    鈉和硼氫化鉀都是高效的還原劑,但是他們在水溶液中不穩(wěn)定[31]。高濃度的還原劑發(fā)生還原反應(yīng)僅需幾分鐘,但是低濃度時(40-100mM)需要30分鐘以上或者加熱的條件下才能完成。反應(yīng)過程中形成的氣體或氣泡可通過加入單磷酸(monophosphoric acid,MPA)或表面活性劑來去除,如辛醇[32]。連二亞硫酸鹽(DT,連二硫酸鈉)也被用于二硫化合物的還原劑。

    2.3.3除蛋白 蛋白質(zhì)廣泛存在于生物樣品中,然而它們的存在不但為化合物檢測帶來不同程度干擾,還會堵塞色譜柱、降低儀器的使用壽命等。因此,在多數(shù)情況下蛋白質(zhì)應(yīng)在樣品檢測之前去除。只有少數(shù)方法(例如核磁共振)適用于檢測完整細(xì)胞或應(yīng)用于非脫去蛋白質(zhì)的樣品。酸化、有機溶劑,如乙腈、丙酮或甲醇,超濾等都可用于去除蛋白質(zhì)。常用的酸性除蛋白試劑是5-磺基水楊酸(5-sulfosalicylic acid,5-SSA),三 氯 乙 酸 (trichloroacetic acid,TCA),三 氟 乙 酸(rifluoroacetic acid,TFA),高 氯酸(perchloric acid PCA)等[33,34]。相關(guān)報道提出終濃度為15%的PCA效果最佳[34]。

    Caussé等[26]學(xué)者建立了用5-磺基水楊酸(5-SSA)或者乙腈(ACN)沉蛋白結(jié)合以6-iodoacetamidofluorescein (6-IAF)為衍生化試劑檢測GSH的方法。然而在酸性環(huán)境下使用有機溶劑沉蛋白,如未對巰基進行保護將無法避免GSH發(fā)生氧化反應(yīng)。Rossi等[25]學(xué)者發(fā)現(xiàn)將溶液的酸性環(huán)境調(diào)節(jié)至中性或者堿性PH值后,如果沒有預(yù)先對巰基進行保護也會使巰基的濃度迅速降低。因而沉蛋白前保持巰基的穩(wěn)定性至關(guān)重要。

    此外,應(yīng)用過濾的方法限制大分子的物質(zhì)的濾過,也是一種有效去除蛋白質(zhì)的方法[35-36]。這種方法的優(yōu)點是不需要加入影響分離、衍生化、檢測的酸和有機溶劑。大多數(shù)蛋白還可以應(yīng)用膜濾法結(jié)合微濃度離心的方法去除[37]。Yusuke Iwasaki等[22]通過固相萃取(Solid-phase extraction,SPE)的方法去除唾液中的蛋白獲得較好的效果。

    2.3.4 GSH的衍生化 GSH有三個衍生化的位點,分別是羧基、氨基和硫醇,但首選發(fā)生衍生化的位點是硫醇。相比之下,GSSG能進行衍生化的位點只有兩個,分別是氨基和羧基組。

    最常用的衍生化反應(yīng)化合物是NEM[30,38],IAA[39]和碘乙酰胺(IA)[40]。5,5’二硫硝基苯甲酸(5,5 ′ -dithiobis(2-nitrobenzoic acid),DTNB)也是一種檢測GSH和GSSG的衍生化試劑[21,41,42]。NEM可與與巰醇發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng),常被用于熒光檢測與質(zhì)譜聯(lián)用來測定GSSG[15,43-45]。但IA發(fā)生衍生化反應(yīng)的同時,也產(chǎn)生了一些干擾物質(zhì)。由于NEM對谷胱甘肽還原酶(GR)的抑制作用,應(yīng)用NEM與谷胱甘肽還原酶的偶聯(lián)反應(yīng)發(fā)生較為困難。同時需注意的是當(dāng)PH大于7.5時NEM會與氨基發(fā)生反應(yīng),雖然相比較巰基來說此反應(yīng)發(fā)生的較少[24]。因此當(dāng)反應(yīng)在堿性條件下,或者使用了氨基的衍生化試劑例如FDNB時,反應(yīng)后多余的NEM應(yīng)在變成堿性化媒介之前去除。已有學(xué)者證實只有在酸化前加入NEM才可以防止巰基組氧化,否則會造成GSH的低估,以及GSSG的高估。但Tereza Moore[19]建立了同時加入NEM和SSA的一步反應(yīng),也獲得了較好的結(jié)果。

