天藍苜蓿黃酮組分的制備及清除DPPH自由基活性研究

馬蘭馬駿　李茂星　段海婧　王涇舟　蔡香菊

【摘 要】 目的：以聚酰胺色譜柱分離天藍苜蓿中黃酮組分，研究其清除DPPH自由基的能力。方法：采用多功能動態(tài)熱回流提取濃縮機組提取天藍苜蓿乙醇提取物，通過聚酰胺色譜柱吸附黃酮成分，不同濃度乙醇洗脫后，干燥得不同濃度乙醇洗脫物；采用DPPH自由基清除法，比較天藍苜蓿不同洗脫液中黃酮組分的抗氧化能力。結(jié)果：天藍苜蓿黃酮以三氯化鋁顯色后于紫外423nm有最大吸收；聚酰胺色譜柱上樣洗脫，上樣速度：12mL/min，洗脫速度：18mL/min；不同溶劑洗脫物清除DPPH自由基能力為：30%乙醇洗脫物>60%乙醇洗脫物>90%乙醇洗脫物>水洗脫物。結(jié)論：聚酰胺色譜柱能夠富集分離天藍苜蓿黃酮組分，且30%乙醇洗脫物清除DPPH自由基能力最強。

【關鍵詞】 天藍苜蓿；聚酰胺色譜柱；黃酮；DPPH自由基

【中圖分類號】R914 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）23-0029-04

天藍苜蓿（Medicago lupulina L）為豆科苜蓿屬（Medicago）植物的莖葉或地上部分，廣泛分布于東北、華北、西北、華中和西南各地；夏、秋采收，洗凈曬干備用。其味甘、微澀、性平；具有清熱利濕，涼血止血，舒經(jīng)活絡功效；主治黃疸型肝炎[1]。常見的苜蓿有紫花苜蓿、天藍苜蓿、南方苜蓿。研究表明，紫花苜蓿主要含有黃酮類、多糖類、香豆素類等化合物；具有抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、降血脂等作用[2-4]，但對同科植物天藍苜蓿的藥理作用研究未見報道。實驗以聚酰胺色譜柱分離天藍苜蓿中黃酮組分，研究其清除DPPH自由基能力。

1 儀器與材料

11 儀器 6GU -50k多功能動態(tài)熱回流提取濃縮機組（上海矩源機械設備有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；HH-S26S恒溫水浴鍋（金壇大地自動儀器廠）；HP-8453紫外分光光度計（美國惠普公司）；LyoQuest-55plus冷凍干燥（西班牙Telster）；BPZ6033LC真空干燥箱（上海-恒科技有限公司）；YC1800噴霧干燥（上海雅程儀器設備有限公司）；BP2010S電子天平（德國Sartorius公司）；SpectraMax i3 全自動熒光酶標儀（美國Molecular公司）。

12 材料 天藍苜蓿于2015年7月采自甘肅省平?jīng)鍪嗅轻紖^(qū)，由甘肅中醫(yī)藥大學藥學院中藥鑒定教研室楊扶德教授鑒定為豆科苜蓿屬天藍苜蓿（Medicago lupulina L）地上部分。聚酰胺（20～40目，批號：20111228，浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；95%乙醇（批號：20150424，甘肅潤康藥業(yè)有限公司制造）；無水甲醇（批號：20141127，利安隆博華醫(yī)藥化學有限公司）；三氯化鋁（批號：HG3-927-76，天津市化學試劑廠）；蘆丁對照品（批號：100080-20070，中國藥品生物制品檢定所）；DPPH試劑2，2-二苯基苦味?；诫禄杂苫?，（Sigma-Ald rich公司，批號：D9132-1G）；維生素C（Sigma-Ald rich公司，批號：A92902-25G）；二甲基亞砜（批號：100208，科昊生物工程有限責任公司）。

