桃色頂孢霉粗蛋白對(duì)大豆鐮刀菌菌體電導(dǎo)率及抗氧化酶活性的影響

張雨竹，張明會(huì)，劉景輝，肖亞靜，張新，孫冬梅

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319）

桃色頂孢霉粗蛋白對(duì)大豆鐮刀菌菌體電導(dǎo)率及抗氧化酶活性的影響

張雨竹，張明會(huì)，劉景輝，肖亞靜，張新，孫冬梅

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319）

為了探明桃色頂孢霉粗蛋白對(duì)大豆茄病鐮刀菌的抑菌機(jī)理，測(cè)定了該粗蛋白對(duì)大豆鐮刀菌菌體抗氧化酶活性及電導(dǎo)率的影響。結(jié)果顯示，經(jīng)粗蛋白處理過的菌體中過氧化物酶（POD）、過氧化氫（CAT）酶、超氧化物歧化酶（SOD）0～24 h內(nèi)均為上升狀態(tài)，在24 h時(shí)達(dá)到最高，分別是對(duì)照的1.95倍、2.16倍、1.67倍，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，三種酶活性均下降，在96 h時(shí)降至最低；電導(dǎo)率則呈現(xiàn)先上升后保持平穩(wěn)的趨勢(shì)，當(dāng)處理時(shí)間為24 h時(shí)，電導(dǎo)率變化率達(dá)到最高，為對(duì)照組的2.1倍。上述結(jié)果表明被粗蛋白處理過的菌體膜系統(tǒng)遭到破壞，細(xì)胞膜通透性變大，導(dǎo)致電解質(zhì)大量外滲，并破壞菌體細(xì)胞內(nèi)原有的抗氧化酶動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，對(duì)鐮刀菌造成傷害。

桃色頂孢霉；粗蛋白；抗氧化酶；電導(dǎo)率；大豆鐮刀菌

大豆根腐病是世界性土傳真菌病害之一，廣泛存在于中國(guó)各個(gè)區(qū)域。隨著大豆種植面積，特別是連作面積的擴(kuò)大，大豆根腐病的危害越來越大[1]。該病害在中國(guó)各地都十分嚴(yán)重，其中以東北地區(qū)發(fā)病最重，一般會(huì)造成減產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)60%[2]。大豆根腐病主要發(fā)生在大豆根部，初期莖部或胚根表皮出現(xiàn)淡褐色小斑，后期變紅褐色壞死斑，地下部分根瘤少，地上部分矮小瘦弱，植株葉片由下而上逐漸變黃，病株矮化，嚴(yán)重時(shí)，導(dǎo)致病株死亡[3]。頂孢霉屬于半知菌亞門，絲孢綱，叢梗綱目，淡色菌科，全世界共105種，分布廣泛。對(duì)于頂孢霉殺蟲有一些報(bào)道，樊美珍自林間的青楊天牛幼蟲蟲尸上分離出枝頂孢霉[5]，對(duì)該菌的形態(tài)、生物學(xué)特性和對(duì)青楊天牛毒力進(jìn)行了生物測(cè)定和田間防治試驗(yàn)，引起死亡率為48.72%，但是對(duì)于頂孢霉殺菌方面的研究還未見報(bào)道。實(shí)驗(yàn)室前期工作已經(jīng)證實(shí)桃色頂孢霉粗蛋白對(duì)大豆鐮刀菌菌絲及孢子有較強(qiáng)的抑制作用[2]，為了探討桃色頂孢霉對(duì)大豆鐮刀菌生長(zhǎng)的抑菌機(jī)理，試驗(yàn)測(cè)定了桃色頂孢霉粗蛋白對(duì)該病原菌菌體電導(dǎo)率及抗逆酶活性的影響。在通常情況下，細(xì)胞膜作為分隔細(xì)胞質(zhì)和胞外環(huán)境的屏障，當(dāng)細(xì)胞膜受到外界環(huán)境破壞時(shí)，會(huì)使電解質(zhì)大量外滲，導(dǎo)致電導(dǎo)率升高[6-8]。POD，CAT，SOD酶廣泛存在于動(dòng)植物體中，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中它們的活性不斷發(fā)生變化，隨著細(xì)胞衰老越來越高。這是因?yàn)檫@三種抗氧化酶能使組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，增加木質(zhì)化程度，而且發(fā)現(xiàn)早衰減產(chǎn)的水稻根系中過氧化物酶的活性增加，所以過氧化物酶可作為組織老化的一種生理指標(biāo)[9-10]。而大量報(bào)道顯示，在外界脅迫條件下動(dòng)植物體內(nèi)的保護(hù)酶會(huì)發(fā)生變化[11-13]，但是對(duì)于微生物在此條件下保護(hù)酶的應(yīng)激反應(yīng)卻鮮有報(bào)道。研究旨在通過研究桃色頂孢霉粗蛋白對(duì)病原菌體內(nèi)保護(hù)酶的影響，探討其粗蛋白抑制病原菌生長(zhǎng)的抑菌機(jī)理，為下一步抑菌活性物質(zhì)——粗蛋白的分離純化提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