    3.結(jié)語

    GSH作為細(xì)胞的一種抗氧化劑,參與多種重要的生理過程,可保護細(xì)胞免遭氧化損傷,解除藥物代謝產(chǎn)物的毒性,調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞凋亡,并與物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運相關(guān)。GSH參加抗氧化酶的酶促反應(yīng),具有協(xié)調(diào)內(nèi)源性與外源性抗氧化劑的作用。同時GSH維持自由基的產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡,并使內(nèi)環(huán)境處于穩(wěn)定的還原態(tài)。GSH對維持機體健康以及疾病發(fā)生有預(yù)防和治療的作用。在GSH測定過程中,最為重要的是維持樣品中GSH的穩(wěn)定,防止氧化。目前,對于維持其穩(wěn)定并且準(zhǔn)確測定已有較為全面的研究,但存在操作繁瑣、重復(fù)性差、以及樣品處理方法說法不一等問題。準(zhǔn)確對機體GSH進行定量及定性分析,并對其狀態(tài)做出正確評價具有重要臨床意義,其方法學(xué)還需繼續(xù)改進。

    [1] FG Hopkins. On an Autoxidisable Constituent of the Cell[J]. Biochem J,1921,15(2):286-305

    [2] M Valko, D Leibfritz, J Moncol, et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease[J]. Int J Biochem Cell Biol,2007,39(1):44-84

    [3] I Dalle-Donne, R Rossi, R Colombo, et al. Biomarkers of oxidative damage in human disease[J]. Clin Chem,2006,52(4):601-623

    [4] 王培歡,吳高義,朱國雄.睡眠剝奪對大鼠咬肌氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志,2013,11(2):79-82

    [5] S Persichilli, J Gervasoni, M Castagnola, et al. A Reversed-Phase HPLC Fluorimetric Method for Simultaneous Determination of Homocysteine-Related Thiols in Different Body Fluids[J]. Laboratory Medicine,2011,42(11):657-662

    [6] L Flohe. Glutathione peroxidase: fact and fiction[J]. Ciba Found Symp, 1978(65):95-122

    [7] DJ Reed, MW Fariss. Glutathione depletion and susceptibility[J]. Pharmacol Rev,1984,36(2 Suppl):25s-33s

    [8] I Dalle-Donne, R Rossi, G Colombo, et al. Protein S-glutathionylation: a regulatory device from bacteria to humans[J]. Trends Biochem Sci,2009,34(2):85-96

    [9] IA Blair. Endogenous glutathione adducts[J]. Curr Drug Metab,2006,7(8):853-872

    [10] D Giustarini, A Milzani, I Dalle-Donne, et al. Red blood cells as a physiological source of glutathione for extracellular fluids[J]. Blood Cells Mol Dis,2008,40(2):174-179

    [11] W Jian, SH Lee, C Mesaros, et al. A novel 4-oxo-2(E)-nonenal-derived endogenous thiadiazabicyclo glutathione adduct formed during cellular oxidative stress[J]. Chem Res Toxicol,2007,20(7):1008-1018

    [12] ME Anderson, JL Luo. Glutathione therapy: from prodrugs to genes[J]. Semin Liver Dis,1998,18(4):415-424

    [13] MM Gallogly, JJ Mieyal. Mechanisms of reversible protein glutathionylation in redox signaling and oxidative stress[J]. Curr Opin Pharmacol,2007,7(4):381-391

    [14] JJ Mieyal, MM Gallogly, S Qanungo, et al. Molecular mechanisms and clinical implications of reversible protein S-glutathionylation[J]. Antioxid Redox Signal,2008,10(11):1941-1988