2 方法

21 天藍苜蓿乙醇提取物的制備 稱取1500 g天藍苜蓿裝入多功能動態(tài)熱回流提取濃縮機組的提取罐中，加5倍70%乙醇浸泡05h，以10、10、8倍70%乙醇70℃回流提取三次，每次1h，合并三次回流提取液，減壓回收乙醇得濃浸膏，60℃真空干燥得天藍苜蓿乙醇提取物，得率為326%，即每克干浸膏相當于307g生藥材。

22 聚酰胺色譜柱分離天藍苜蓿黃酮組分

221 聚酰胺吸附劑的預處理 20～40目篩選聚酰胺吸附劑顆粒1000g，用95%乙醇浸潤及浸泡過夜（≥12h），然后用大量蒸餾水洗去乙醇，裝入玻璃層析柱，用蒸餾水沖洗密集后進行上樣。

222 聚酰胺色譜柱的動態(tài)吸附及解吸 取適量天藍苜蓿乙醇提取物，加蒸餾水溶解成01g/mL天藍苜蓿提取物上樣母液。上樣速度：12mL/min，每收集200mL為1份，取流出液用紫外分光光度計進行掃描，測263nm波長處紫外吸光度值（A）。流出液與上樣母液圖譜相似時即為飽和，停止上樣。相繼用蒸餾水、30%、60%和90%乙醇進行洗脫（洗脫速度：18mL/min，同上，用紫外分光光度計進行掃描，在263、364nm波長處紫外吸光度值（A），洗脫曲線近似平直時為終點。以紫外吸光度值（A）和洗脫液體積，制作吸附曲線與洗脫曲線。

223 不同乙醇濃度天藍苜蓿黃酮組分制備 將222所述方法得到的水洗脫液進行噴霧干燥（風速：25m/s，進樣速度15mL/min），減壓回收30%、60%、90%洗脫液，濃縮至一定體積，冷凍干燥。得水洗脫物、30%、60%、90%乙醇洗脫物，得率分別是55%、787%、762%、1362%（55g、787g、762g、1365g）。

23 天藍苜蓿乙醇提取物黃酮組分含量測定

231 供試品溶液的制備 精密稱取“223”方法中制備的洗脫物各01g，用70%乙醇配置為1mg/mL供試品溶液。

232 對照品溶液的制備 精密稱取減壓干燥至恒重的蘆丁對照品01g置于100mL容量瓶中，加70%乙醇溶液至刻度，超聲溶解，定容。即為1mg/mL蘆丁對照品溶液。

233 標準曲線繪制 將1mg/mL蘆丁標對照品溶液，準確吸取05、10、15、20、25mL分別置于10mL容量瓶中，分別加入2mL 01mol/L三氯化鋁甲醇溶液，加蒸餾水搖勻，定容。以相應溶液為空白，于423nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標對蘆丁濃度作圖，繪制標準曲線，回歸方程：Y=0341X±00327（R2=09994）即在003707～016561mg范圍內(nèi)線性關系良好。

234 精密度實驗 精密吸取蘆丁對照品溶液1mL，置于10mL容量瓶中，按233中方法測定其吸光度，重復測6次，RSD=024%，表明此方法精密度良好。

235 穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液（70%乙醇提取物溶液），按“233”中的方法，分別0、10、20、30、40、50、60min測定吸光度，RSD=043%，表明供試品溶液在60min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

236 重復性實驗 精密稱取6份天藍苜蓿70%乙醇提取物01g，按231項制備供試品溶液然后各精密吸取1mL，分別置于10mL容量瓶中，分別加入2mL 01mol/L三氯化鋁甲醇溶液，加蒸餾水搖勻，定容。按“233”項下方法于423nm處測定其吸光度，計算得RSD=033%，表明此方法重復性良好。

237 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的70%乙醇提取物005g共6份，置于10mL容量瓶中，加入一定量的蘆丁對照品，加70%乙醇溶液至刻度，超聲溶解，定容。按“233”項測定其吸光度，6次測定平均回收率為9705%，RSD為112%。結(jié)果見表1。