拮抗菌：桃色頂孢霉（A.percisinum）；病原菌：大豆根腐病茄病鐮刀菌（F.solanae）（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.2 供試培養(yǎng)基

查氏培養(yǎng)基：NaNO32 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 g，蔗糖30 g，蒸餾水1 000 mL；馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PD）：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3 粗蛋白的制備

刮取一環(huán)已經(jīng)活化的桃色頂孢霉接入已滅菌的液體查氏培養(yǎng)基中，28℃120 r·min-1培養(yǎng)8～10 d后，用四層無菌紗布濾掉菌體，用兩層濾紙抽濾掉孢子后，再用0.22 μm的細(xì)菌過濾器除菌后收集濾液4℃保存?zhèn)溆?。? L的無菌濾液用冷凍干燥機(jī)濃縮至1 000 mL，用20%～70%飽和度的硫酸銨過夜沉淀[14]，透析除鹽后用0.05 mol·L-1pH6.0的磷酸緩沖液稀釋為1 000 mL，即為桃色頂孢霉粗蛋白。

1.4 病原菌的處理

用直徑5 mm的打孔器在生長(zhǎng)5 d的鐮刀菌菌落同心圓環(huán)處制取菌碟，用接種針接種到PD中，27℃培養(yǎng)5 d。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將PD平板上培養(yǎng)5 d的直徑為8 cm的茄病鐮刀菌菌片2個(gè)用無菌水沖洗干凈后，分別置于盛有10 mL粗蛋白和不加菌的查氏培養(yǎng)基的燒杯中，分別處理2、4、6、8、10、12、24、48、72、96 h，將兩個(gè)燒杯均放置于4℃條件下，每個(gè)處理4次重復(fù)，以不加菌的查氏培養(yǎng)基為對(duì)照，將測(cè)定燒杯內(nèi)的電導(dǎo)率及菌體抗氧化酶的變化。

1.6 測(cè)定方法

電導(dǎo)率測(cè)定采用梅特勒電導(dǎo)率儀FE30 k。

抗氧化酶活性測(cè)定：

過氧化物酶（POD）活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，以1 min內(nèi)OD470變化0.01為1個(gè)過氧化物酶活性單位（U）[15]；過氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定采用紫外吸收法，以1 min內(nèi)A240減少0．1的酶量為1個(gè)過氧化氫酶活性單位（U）[15]；超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定采用NBT（氮藍(lán)四唑）光化還原法，以抑制NBT光還原50%的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）[15]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件

采用EXCEL2003進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃色頂孢霉粗蛋白對(duì)鐮刀菌菌體電導(dǎo)率的影響