    [15] E Camera, M Rinaldi, S Briganti, et al. Simultaneous determination of reduced and oxidized glutathione in peripheral blood mononuclear cells by liquid chromatography-electrospray mass spectrometry[J]. J Chromatogr B Biomed Sci Appl,2001,757(1):69-78

    [16] D Carroll, D Howard, H Zhu, et al. Simultaneous quantitation of oxidized and reduced glutathione via LC-MS/ MS: An insight into the redox state of hematopoietic stem cells[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2016,97:85-94

    [17] I Squellerio, D Caruso, B Porro, et al. Direct glutathione quantification in human blood by LC-MS/MS: comparison with HPLC with electrochemical detection[J]. J Pharm Biomed Anal,2012,71:111-118

    [18] S Robin, N Leveque, C Courderot-Masuyer, et al. LC-MS determination of oxidized and reduced glutathione in human dermis: a microdialysis study[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2011,879(30):3599-3606

    [19] T Moore, A Le, AK Niemi, et al. A new LC-MS/MS method for the clinical determination of reduced and oxidized glutathione from whole blood[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2013,929:51-55

    [20] SG Lee, J Yim, Y Lim, et al. Validation of a liquid chromatography tandem mass spectrometry method to measure oxidized and reduced forms of glutathione in whole blood and verification in a mouse model as an indicator of oxidative stress[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2016,1019:45-50

    [21] X Guan, B Hoffman, C Dwivedi, et al. A simultaneous liquid chromatography/mass spectrometric assay of glutathione, cysteine, homocysteine and their disulfides in biological samples[J]. J Pharm Biomed Anal, 2003,31(2):251-261

    [22] Y Iwasaki, M Hoshi, R Ito, et al. Analysis of glutathione and glutathione disulfide in human saliva using hydrophilic interaction chromatography with mass spectrometry[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2006,839(1-2):74-79

    [23] 張全英,周文佳. 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿和全血中內(nèi)源性還原型谷胱甘肽濃度[J]. 中國新藥與臨床雜志,2010,29(8):620-624

    [24] R Rossi, A Milzani, I Dalle-Donne, et al. Blood glutathione disulfide: in vivo factor or in vitro artifact?[J]. Clin Chem,2002,48(5):742-753

    [25] R Rossi, I Dalle-Donne, A Milzani, et al. Oxidized forms of glutathione in peripheral blood as biomarkers of oxidative stress[J]. Clin Chem,2006,52(7):1406-1414

    [26] E Causse, C Issac, P Malatray, et al. Assays for total homocysteine and other thiols by capillary electrophoresislaser-induced fluorescence detection. I. Preanalytical condition studies[J]. J Chromatogr A, 2000,895(1-2):173-178

    [27] C Bayle, C Issac, R Salvayre, et al. Assay of total homocysteine and other thiols by capillary electrophoresis and laser-induced fluorescence detection. II. Pre-analytical and analytical conditions[J]. J Chromatogr A,2002,979(1-2):255-260

    [28] DH Truong, MA Eghbal, W Hindmarsh, et al. Molecular mechanisms of hydrogen sulfide toxicity[J]. Drug Metab Rev,2006,38(4):733-744

    [29] P Ostadal, M Mlcek, A Kruger, et al. Mild therapeutic hypothermia is superior to controlled normothermia for the maintenance of blood pressure and cerebral oxygenation, prevention of organ damage and suppression of oxidative stress after cardiac arrest in a porcine model[J]. J Transl Med,2013,11:124

    [30] A Florholmen-Kjaer, RA Lysa, OM Fuskevag, et al. A sensitive method for the analysis of glutathione in porcine hepatocytes[J]. Scand J Gastroenterol,2014,49(11):1359-1366

    [31] RE Hansen, H Ostergaard, P Norgaard, et al. Quantification of protein thiols and dithiols in the picomolar range using sodium borohydride and 4,4’-dithiodipyridine[J]. Anal Biochem,2007,363(1):77-82

    [32] A Pastore, G Federici, E Bertini, et al. Analysis of glutathione: implication in redox and detoxification[J]. Clin Chim Acta,2003,333(1):19-39

