腦膠質(zhì)瘤小鼠模型構(gòu)建研究進(jìn)展

張祖勇 程洪強(qiáng) 董曉巧 王昊 張仕蓉

腦膠質(zhì)瘤小鼠模型構(gòu)建研究進(jìn)展

張祖勇 程洪強(qiáng) 董曉巧 王昊 張仕蓉

腦膠質(zhì)瘤（glioma）是一種常見的腦腫瘤，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)等組織學(xué)特征，可以分成Ⅳ級(jí)，其中Ⅰ、Ⅱ級(jí)為進(jìn)展慢，惡性程度低的低級(jí)別膠質(zhì)瘤；而Ⅲ、Ⅳ級(jí)為惡性程度高的高級(jí)別腫瘤，包括最常見的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性程度高，患者生存時(shí)間短，1年生存率＜50%，5年生存率＜5%［1］。世界衛(wèi)生組織建議根據(jù)基因突變的分子病理特征對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)行分型，指導(dǎo)患者的管理和藥物使用［2-4］。目前對(duì)膠質(zhì)瘤的治療方法主要是手術(shù)切除，輔助以術(shù)后放化療。由于膠質(zhì)瘤的高度侵襲性無法完全去除腫瘤細(xì)胞。血腦屏障的存在降低化療藥物治療效果，膠質(zhì)瘤患者術(shù)后易復(fù)發(fā)［1］。對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)生的分子與細(xì)胞水平的認(rèn)識(shí)及新型治療藥物的研發(fā)均需要模式生物［5］。本文對(duì)膠質(zhì)瘤研究中的小鼠模型進(jìn)行綜述。

1 化學(xué)誘變

上世紀(jì)70年代用致癌劑誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生彌漫性膠質(zhì)瘤是早期廣泛使用的膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型。孕鼠尾靜脈注射亞硝基硫脲（N-ethyl-N-Nitrosourea，NEU）導(dǎo)致多數(shù)宮內(nèi)暴露致癌劑仔鼠發(fā)生膠質(zhì)瘤（成年動(dòng)物注射致癌劑不能產(chǎn)生腦瘤）［6］。對(duì)化學(xué)誘變產(chǎn)生的膠質(zhì)瘤進(jìn)行基因變異分析，發(fā)現(xiàn)存在與臨床一致的p53突變和PDGFR/EGFR基因拷貝數(shù)增加等基因變異［7］?；瘜W(xué)誘導(dǎo)產(chǎn)生的膠質(zhì)瘤較好模擬了臨床上膠質(zhì)瘤的遺傳異質(zhì)性，同時(shí)保全小鼠的免疫系統(tǒng)和血腦屏障。然而由于基因突變的隨機(jī)性導(dǎo)致膠質(zhì)瘤生成重復(fù)性差（如腫瘤發(fā)生率，惡性程度，腫瘤類型與位置等）不足，現(xiàn)已較少使用這種小鼠模型研究膠質(zhì)瘤。

現(xiàn)在普遍使用的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，如9L，C6，GL261及CNS-1等，來自化學(xué)誘導(dǎo)的大鼠或小鼠膠質(zhì)瘤模型［8］。C6細(xì)胞株來自甲基硫脲處理的大鼠，組化與腫瘤標(biāo)志物與人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相似，但無抑癌基因p53的變異。CNS-1同樣是大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，表達(dá)膠質(zhì)瘤標(biāo)志物，比如GFAP，S100β等，及表現(xiàn)出人膠質(zhì)瘤的典型特征彌漫性和浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。9L和GL261來自小鼠的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，前者有p53突變和EGFR過表達(dá)，但不表達(dá)GFAP，也不表現(xiàn)為彌漫性侵入式生長(zhǎng)，因此認(rèn)為其為膠質(zhì)肉瘤。GL261表現(xiàn)為低分化的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。具有p53和K-ras 基因突變及PI3K/AKT活化等特征。這些細(xì)胞株不僅普遍應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的分子細(xì)胞生物學(xué)研究，也是異種細(xì)胞移植模型中普遍使用的細(xì)胞來源。