結(jié)果如圖1所示，鐮刀菌菌片經(jīng)桃色頂孢霉粗蛋白處理后，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，電導(dǎo)率前期變化不大，緩慢增加，細(xì)胞通透性變大，當(dāng)處理時(shí)間為24 h時(shí)，電導(dǎo)率變化率達(dá)到最高，為對(duì)照組的2.1倍，處理時(shí)間為72 h時(shí)，電導(dǎo)率值最高，之后電導(dǎo)率基本不變。對(duì)照組電導(dǎo)率緩慢增加，一直保持平緩狀態(tài)，說明查氏培養(yǎng)基對(duì)鐮刀菌的傷害性較小。

2.2 桃色頂孢霉粗蛋白對(duì)鐮刀菌菌體內(nèi)過氧化物酶的影響

從圖2可以看出，實(shí)驗(yàn)組POD酶活性隨著處理時(shí)間先升高后下降，24 h時(shí)達(dá)到最高值，為對(duì)照組的1.95倍，與對(duì)照組差異顯著，當(dāng)處理時(shí)間為96 h時(shí)，POD酶活性降至最低，為對(duì)照組的32.9%，與其他處理時(shí)間活性相比差異較顯著。

圖1 桃色頂孢霉粗蛋白處理時(shí)間對(duì)鐮刀菌菌體電導(dǎo)率的影響Fig.1 Effects of crude protein of extracted from A.percisinum fermentation on conductivity of F.solanae

圖2 桃色頂孢霉粗蛋白處理對(duì)鐮刀菌POD酶活性的影響Fig.2 Effects of crude protein extracted from A.percisinum fermentation on the activity of POD enzymes

2.3 桃色頂孢霉粗蛋白對(duì)鐮刀菌菌體內(nèi)過氧化氫酶的影響

圖3表明，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，CAT酶活性逐漸升高，當(dāng)處理時(shí)間為24 h時(shí)，CAT酶活性達(dá)到最高，為對(duì)照組的2.09倍，與對(duì)照組相比差異顯著，96 h時(shí)降至最低，為對(duì)照組的29.4%，且二者差異顯著。

圖3 桃色頂孢霉粗蛋白處理對(duì)鐮刀菌CAT酶活性的影響Fig.3 Effects of crude protein of extracted from A.percisinum fermentation on the activity of CAT enzymes

2.4 桃色頂孢霉粗蛋白對(duì)鐮刀菌菌體內(nèi)超氧化物歧化酶的影響

結(jié)果如圖4所示，SOD酶的變化趨勢(shì)與POD、CAT酶趨勢(shì)一致，隨著處理時(shí)間的增加，在24 h時(shí)達(dá)到最大值，為對(duì)照的1.67倍，此時(shí)與其他處理時(shí)間相比差異顯著，而后POD酶活性降低，在96 h時(shí)降到最低，為對(duì)照15.04%，說明POD酶對(duì)桃色頂孢酶粗蛋白的處理最敏感。

圖4 桃色頂孢霉粗蛋白處理時(shí)間對(duì)鐮刀菌菌體SOD酶活性的影響Fig.4 Effects of crude protein extracted from A.percisinum fermentation on the activity of SOD enzymes

3 結(jié)論與討論

細(xì)胞膜作為分隔細(xì)胞質(zhì)與胞外環(huán)境的屏障，同時(shí)也作為細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行交換的通道，當(dāng)細(xì)胞受到外界環(huán)境逆境傷害時(shí)，細(xì)胞內(nèi)容物會(huì)大量外滲，導(dǎo)致電導(dǎo)率激增，所以電導(dǎo)率作為一個(gè)衡量細(xì)胞受傷程度的生理指標(biāo)是合理的[16-17]。研究表明經(jīng)桃色頂孢霉粗蛋白處理過的鐮刀菌燒杯內(nèi)電導(dǎo)率在24h時(shí)增長(zhǎng)率最高，而后平緩上升，最后基本保持不變，而對(duì)照組緩慢上升，此現(xiàn)象說明桃色頂孢霉粗蛋白對(duì)鐮刀菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)具有破壞功能，導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，隨之電解質(zhì)滲漏嚴(yán)重。