    [33] Q Yang, C Krautmacher, D Schilling, et al. Simultaneous analysis of oxidized and reduced glutathione in cell extracts by capillary zone electrophoresis[J]. Biomed Chromatogr,2002,16(3):224-228

    [34] D Stempak, S Dallas, J Klein, et al. Glutathione stability in whole blood: effects of various deproteinizing acids[J]. Ther Drug Monit, 2001,23(5):542-549

    [35] C Carru, A Zinellu, GM Pes, et al. Ultrarapid capillary electrophoresis method for the determination of reduced and oxidized glutathione in red blood cells[J]. Electrophores is,2002,23(11):1716-1721

    [36] C Carru, A Zinellu, S Sotgia, et al. Optimization of the principal parameters for the ultrarapid electrophoretic separation of reduced and oxidized glutathione by capillary electrophoresis[J]. J Chromatogr A,2003,1017(1-2):233-238

    [37] C Muscari, M Pappagallo, D Ferrari, et al. Simultaneous detection of reduced and oxidized glutathione in tissues and mitochondria by capillary electrophoresis[J]. J Chromatogr B Biomed Sci Appl,998,707(1-2):301-307

    [38] A Barath, S Turi, I Nemeth, et al. Different pathomechanisms of essential and obesityassociated hypertension in adolescents[J]. Pediatr Nephrol,2006,21(10):1419-1425

    [39] J Bouligand, A Deroussent, A Paci, et al. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay of reduced and oxidized glutathione and main precursors in mice liver[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2006,832(1):67-74

    [40] Z Yang, AB Attygalle. LC/MS characterization of undesired products formed during iodoacetamide derivatization of sulfhydryl groups of peptides[J]. J Mass Spectrom,2007,42(2):233-243

    [41] SY Rhieu, AA Urbas, KA Lippa, et al. Quantitative measurements of glutathione in yeast cell lysate using 1H NMR[J]. Anal Bioanal Chem,2013,405(14):4963-4968

    [42] L Blahova, J Kohoutek, J Lebedova, et al. Simultaneous determination of reduced and oxidized glutathione in tissues by a novel liquid chromatography-mass spectrometry method: application in an inhalation study of Cd nanoparticles[J]. Anal Bioanal Chem,2014,406(24):5867-5876

    [43] JP Steghens, F Flourie, K Arab, et al. Fast liquid chromatography-mass spectrometry glutathione measurement in whole blood: micromolar GSSG is a sample preparation artifact[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2003,798(2):343-349

    [44] R Kand’ar, P Zakova, H Lotkova, et al. Determination of reduced and oxidized glutathione in biological samples using liquid chromatography with fluorimetric detection[J]. J Pharm Biomed Anal,2007,43(4):1382-1387

    [45] CB Cabral, KH Bullock, DJ Bischoff, et al. Estimating glutathione synthesis with deuterated water: a model for peptide biosynthesis[J]. Anal Biochem, 2008,379(1):40-44

    Application of HPLC and hyphenated chromatograph on Glutathione measurement

    XU Ying-ying, WANG Yan-yi.
    (Department of Stomatology, the Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

    Glutathione (GSH) is a thiol-containing tripeptide. Free glutathione is present mainly in its reduced form, which can be converted to the oxidized glutathione (GSSG) during oxidative stress, and can be reverted to the reduced form by the action of the enzyme glutathione reductase(GSH).Reduced glutathione plays an essential role in protecting cells from oxidative damage . Almost all mammals have glutathione in their bodies Measurement of GSH and GSSG is a useful indicator of oxidative stress and disease risk. As a possible marker of oxidative stress, many studies have measured GSH and GSSG. However, large differences in GSH and GSSG levels reported in different studies, calls for a reliable standardized method. This is due to the autoxidation of GSH resulting in an underestimation of GSH, and the overestimation of GSSG and (or) GSH / GSSG underestimation In this paper, we review determination GSH and GSSG with high performance liquid chromatography (HPLC)and hyphenated chromatography such as liquid chromatographmass spectrometer(LC-MS),et al.