238 測定 精密吸取天藍苜蓿70%乙醇提取物、30%、60%、90%乙醇洗脫物，水洗脫物供試品溶液各25mL至10mL容量瓶中，分別加入2mL 01mol/L三氯化鋁甲醇溶液，加蒸餾水定容。在423nm波長處測定吸光值。樣品中的黃酮含量在標準曲線中查出相應值，天藍苜蓿中的黃酮含量以蘆丁對照品相對含量表示。

24 清除DPPH自由基自由基活性的測定方法

241 DPPH標準溶液制備 稱取2mgDPPH自由基放置于50mL棕色容量瓶中，加無水乙醇溶解，定容。即004mg/mL DPPH自由基[5-6]。

242 DPPH自由基測定波長的選擇 取2700μL 004mg/mL DPPH自由基與300μL的DMSO（二甲基亞砜）混合，在紫外分光光度計200～700nm范圍掃描，最終DPPH自由基在520nm處有最大吸收。

243 供試樣品清除自由基活性的測定 精準稱取不同提取物（70%乙醇提取物、水洗脫物、30%、60%、90%乙醇洗脫物）及陽性對照品維生素C（Vc）2mg，用200μL DMSO溶劑溶解后，再加1800μL無水乙醇稀釋，定容，制成了1mg/mL供試樣品溶液。將所有供試樣品溶液和陽性對照品依次稀釋100、050、025、0125、00625、003125、001565mg/mL的溶液。在96孔板每行放置同一樣品不同濃度各100μL，再加100μL DPPH配置溶液。空白組中加100μL乙醇溶液和100μL DPPH配置溶液（避光操作），在37℃避光保溫箱中放置反應05h后于酶標儀520nm處測出紫外吸光值A，以Vc為陽性對照，按公式計算出供式樣品對DPPH自由基的清除率：DPPH清除率（%）=A1-（A2-A3）A1×100%（A1為空白組的吸光度，A2為樣品組的光度，A3為樣品組在未加入DPPH試劑前的吸光度。）用各供試品不同濃度的清除率繪制曲線，通過SPPS190軟件處理得樣品DPPH自由基的清除活性的IC50。

3 結(jié)果

31 聚酰胺色譜柱的動態(tài)吸附及解吸結(jié)果 天藍苜蓿上樣曲線，洗脫曲線如圖1、2所示。由圖1可知，從第3流份開始，流出液與母液峰形狀相似，到第6流份流出液與母液圖譜重合，此時母液上樣體積約為1000mL，上樣達到飽和。圖2為蒸餾水洗脫完畢后，由30%、60%、90%依次進行洗脫時的曲線。30%洗脫后從第2份開始洗脫曲線在364nm有吸收，第15份吸收值最大，組分大部分被洗出，第25份時，吸收值與未洗脫前吸收值相似，即組分30%乙醇部位基本洗脫完全。繼續(xù)用60%乙醇洗脫，第32、第45份時，吸收值最大及60%乙醇部位基本洗脫完全。繼續(xù)用90%乙醇洗脫，第48、第65份時吸收值最大及90%乙醇部位基本洗脫完全。水洗脫液、30%、60%、90%乙醇洗脫液總量分別是5830mL、5000mL、3300mL、5000mL。

32 測定波長的選擇 樣品中黃酮含量的經(jīng)典測定方法有亞硝酸鈉-硝酸鋁，酸水解后二氯氧鋯，三氯化鋁等顯色法。在測定天藍苜蓿中的黃酮組分時，最終以三氯化鋁顯色后進行紫外掃描，與標準品蘆丁在400～430nm處波形相似。在423nm處有最大吸收，故選423nm為最大吸收測定波長。如圖3所示，天藍苜蓿不同濃度乙醇中黃酮組分紫外掃描圖。