POD、CAT、SOD與植物抗逆性密切相關(guān)[18-21]。POD是一種廣泛存在于真核生物各類細(xì)胞中的重要的活性較高的酶類，在植物體內(nèi)也大量存在，也和光合作用、呼吸作用相關(guān)，它會(huì)隨著植物生長(zhǎng)不斷變化。一般老化細(xì)胞中POD酶含量高，幼嫩細(xì)胞中含量低，所以可將POD酶活性看作衡量細(xì)胞老化程度的生理指標(biāo)。CAT普遍存在于能呼吸的生物體內(nèi)，是一種酶類清潔劑，它可以促使H2O2分解為O2和H2O，清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。SOD酶在生物界內(nèi)的分布極廣，從動(dòng)物到植物，從人到單細(xì)胞幾乎都有它的存在，是一種具有特殊活性，可以清除自由基的新型酶類?，F(xiàn)在已經(jīng)有研究表明SOD酶可對(duì)抗與阻斷因氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害，減緩細(xì)胞衰亡，及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞。正常情況下細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT和POD 3種保護(hù)酶協(xié)調(diào)一致處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)使自由基維持在一個(gè)低水平，從而防止自由基毒害，一旦自由基這種平衡受到破壞就可能產(chǎn)生傷害作用[22-24]。研究表明：經(jīng)桃色頂孢霉粗蛋白處理過的鐮刀菌菌體內(nèi)三種酶變化趨勢(shì)相近，均為先升高后下降，在24 h三種酶活性達(dá)到最高，與對(duì)照組相比差異顯著；結(jié)合電導(dǎo)率測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電導(dǎo)率變化率也在24 h時(shí)，變化最大，而后期電導(dǎo)率基本不變，這可能與內(nèi)容物大量滲出有關(guān)。而酶活性也表現(xiàn)出24 h后下降趨勢(shì)，且在96 h時(shí)降至最低。但對(duì)照中菌體內(nèi)容物滲出量比較一致，而酶活性出現(xiàn)升高趨勢(shì)，具體原因有待進(jìn)一步研究。綜上所述，桃色頂孢霉粗蛋白破壞了鐮刀菌菌體內(nèi)原有的保護(hù)酶系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致氧自由基清除系統(tǒng)出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致電解質(zhì)大量外滲，菌體電導(dǎo)率先升高后保持不變，這可能是桃色頂孢霉粗蛋白抑制鐮刀菌生長(zhǎng)的機(jī)理之一，是否存在其他機(jī)理還有待研究。

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Effects of Crude Protein Extracted from Acremonium percisinum Fermentation on the Activity of Antioxidan Enzymes and Content of Conductivity Ratio of Fusarium solanae

Zhang Yuzhu，Zhang Minghui，Liu Jinghui，Xiao Yajing，Zhang Xin，Sun Dongmei
（Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

In order to explore inhibiting mechanism of the crude protein extracted from Acremonium percisinum fermentation，the influences of the crude protein on the activity of antioxidan enzymes and content of conductivity ratio were discussed.The results showed：the activity of POD，CAT and SOD in mycelium all increased after treated with crude protein from 0 to 24 h.The three antioxidan enzymes all reached to the maximum value at 24 hours，which was 1.95，2.16 and 1.67 times than that of the control，respectively.As the time extended，the three antioxidan enzymes all decreased，and the minimal values occurred at 96 hours.The conductivity of the mycelium showed the tendency increased at first and then was stable.The change ratio of conductivity reached the highest after treated by crude protein for 24 h and the value was 2.1 times than that of the control.Above all，these results indicated the destroy of mycelium membrane system，the larger of membrane permeability and the leakage of electrolyte.So the balance of antioxidan enzymes system was destroyed，and then mycelium was dead.

Acremonium percisinum；crude protein；antioxidan enzymes；conductivity；Fusarium solanae

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.05.014

S476.+9

A

1002-2090（2016）05-0073-04

2015-12-22

黑龍江省研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（YJSCX2015-Y61）。

張雨竹（1990-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2013級(jí)碩士研究生。

孫冬梅，女，教授，E-mail：7981004@qq.com。