    Glutathione ; Chromatography, High Performance Liquid

    R781

    A< class="emphasis_bold">[文章編號]1

    1672-2973(2017)01-0051-06

    2016-08-10)

    “十二五”國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(項目編號:2012AA020809)三亞市醫(yī)療衛(wèi)生科技創(chuàng)新項目(項目編號:2014YW34)

    徐瑩瑩 解放軍總醫(yī)院口腔科 碩士生 北京 100853

    王燕一 通訊作者 解放軍總醫(yī)院海南分院口腔科 主任醫(yī)師 副教授 海南 572013

    猜你喜歡
    還原型巰基谷胱甘肽
    還原型閱讀練習(xí)
    還原型閱讀練習(xí)
    蚯蚓谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶分離純化的初步研究
    分光光度法結(jié)合抗干擾補償檢測谷胱甘肽
    瑞替普酶聯(lián)合還原型谷胱甘肽治療急性ST段抬高型心肌梗死療效分析
    巰基-端烯/炔點擊反應(yīng)合成棒狀液晶化合物
    TBBPA對美洲鰻鱺谷胱甘肽代謝相關(guān)指標(biāo)的影響
    海洋中β-二甲基巰基丙酸內(nèi)鹽降解過程的研究進展
    巰基和疏水性對蛋白質(zhì)乳化及凝膠特性的影響
    不同pH值釀酒酵母分批發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽數(shù)學(xué)模型建立
    日韩高清综合在线| a级毛片a级免费在线| 午夜福利在线在线| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 天堂中文最新版在线下载 | 成人三级黄色视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 日韩视频在线欧美| 国产91av在线免费观看| 简卡轻食公司| videossex国产| 日韩强制内射视频| 99热只有精品国产| 日本与韩国留学比较| 人体艺术视频欧美日本| 麻豆成人av视频| 国产精品野战在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 麻豆国产av国片精品| 99国产精品一区二区蜜桃av| 91久久精品国产一区二区三区| 美女黄网站色视频| 美女大奶头视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 天天躁日日操中文字幕| 国产精品无大码| 内射极品少妇av片p| 内地一区二区视频在线| 干丝袜人妻中文字幕| 免费观看的影片在线观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 九九热线精品视视频播放| 爱豆传媒免费全集在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 波多野结衣高清无吗| 亚洲欧美精品自产自拍| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 日本熟妇午夜| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 午夜福利成人在线免费观看| 干丝袜人妻中文字幕| 国产片特级美女逼逼视频| 美女内射精品一级片tv| 一级二级三级毛片免费看| 99在线人妻在线中文字幕| 丰满人妻一区二区三区视频av| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 最近中文字幕高清免费大全6| 久久久久久国产a免费观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| 日日啪夜夜撸| 成人毛片60女人毛片免费| 国产精品一区二区在线观看99 | 男女啪啪激烈高潮av片| 日本黄色视频三级网站网址| 99久久九九国产精品国产免费| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 中文字幕久久专区| 国产综合懂色| 国产精品永久免费网站| 性欧美人与动物交配| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 麻豆乱淫一区二区| 秋霞在线观看毛片| 在线免费十八禁| 1024手机看黄色片| 99riav亚洲国产免费| 嫩草影院入口| 日日干狠狠操夜夜爽| 嫩草影院新地址| av在线天堂中文字幕| or卡值多少钱| 色哟哟·www| 久久久久久久午夜电影| 变态另类丝袜制服| 99在线人妻在线中文字幕| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 成人国产麻豆网| 黄片wwwwww| 午夜a级毛片| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产精品无大码| 极品教师在线视频| 亚洲国产精品成人久久小说 | 亚洲最大成人中文| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美潮喷喷水| 日韩大尺度精品在线看网址| 99热精品在线国产| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产精品电影一区二区三区| av专区在线播放| 国产欧美日韩精品一区二区| 午夜视频国产福利| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 少妇的逼水好多| 亚洲在线观看片| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲在线观看片| 99精品在免费线老司机午夜| 成人综合一区亚洲| 成人美女网站在线观看视频| 久久草成人影院| 免费av不卡在线播放| 久久久久久久久久成人| 日本熟妇午夜| h日本视频在线播放| 亚洲色图av天堂| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲中文字幕日韩| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 天堂网av新在线| 午夜视频国产福利| 亚洲无线观看免费| 久久久久久久久久成人| 看免费成人av毛片| 