33 天藍苜蓿不同濃度乙醇中黃酮含量的測定結(jié)果 由表2可知，100g天藍苜蓿70%乙醇提取物經(jīng)過聚酰胺色譜柱富集分離后，每克30%、60%、90%乙醇洗脫物是70%乙醇提取物中黃酮的314、154、391倍，回收總黃酮907%。

34 供試樣品清除自由基活性的測定結(jié)果 由圖4、表3可知，幾種供試樣品對DPPH自由基的清除活性的IC50大到小的順序為Vc<30%乙醇洗脫物<60%乙醇洗脫物<90%乙醇洗脫物<70%乙醇提取物<水洗脫物。即從聚酰胺色譜柱富集分離的不同天藍苜蓿黃酮組分均具有清除DPPH自由基的能力且效果較好，也可以得出清除DPPH自由基能力為30%乙醇洗脫物>60%乙醇洗脫物>90%乙醇洗脫物>70%乙醇提取物>水洗脫物。

4 討論

實驗由于制備量較大，則應用多功能動態(tài)熱回流提取濃縮機組提取設備，經(jīng)過聚酰胺色譜柱富集分離后，根據(jù)洗脫量和減少有效成分的損失選用冷凍干燥機、真空干燥箱、干燥噴霧器等不同的干燥設備干燥。聚酰胺色譜柱分離天藍苜蓿黃酮組分不僅方法簡單，成本低，效率高，穩(wěn)定性好且容易再生。聚酰胺色譜柱分離天藍苜蓿黃酮組分時，上樣，洗脫時全程有紫外-可見分光光度進行全程監(jiān)測，保證了上樣準確，洗脫完全。天藍苜蓿經(jīng)過聚酰胺分離后，每克30%、60%、90%乙醇洗脫物是70%乙醇提取物黃酮的314、154、319倍。

考察天藍苜蓿黃酮組分顯色檢測方法時，用亞硝酸鈉-硝酸鋁，酸水解后二氯氧鋯等顯色后進行紫外-可見分光光度計于300～900nm處掃描都未能找到與標準品相似的的峰型。最終用三氯化鋁顯色后，樣品與標準品在300～900nm掃描后有相似的峰，且在423nm處有最大吸收，即本實驗選擇三氯化鋁比色法作為天藍苜蓿中黃酮組分含量測定的方法。

清除DPPH自由基實驗表明天藍苜蓿黃酮組分具有一定抗氧化作用，且經(jīng)過聚酰胺色譜柱分離后，清除DPPH自由基的能力增強，且清除能力為30%乙醇洗脫物>60%乙醇洗脫物>90%乙醇洗脫物>70%乙醇提取物>水洗脫物，但都小于陽性對照品Vc。從清除DPPH自由基的活性IC50可得出30%乙醇洗脫物是60%乙醇洗脫物的23倍，90%乙醇洗脫物的28倍，由此可得出天藍苜蓿中的各黃酮組分都具有清除自由基的作用，清除能力與黃酮含量有一定關系但從實驗數(shù)據(jù)得出與黃酮種類的關系更密切。由本實驗得30%乙醇洗脫物清除DPPH自由基能力最強。

參考文獻

[1]《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編（下冊）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1978：103.

[2]劉讓元.苜蓿的藥用價值[J].中國食物與營養(yǎng)， 2010，7：76-78.

[3]王勝超，張國剛，米文珍.紫花苜?；瘜W成分及藥理活性的研究進展[J].沈陽藥科大學學報，2009，26（3）：243-248.

[4]何春年，高微微，徐文燕，等.紫花苜蓿黃酮類化學成分的研究[J].中草藥，2008，39（12）：1783-1785.

[5]趙丹，張秀玲.酸漿宿萼黃酮提取工藝優(yōu)化與自由基清除活性研究[J].食品科技，2013，38（1）：232-236.

[6]莊晶晶，陳衛(wèi)，李亞，等.黑莓黃酮的自由基清除活性與防護肝細胞氧化損傷研究[J].中國食品學報，2015，15（7）：46-53.

（編輯：梁志慶）