2 異種細(xì)胞移植

將腫瘤細(xì)胞注射入小鼠皮下（異位）或顱腔內(nèi)（原位）可以形成異位或原位膠質(zhì)瘤［9］。腫瘤細(xì)胞可以是來自化學(xué)誘變的膠質(zhì)瘤動(dòng)物的腫瘤細(xì)胞系，也可以是膠質(zhì)瘤患者來源的腫瘤細(xì)胞。皮下異位移植操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，易觀察腫瘤生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)過程，適合研究腫瘤細(xì)胞的增殖行為。異位細(xì)胞移植失去腦部的環(huán)境特征，限制其在藥物研發(fā)中的作用，尤其是針對(duì)腫瘤微環(huán)境的藥物研發(fā)。原位膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植模型能較好的規(guī)避腫瘤微環(huán)境問題。異種移植的另外一個(gè)缺陷是使用免疫缺陷的小鼠，阻礙對(duì)腫瘤與免疫系統(tǒng)相互作用的研究。人源化小鼠的研發(fā)與使用可以讓異種細(xì)胞移植模型更好的服務(wù)于腫瘤的基礎(chǔ)與藥物開發(fā)研究。該小鼠模型在膠質(zhì)瘤基礎(chǔ)研究中廣泛使用，檢測(cè)或篩選新的基因或信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用［10-11］。

3 轉(zhuǎn)基因小鼠模型

小鼠與人在遺傳與生理上存在多方面相似性，這是小鼠成為主要模式動(dòng)物的原因。隨著技術(shù)的進(jìn)步，現(xiàn)在可以在分子水平操作小鼠的基因組，包括不可傳代的體細(xì)胞轉(zhuǎn)染和可傳代的穩(wěn)定遺傳修飾。研究發(fā)現(xiàn)RTK/PI3K、p53和Rb信號(hào)異常是膠質(zhì)瘤發(fā)生與惡性進(jìn)展的核心通路，因此膠質(zhì)瘤小鼠模型主要是回繞這些核心通路構(gòu)建的。

3.1 IDH1R132H突變條件性敲入小鼠模型 異檸檬酸脫氫酶IDH是三羧酸循環(huán)中一個(gè)關(guān)鍵限速酶，包括IDH1、IDH2和IDH3三個(gè)亞型，催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸。人膠質(zhì)瘤中存在IDH1突變，主要是R132H突變，與患者預(yù)后相關(guān)［2，3，12］。在星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)瘤和繼發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，＞90%患者存在IDH1突變。與之相反，在原發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，較少發(fā)生IDH1突變，表明IDH1突變?cè)谀z質(zhì)瘤的發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。突變的IDH1獲得新的催化能力，將α-酮戊二酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成2-羥基戊二酸（2-HG）。代謝物2-HG可以抑制α-酮戊二酸依賴的與表觀遺傳有關(guān)的酶類（如 TET2，DNMT1），導(dǎo)致基因組 DNA 高度甲基化［13］。還可以通過抑制JAK活化，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤發(fā)生

［14］。最近的一項(xiàng)研究應(yīng)用Cre-loxP系統(tǒng)構(gòu)建了條件性IDH1突變（IDH1R132H）敲入小鼠模型［15］。在小鼠IDH1基因的外顯子3上引入R132H突變，并在外顯子2與3間的內(nèi)含子中插入包括loxP位點(diǎn)的IDH1小基因（mini-gene，包括野生型外顯子3～9序列，3'非翻譯區(qū)和polyA信號(hào)）。條件性突變敲入小鼠與Nes-CreERT2小鼠（Nestin基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cre重組酶在神經(jīng)干/前體細(xì)胞特異表達(dá)，CreERT2為Cre的修飾形式，在他莫昔芬作用下發(fā)揮重組酶活性）雜交產(chǎn)生的后代成年后用他莫昔芬誘導(dǎo)可以在神經(jīng)干/前體細(xì)胞中表達(dá)突變的IDH1。分析發(fā)現(xiàn)該小鼠發(fā)生與膠質(zhì)瘤早期相似的病變［15］。表現(xiàn)為小鼠SVZ神經(jīng)干/前體細(xì)胞數(shù)目增加，SVZ細(xì)胞侵襲并發(fā)生異位增殖形成膠質(zhì)瘤前體灶。尤為重要的是，Wnt信號(hào)、端粒酶信號(hào)、細(xì)胞周期等活性增強(qiáng)及基因組DNA甲基化水平上升，且基因表達(dá)譜也與人膠質(zhì)瘤相近。IDH1突變敲入小鼠模型有力支持了IDH1突變?cè)谀z質(zhì)瘤發(fā)生早期的關(guān)鍵作用。IDH1突變敲入小鼠的表型為神經(jīng)干細(xì)胞的不可控增殖，與臨床上膠質(zhì)瘤還是存在一定的差異，因此該小鼠模型適合于研究膠質(zhì)瘤的發(fā)生與細(xì)胞起源，而不適合于膠質(zhì)瘤的治療藥物篩選。人膠質(zhì)瘤中，IDH1突變與P53突變共同發(fā)生，因此該小鼠組合p53基因敲除能否發(fā)生與人膠質(zhì)瘤病理更加接近的小鼠膠質(zhì)瘤值得進(jìn)一步研究。