白带黄色成豆腐渣| 国产老妇女一区| 在线观看av片永久免费下载| 国产三级中文精品| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 1024手机看黄色片| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲人与动物交配视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 欧美色欧美亚洲另类二区| a级毛色黄片| 国产精品伦人一区二区| 亚洲图色成人| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产色爽女视频免费观看| 99精品在免费线老司机午夜| 波多野结衣巨乳人妻| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产老妇女一区| 大型黄色视频在线免费观看| 国产三级在线视频| 日韩中字成人| 国产精品,欧美在线| 精品久久国产蜜桃| 免费大片18禁| 色播亚洲综合网| 亚洲高清免费不卡视频| 1024手机看黄色片| 国产69精品久久久久777片| 成年av动漫网址| 亚洲人成网站高清观看| 99久久精品一区二区三区| 中文资源天堂在线| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 九九在线视频观看精品| ponron亚洲| av免费观看日本| 亚洲av.av天堂| 色哟哟·www| 18禁在线播放成人免费| 一级毛片我不卡| 乱系列少妇在线播放| 免费在线观看成人毛片| 亚洲av不卡在线观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 欧美一级a爱片免费观看看| 少妇的逼水好多| 大香蕉久久网| 国产免费一级a男人的天堂| 蜜臀久久99精品久久宅男| 精华霜和精华液先用哪个| 99热网站在线观看| 国国产精品蜜臀av免费| 69人妻影院| 国产亚洲精品久久久com| 一进一出抽搐动态| 久久久成人免费电影| 久久中文看片网| 欧美性猛交黑人性爽| 丝袜美腿在线中文| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产69精品久久久久777片| 亚洲天堂国产精品一区在线| av专区在线播放| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 日韩欧美一区二区三区在线观看| 九九热线精品视视频播放| 亚洲精品影视一区二区三区av| 老司机影院成人| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲精品国产成人久久av| 欧美zozozo另类| 男人和女人高潮做爰伦理| 如何舔出高潮| 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美+日韩+精品| 九九在线视频观看精品| av在线观看视频网站免费| 久久99热这里只有精品18| a级毛片a级免费在线| 卡戴珊不雅视频在线播放| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲美女搞黄在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产精品久久电影中文字幕| 赤兔流量卡办理| 夫妻性生交免费视频一级片| 色哟哟哟哟哟哟| 日韩精品有码人妻一区| a级毛片a级免费在线| 性色avwww在线观看| 久久人人爽人人片av| 真实男女啪啪啪动态图| 日韩欧美在线乱码| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲成人久久性| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲内射少妇av| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲人与动物交配视频| 国产在视频线在精品| 在线播放无遮挡| 亚洲国产高清在线一区二区三| 成人三级黄色视频| 国产一区二区在线av高清观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 久久久久性生活片| 中文字幕久久专区| 看免费成人av毛片| 久久热精品热| 一区福利在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 禁无遮挡网站| 成人亚洲精品av一区二区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产老妇女一区| 日本色播在线视频| 有码 亚洲区| 亚洲五月天丁香| 一级av片app| 成人午夜精彩视频在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 深夜a级毛片| 国产精品三级大全| videossex国产| 国产v大片淫在线免费观看| 国产在线男女| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产亚洲5aaaaa淫片| 精品午夜福利在线看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产在视频线在精品| 特级一级黄色大片| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产伦精品一区二区三区视频9| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 色5月婷婷丁香| 成人毛片60女人毛片免费| 美女黄网站色视频| 日本av手机在线免费观看| 三级毛片av免费| 国产 一区 欧美 日韩| 一个人看视频在线观看www免费| 精品人妻偷拍中文字幕| 在线免费观看的www视频| 欧美又色又爽又黄视频| 久久精品国产清高在天天线| 在线观看美女被高潮喷水网站| 一进一出抽搐动态| 国内精品久久久久精免费| av福利片在线观看| 中文欧美无线码| 一边亲一边摸免费视频| 日韩欧美精品免费久久| 桃色一区二区三区在线观看| 日韩欧美在线乱码| ponron亚洲| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 午夜福利在线观看吧| 成人亚洲精品av一区二区| 麻豆成人av视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 99热只有精品国产| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 晚上一个人看的免费电影| 精品久久久久久久久久久久久| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 在线免费十八禁| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 伦精品一区二区三区| 22中文网久久字幕| 哪里可以看免费的av片| 男人的好看免费观看在线视频| 内地一区二区视频在线| 婷婷亚洲欧美| 在线观看一区二区三区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产美女午夜福利| 日韩一区二区视频免费看| 我的老师免费观看完整版| 色吧在线观看| 六月丁香七月| 日本在线视频免费播放| 久久久久久久久久久免费av| 哪个播放器可以免费观看大片| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 1024手机看黄色片| 国内精品久久久久精免费| 日本黄大片高清| 日日撸夜夜添| 国产精品久久视频播放| 老司机福利观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 免费观看a级毛片全部| 国产精品精品国产色婷婷| 韩国av在线不卡| 91精品一卡2卡3卡4卡| 日日啪夜夜撸| 一级毛片电影观看 | 美女黄网站色视频| 国产成人影院久久av| 高清在线视频一区二区三区 | 1024手机看黄色片| 午夜福利成人在线免费观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 在线观看一区二区三区| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲国产精品久久男人天堂| 99久久九九国产精品国产免费| 一区福利在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 校园春色视频在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 国产免费一级a男人的天堂| 97在线视频观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 欧美潮喷喷水| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 男女边吃奶边做爰视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 午夜免费男女啪啪视频观看| 中文欧美无线码| 一区二区三区四区激情视频 | av天堂在线播放| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲精品456在线播放app| 日本熟妇午夜| 看非洲黑人一级黄片| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久久精品大字幕| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久久久久久午夜电影| 国产日本99.免费观看| 亚洲无线观看免费| 哪个播放器可以免费观看大片| 精品久久久久久久末码| 国产大屁股一区二区在线视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 哪个播放器可以免费观看大片| 男女视频在线观看网站免费| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产精品三级大全| 国产亚洲欧美98| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲欧洲国产日韩| 性色avwww在线观看| 欧美潮喷喷水| 日本与韩国留学比较| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产 一区 欧美 日韩| 成人毛片60女人毛片免费| 欧美性猛交黑人性爽| 国产日本99.免费观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产不卡一卡二| 春色校园在线视频观看| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 国产精品人妻久久久久久| 亚洲乱码一区二区免费版| 午夜福利在线观看吧| 成人一区二区视频在线观看| 国产av在哪里看| av卡一久久| 99精品在免费线老司机午夜| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 欧美成人a在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久久午夜欧美精品| 偷拍熟女少妇极品色| 国产伦一二天堂av在线观看| 悠悠久久av| 日韩三级伦理在线观看| 欧美色视频一区免费| 精品久久久久久久久久久久久| .国产精品久久| 在线免费观看的www视频| 欧美成人a在线观看| 亚洲不卡免费看| 亚洲色图av天堂| 色噜噜av男人的天堂激情| 69av精品久久久久久| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲成人av在线免费| 搡女人真爽免费视频火全软件| 99久久精品国产国产毛片| 青春草视频在线免费观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产精品爽爽va在线观看网站| 日本黄色片子视频| 黄色一级大片看看| 丰满的人妻完整版| 亚洲欧美日韩高清专用| 精品久久久噜噜| 三级国产精品欧美在线观看| 国产av不卡久久| 久99久视频精品免费| 欧美日本视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 两个人视频免费观看高清| 国产91av在线免费观看| 黄色配什么色好看| 午夜a级毛片| 美女内射精品一级片tv| 别揉我奶头 嗯啊视频| 日本黄大片高清| 丰满乱子伦码专区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产伦精品一区二区三区四那| 久久久久久九九精品二区国产| 久久久久久久午夜电影| 国产 一区 欧美 日韩| 九九在线视频观看精品| 国产男人的电影天堂91| 国产精品一二三区在线看| 日本熟妇午夜| 国产精品av视频在线免费观看| 男人的好看免费观看在线视频| 