3.2 p53/Nf1條件性雙敲除小鼠模型 p53是一個(gè)抑癌基因，在多數(shù)的腫瘤包括膠質(zhì)瘤中存在p53基因突變。Nf1（Neurofibromatosis type 1）也是一個(gè)抑癌基因，負(fù)向調(diào)控Ras信號(hào)，因此Nf1缺失導(dǎo)致Ras信號(hào)活化［16］。在小鼠中，僅敲除p53基因不能夠產(chǎn)生膠質(zhì)瘤［17］。GFAP-Cre（Glial fibrillary acidic protein，在星形膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)Cre，）介導(dǎo)的p53/Nf1雙基因條件性敲除小鼠發(fā)生典型的膠質(zhì)瘤，存在偽柵欄樣（pseudopalisading）腫瘤細(xì)胞、壞死、小血管增生等典型特征［17］。該小鼠模型表明雙抑癌基因缺失足夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生膠質(zhì)瘤，并存在低級(jí)別膠質(zhì)瘤向高級(jí)別膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展現(xiàn)象。與此類似的，GFAP-Cre介導(dǎo)的p53與另一抑癌基因PTEN組合缺失小鼠也發(fā)生膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［18］。抑癌基因雙缺失小鼠膠質(zhì)瘤模型是研究膠質(zhì)瘤發(fā)生中腫瘤細(xì)胞起源問題的工具［19-20］，同時(shí)也可以用于膠質(zhì)瘤靶向藥物的研發(fā)。雖然p53與Nf1雙突變能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生類似人膠質(zhì)瘤病變，但在Nf1突變?cè)谌四z質(zhì)瘤中不常見，PDGFR或EGFR拷貝數(shù)增加引起Ras信號(hào)異常活化。

3.3 PDGF限制性過表達(dá)小鼠模型 PDGF/PDGFR信號(hào)屬于RTK信號(hào)，通過活化下游的PI3K/AKT和Ras/MAPK促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和抗凋亡能力。PDGF阻止膠質(zhì)前體細(xì)胞的分化，促進(jìn)其自我更新。高級(jí)別膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中存在PDGFR基因拷貝數(shù)增加的現(xiàn)象，表明PDGF/PDGFR信號(hào)在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。在GFAP或Nestin陽(yáng)性的神經(jīng)干細(xì)胞中通過病毒介導(dǎo)過表達(dá)PDGF可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生膠質(zhì)瘤，大部分為低級(jí)別少突膠質(zhì)瘤。這一小鼠模型表明小鼠膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞中自分泌過量PDGF足以誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)前體細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤［21］。PDGF過表達(dá)加上抑癌基因INK4a-ARF敲除能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高級(jí)別膠質(zhì)瘤。INK4a-ARF基因通過mRNA剪接編碼兩個(gè)功能不同蛋白，分別是細(xì)胞周期抑制分子p16INK4a和p19ARF［22］。INK4a-ARF基因敲除小鼠自發(fā)產(chǎn)生多種腫瘤［23］。INK4a-ARF基因敲除還可以與EGFR活化突變過表達(dá)組合產(chǎn)生膠質(zhì)瘤樣病變［24］。INK4a-ARF基因敲除小鼠組合PDGF過表達(dá)膠質(zhì)瘤小鼠模型用于篩選蛋白酪氨酸激酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)CSF-1R阻斷增加膠質(zhì)瘤對(duì)RTK抑制劑的敏感性［25］。