免费人成在线观看视频色| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲精品国产成人久久av| 日本黄色片子视频| 少妇高潮的动态图| 国产精品av视频在线免费观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 欧美变态另类bdsm刘玥| 精品人妻视频免费看| 一区二区三区免费毛片| 老女人水多毛片| 成人毛片60女人毛片免费| 成年女人永久免费观看视频| a级毛色黄片| 91狼人影院| 男女下面进入的视频免费午夜| 最近手机中文字幕大全| 久久久久免费精品人妻一区二区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 久久久久久久久久黄片| 国产69精品久久久久777片| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 嫩草影院精品99| 观看免费一级毛片| 国产真实伦视频高清在线观看| 简卡轻食公司| 国产毛片a区久久久久| 亚洲无线在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 久久国产乱子免费精品| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲经典国产精华液单| 日韩强制内射视频| 观看免费一级毛片| 成人三级黄色视频| 亚洲成人久久爱视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 可以在线观看的亚洲视频| 欧美日韩综合久久久久久| 我要搜黄色片| 青春草视频在线免费观看| 在线观看一区二区三区| a级毛色黄片| av在线蜜桃| 国产精品久久视频播放| 国产精品99久久久久久久久| 久久精品影院6| 亚洲国产精品国产精品| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 日本欧美国产在线视频| 看十八女毛片水多多多| 18禁在线播放成人免费| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 在线观看一区二区三区| 国产精品一二三区在线看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产成人a∨麻豆精品| 精品久久久久久久久av| 又爽又黄无遮挡网站| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 特级一级黄色大片| a级毛片免费高清观看在线播放| 精品人妻一区二区三区麻豆| 男女下面进入的视频免费午夜| 99热6这里只有精品| 身体一侧抽搐| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 天天一区二区日本电影三级| 国产视频首页在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 黑人高潮一二区| 久久精品国产亚洲av天美| 免费观看a级毛片全部| 最近的中文字幕免费完整| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产av不卡久久| 亚洲在线自拍视频| avwww免费| 亚洲精品456在线播放app| 久久久久久久久中文| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 午夜福利成人在线免费观看| 最好的美女福利视频网| 美女 人体艺术 gogo| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久午夜福利片| 不卡视频在线观看欧美| 国产精品女同一区二区软件| 国产精品人妻久久久久久| 有码 亚洲区| 最近最新中文字幕大全电影3| 欧美bdsm另类| 一级av片app| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 午夜免费激情av| 欧美不卡视频在线免费观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产精品99久久久久久久久| 激情 狠狠 欧美| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产探花在线观看一区二区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 中文在线观看免费www的网站| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲一区高清亚洲精品| 免费看a级黄色片| 美女 人体艺术 gogo| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲在久久综合| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲性久久影院| 欧美性感艳星| 尾随美女入室| 国产精品女同一区二区软件| 国产成人一区二区在线| 超碰av人人做人人爽久久| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久这里有精品视频免费| 爱豆传媒免费全集在线观看| 十八禁国产超污无遮挡网站| 97超视频在线观看视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 美女国产视频在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 欧美xxxx性猛交bbbb| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产淫片久久久久久久久| 边亲边吃奶的免费视频| 精品人妻熟女av久视频| 久久热精品热| 三级毛片av免费| 久久欧美精品欧美久久欧美| 一级黄片播放器| av在线观看视频网站免费| 久久久国产成人精品二区| 国产 一区精品| 成熟少妇高潮喷水视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 免费黄网站久久成人精品| 搡女人真爽免费视频火全软件| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲美女搞黄在线观看| 99久久精品热视频| 直男gayav资源| 99久久精品热视频| 又爽又黄a免费视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久久久性生活片| 精品熟女少妇av免费看|