PDGFB過表達(dá)是通過RCAS/tv-a系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。RCAS病毒載體是鳥逆轉(zhuǎn)錄病毒（avian sarcoma-leukosis virus-A，ASLV-A）RCAS/tv-a系統(tǒng)衍生載體，限制性感染帶有tv-a受體的鳥類細(xì)胞［26］。哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)tv-a受體，或通過轉(zhuǎn)基因方法在小鼠特異細(xì)胞或組織中表達(dá)tv-a受體，能夠?qū)崿F(xiàn)RCAS載體攜帶的基因在特異細(xì)胞或組織中過表達(dá)。如在小鼠中，通過GFAP或Nestin基因的啟動(dòng)子在膠質(zhì)細(xì)胞或者神經(jīng)干細(xì)胞中特異表達(dá)tv-a受體的轉(zhuǎn)基因小鼠Gtv-a或Ntv-a，感染帶有EGFR或PDGFB的RCAS載體能夠在膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞中特異過表達(dá)EGFR或PDGFB。同樣，通過RCAS載體表達(dá)干擾RNA，也能夠?qū)崿F(xiàn)在小鼠特定表達(dá)t-va受體的細(xì)胞中敲降目的基因的表達(dá)。該系統(tǒng)在其它腫瘤的研究中也有應(yīng)用［27-28］。

3.4 其它小鼠 GFAP基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的癌基因在小鼠膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)也可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生膠質(zhì)瘤，比如GFAP-vsrc轉(zhuǎn)基因小鼠中，GFAP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Rous肉瘤病毒v-Src在小鼠膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)，可以使小部分小鼠產(chǎn)生膠質(zhì)瘤［29］。同樣GFAP基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的V-Ha-RAS轉(zhuǎn)基因小鼠可以產(chǎn)生星形細(xì)胞瘤［30］。Src和Ras活化雖然能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生膠質(zhì)瘤樣病變，但臨床上，Src和Ras基因突變并不常見，因此這兩種膠質(zhì)瘤小鼠模型目前已經(jīng)較少使用。

除RCAS/tv-a系統(tǒng)改變小鼠神經(jīng)細(xì)胞基因的方法外，最近也有研究把最新的基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9引入小鼠膠質(zhì)瘤中［31-32］，簡(jiǎn)單快速的在小鼠神經(jīng)細(xì)胞中敲除一個(gè)或多個(gè)抑癌基因。CRISPR/Cas9也可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因小鼠的制備，取代之前廣泛使用的胚胎干細(xì)胞中基因重組的方法。

4 展望

隨著新技術(shù)在臨床研究中的應(yīng)用，目前對(duì)膠質(zhì)瘤的分子病理已經(jīng)有較系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，世界衛(wèi)生組織也建議在分子基礎(chǔ)上對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)行分型管理和治療。動(dòng)物水平的研究可以較好的驗(yàn)證這些基因變異在腫瘤發(fā)生與惡性進(jìn)展中的確切作用，補(bǔ)充了臨床研究。目前膠質(zhì)瘤基礎(chǔ)研究多集中在成人膠質(zhì)瘤方向，而兒童膠質(zhì)瘤是兒童的主要腫瘤，與成人膠質(zhì)瘤有不同的基因突變和組化特征。兒童膠質(zhì)瘤的理解與治療的改善需要與之對(duì)應(yīng)的動(dòng)物模型的發(fā)展。

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浙江省科技廳公益基金項(xiàng)目（2015C37114）

31007 杭州市中醫(yī)院（張祖勇）

31005浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理與病理生理學(xué)系（程洪強(qiáng)）

310006 杭州市第一人民醫(yī)院（董曉巧 王昊 張仕蓉）